Лікарській засіб для лікування або профілактики запалення та спосіб лікування або профілактики запалення (варіанти)

1 Применение линейного или циклического пептида общей формулы D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr ю Asn-Tyr-Thr-NH2 или его производного, или его соли в качестве лекарственного средства для лечения или профилактики воспаления 2 Применение по п 1, отличающееся тем, что по крайней мере одна из гидроксильных групп на Ser, Thr или Туг остатках находится в виде сложноэфирной группы или простого эфира 3 Применение по п 1 или 2, отличающееся тем, что по крайней мере одна из аминокислот представляет собой замещенную N-алкиламинокислоту 4 Применение по любому из пунктов 1-3, отличающееся тем, что, по крайней мере, одна из аминокислот замещена мономерным или полимерным углеводом или его производным, причем такое замещение(я) осуществляют через гидроксильную и/или амино- и/или амидогруппы аминокислот 5 Применение по любому из пунктов 1-4, отличающееся тем, что воспаление ассоциировано с рассеянным склерозом, миелопатией, синдромом хронической усталости, хронической иммунной активацией, заболеваниями кишечника, синдромом токсического шока, такого как индуцированный инфекцией Staphylococcus aureus, артритом любой этиологии, реакцией хозяин против трансплантата и/или реакцией трансплантат против хозяина, или вызвано инфекцией, карциномой, агентом, или лечением, повреждающим иммунную систему, или является аутоиммунным 6 Применение по п 5, отличающееся тем, что воспаление ассоциировано с рассеянным склерозом или миелопатией 7 Применение по п 5 или 6, отличающееся тем, что воспаление ассоциировано с рассеянным склерозом 8 Применение по п 5 или 6, отличающееся тем, что миелопатия является HTLV-I миелопатией 9 Применение по п 5, отличающееся тем, что воспаление вызвано инфекцией 10 Применение по п 5, отличающееся тем, что воспаление является аутоиммунным 11 Применение по п 5, отличающееся тем, что воспаление вызвано агентом, повреждающим иммунную систему, таким как цитотоксическое лекарство, например, циклоспорин А или лечением, О 00 00 41881 повреждающим иммунную систему, например, радиотерапия опухоли 12 Применение по п 5, отличающееся тем, что воспаление ассоциировано с хронической иммунной активацией 13 Применение по п 5, отличающееся тем, что воспаление ассоциировано с синдромом хронической усталости 14 Применение по п 5, отличающееся тем, что воспаление ассоциировано с артритом любой этиологии 15 Применение по п 5, отличающееся тем, что воспаление ассоциировано с реакцией хозяин против трансплантата и/или реакцией трансплантат против хозяина у пациентов, которым была произведена трансплантация 16 Способ лечения или профилактики воспаления, отличающийся тем, что субъекту назначают эффективное количество пептида, охарактеризованного в пп 1-4 17 Способ по п 16, отличающийся тем, что эффективное количество пептида в день составляет 0,05-10000 мг 18 Способ по п 17, отличающийся тем, что эффективное количество пептида в день составляет 0,5-1000 мг 19 Способ по п 18, отличающийся тем, что эффективное количество пептида в день составляет 5-100 мг 20 Способ по любому из пп 16-19, отличающийся тем, что пептид назначают в виде фармацевтической композиции в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем 21 Способ по п 20, отличающийся тем, что фармацевтически приемлемый носитель выбирают из группы носителей, которые адаптируют композицию для интраназального, перорального, буккального, парентерального, местного или ректального, или ингаляционного назначений 22 Способ по любому из пп 20-21, отличающийся тем, что носитель обеспечивает нахождение пептида в растворе, суспензии, эмульсии или геле 23 Способ по любому из пп 20-22, отличающийся тем, что пептид находится в лиофилизированной форме 24 Способ по любому из пп 20-23, отличающийся тем, что композиция включает структурирую щий агент, который является суспендирующим агентом и/или стабилизирующим агентом, и/или диспергирующим агентом 25 Способ лечения или профилактики воспаления, отличающийся тем, что субъекту назначают эффективное количество пептида, охарактеризованного в пп 1-4, причем воспаление ассоциировано с рассеянным склерозом, миелопатией, синдромом хронической усталости, хронической иммунной активацией, заболеваниями кишечника, синдромом токсического шока, такого как индуцированный инфекцией Staphylococcus aureus, артритом любой этиологии, реакцией хозяин против трансплантата и/или реакцией трансплантат против хозяина, или вызвано инфекцией, карциномой, агентом, или лечением, повреждающим иммунную систему, или является аутоиммунным 26 Способ по п 25, отличающийся тем, что эффективное количество пептида в день составляет 0,05-10000 мг 27 Способ по п 26, отличающийся тем, что эффективное количество пептида в день составляет 0,5-1000 мг 28 Способ по п 27, отличающийся тем, что эффективное количество пептида в день составляет 5-100 мг 29 Способ по любому из пп 25-28, отличающийся тем, что пептид назначают в виде фармацевтической композиции в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем 30 Способ по п 29, отличающийся тем, что фармацевтически приемлемый носитель выбирают из группы носителей, которые адаптируют композицию для интраназального, перорального, буккального, парентерального, местного или ректального, или ингаляционного назначений 31 Способ по любому из пп 29-30, отличающийся тем, что носитель обеспечивает нахождение пептида в растворе, суспензии, эмульсии или геле 32 Способ по любому из пп 29-31, отличающийся тем, что пептид находится в лиофилизированной форме 33 Способ по любому из пп 29-32, отличающийся тем, что композиция включает структурирующий агент, который является суспендирующим агентом и/или стабилизирующим агентом, и/или диспергирующим агентом В широком смысле настоящее изобретение относится к лечению или профилактике воспаления, вызванного бактериями, вирусами и/или другими инфекционными агентами, условно-патогенными микроорганизмами (инфекции, которые могут быть результатом иммунодепрессивного состояния, например, вызванного раковым заболеванием или лечением, в особенности, лечением цитотоксическим лекарством или радиотерапией), аутоиммунной реакцией или другим образом Отдельные варианты изобретения касаются профилактики или лечения нейродегенеративных или демиелинизационных заболеваний, таких как миелопатия, вызванная HTLV-I (НАМ), рассеянный ск лероз (MS) и симптомов или заболеваний человека, вызванных хроническим иммунным возбуждением Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, полезным при таком лечении и/или профилактике, и к самим определенным активным пептидам Иллюстрацией заболевания, включающего воспаления, является септический шок Многие клинические признаки грамотрицательного септического шока можно воспроизвести у животных путем введения липополисахаридов (LPS) Введение животным LPS может вызвать тяжелые метаболические и физиологические изменения, которые могут привести к смерти С введением LPS 41881 связано обширное производство альфа-фактора некроза опухолей (tumor necrosis factor alpha-TNFa) У мышей, получивших инъекцию рекомбинантного человеческого TNF развивается полиэрекция волос (ундуляция), понос и отталкивающая и неопрятная внешность, сопровождающиеся смертью при получении достаточного количества У крыс, обработанных TNF снижается давление, учащается дыхание, и они погибают от внезапной остановки дыхания (Тгасеу и др , 1986, Science 234, 470) Наблюдается также тяжелый ацидоз, заметная гемоконцентрация (haemoconcentration) и бифазные изменения в концентрации глюкозы крови Гистопатология таких крыс обнаруживает лейкоз в легких, геморрагический некроз в надпочечниках, поджелудочной железе и других органах и тубулярный некроз почек Все эти изменения предотвращают, предварительно вводя животным нейтрализующие моноклональные антитела против TNF Значительная аккумуляция нейрофилов в легких животных, обработанных TNF, отражает TNF активацию нейрофилов, TNF вызывает дегрануляцию нейрофилов, респираторный импульс наряду с увеличением бактерицидной и противоопухолевой активности нейрофилов (Klebanoff и др , 1986, J Immunol , 136, 4220, Tsujimoto и др , 1986, Biochem Biophys Res Commun 1_37, 1094) Важной мишенью для проявления TNF токсичности являются также эндотелиальные клетки TNF снижает антикоагулирующий потенциал эндотелия, стимулируя прокоагулянтную активность и регулируя экспрессию тромбомодулина по типу обратной связи (Stern и Nawroth, 1986, Exp Med 163, 740) TNF является продуктом активированных макрофагов и производится в ответ на инфицирование и развитие злокачественного заболевания Впервые он был обнаружен у мышей, обработанных LPS, как сывороточный фактор, вызывающий геморрагический некроз трансплантированных опухолей у крыс и являющийся цитотоксическим для клеток опухолей в культуре (Carswell и др , 1975 PNAS 72, 3666, Helson и др , 1975, Nature 258, 731) Кахексия, характерный признак хронического воздействия для TNF, является общим симптомом развития злокачественного заболевания и тяжелой инфекционной болезни Она характеризуется аномальным липидным метаболизмом с гипертриглицериданемией (hyper triglycendaemia), аномальным метаболизмом белков и глюкозы и истощением Продолжительное введение TNF и IL-I мышам, крысам и/или людям вызывает анорексию, потерю веса и липидное и белковое истощение тела в течение 7-10 дней (Cerami и др , 1985, Immunol Lett Д, 173, Fong и др , 1989, J Exp Med Г70, 1627, Moldawer и др , Am J Physiol, 254, G450-G456, 1988, Fong и др , Am J Physiol 256, R659-R665 (1989), McCarthy и др, Am J Clm Nutr 42, 1179-1182, 1982 У пациентов с раковыми и хроническими заболеваниями, связанными с кахексией, измеряли уровень TNF Результаты неубедительны, так как получены большие различия в уровнях TNF Это можно объяснить коротким временем полураспада TNF (6 минут), различиями в связывающих белках TNF сыворотки или действительными различиями уровней TNF хронических заболеваний TNF-a и IL-I с их общими функциональными активностями, такими как пирогенность, сонливость и действием в качестве медиаторов воспалений, вовлечены в патологию других заболеваний, связанных с хроническим воспалением, кроме токсического шока и кахексии при раковых заболеваниях TNF обнаруживают в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным и реактивным артритом и в сыворотке пациентов с ревматоидным артритом (Saxne и др, 1988, Arthnt Rhemat 3J_, 1041) Повышенный уровень TNF детектируют у пациентов с трансплантированной почкой в случаях острого отторжения (Maury и Терро1987, J Exp Med 166,1132) Показано, что у животных TNF включен в патогенез заболеваний типа трансплантат - против-хозяина на коже и кишечнике после аллогенной трансплантации костного мозга Показано, что введение противокрысиных TNF антител кролику (anti - munne TNF antibody) предотвращает гистологические изменения, связанные с заболеваниями при трансплантации органов организму-хозяина, и снижает смертность (Riquet и др 1987, J Exp Med 166,1220) Показано также, что TNF вносит значительный вклад в патологию малярии (Clark и др, 1987, Am J Pathol 129, 192-199) Кроме того, приводят повышенные значения уровня TNF сыворотки у пациентов, страдающих малярией (Scuden и др , 1986, Lancet 2, 1364-1365) Многие специалисты обычно считают рассеянный склероз (MS) хроническим воспалительным заболеванием И MS, и связанная с HTLV-I миелопатия (НАМ) действуют на центральную и периферическую нервные системы, с клинической точки зрения обе болезни можно представить как миелопатию, действующую на спинные нервы и спинные миелинизированные нервные волокна (Spinal myelmated nerve fibres) Рассеянный склероз (MS) является хроническим демиелинизирующим заболеванием центральной нервной системы и является наиболее общим хроническим неврологическим заболеванием молодых людей Заболеваемость MS и особенности его распространения не изменялись в течение десятилетий Заболевание остается в основном неизлечимым MS всегда считали заболеванием средней полосы, он имеет широкое распространение в северных Соединенных Штатах, Канаде и Европе 1 1000 Заболеваемость у пациентов разного пола составляет 1,5 1 (женщины мужчины) Обычно MS действует на многие области белого вещества в центральной нервной системе (CNS), наиболее часто на перивентрикулярное белое вещество, ствол головного мозга, спинной мозг и глазные нервы Первичный процесс разрушает миелиновые оболочки и в конечном счете убивает олигодендроциты, образуя характеристические бляшки MS Раннее развитие бляшек характеризуется развитием периваскулярного воспаления с последующей миграцией лимфоцитов, клеток плазмы и макрофагов в очаг поражения За этим следует глиоз астроцитов и попытки ремиелинизации олигодендроцитами Бляшку окружают лимфоциты 41881 Хотя этиология MS до сих пор неизвестна, в фокусе исследований, ведущих к правдоподобным гипотезам, находятся работы по изучению иммунной дисрегуляции, включая аутоиммунную реакцию и генетическое предрасположение, которые могут играть роль в действительном развитии болезни У пациентов с острой формой заболевания обнаружены множественные репродуцированные иммунологические нарушения Синтез иммуноглобулинов, будучи нормальным на периферии, увеличен в центральной нервной системе, и продуцированные антитела имеют характеристическую связанную структуру Антигенная специфичность таких антител не известна, и не ясно, играют ли они роль в прогрессировании заболевания Известны различные стресс-факторы, активирующие иммунную систему, такие как вирусная инфекция, или обострение MS может быть вызвано хирургической операцией Аналогичные эффекты производит прием других активаторов, таких как у-интерферон Кроме того, например, иммуносупрессивная противовоспалительная терапия кортикостероидами может давать умеренную ремиссию или, по крайней мере, временное облегчение на короткий период времени, хотя такое лечение является спорным Продемонстирована реактивность лимфоцитов против нейронных антигенов, миелинового основного белка (myelm basic protein) и протеолипида Эта активность должна давать основудля аутоиммунной реакции против нейронной ткани, хотя это и не доказано Открытие нейротропной способности HTLV-I у пациентов с Мартиники с тропическим спастическим парапарезом (TSP) и у пациентов из Японии с хронической миелопатией представляет HTLV-I в качестве общего этиологического агента таких заболеваний Позже было показано, что неврологические проявления HTLV-I инфекции одинаковы, несмотря на различные географические регионы, в которых они описаны Неврологические признаки этой хронической ретровирусной инфекции, включая слабо прогрессирующий спастический парапарез со спастическим мочевым пузырем и минимальным сенсорным дефицитом получают в результате поражения пирамидальных трактов двусторонним и симметричным образом преимущественно на грудном уровне спинного мозга Показано, что периферическая нервная система включена, давая в результате снижение скорости проводимости нервов нижних конечностей Общие проявления HTLV-I у пациентов с HTLV-I миелопатией описаны и включают воспалительное поражение легких, кожи, глаз и поперечно-полосатой мышцы, дающее миозит Кроме того, пациенты испытывают глубокую усталость, подобно ситуации с MS Клинические проявления заболевания очень похожи на MS, и его часто путают с последним Возможны, по крайней мере, четыре патогенных механизма, когда HTLV-I может включать CNS, производя НАМ Они могут включать слабое вирусное инфицирование, иммунную реакцию через промежуточные клетки (cell-mediated immune response) и преимущественно гуморальный имму но-опосредованный механизм (humoral immune mediated mechanism) и развитие аутоиммунных явлений Слабо прогрессирующее течение болезни подтверждает гипотезу слабого вирусного инфицирования Обнаружение периваскулярного скопления лейкоцитов вокруг кровеносных сосудов в препаратах, приготовленных после летального исхода, наряду с временно благоприятной реакцией на стероиды, подтверждает гипотезу, что воспалительная иммунная реакция, возможный результат вирусной инфекции, ответственна за развитие НАМ Эти два заболевания имеют много сходства и различий, как клинических, так и неврологических Обе болезни являются формами демиелинирующих заболеваний, при которых миелиновая оболочка нервной системы разрушается через один или много механизмов, общих для двух заболеваний, а также специфический механизм для каждого заболевания MS является многопрофильным заболеванием, при котором возможно заболевание центральной нервной системы, которое может включать миелопатию HTLV-I миелопатия наоборот является преимущественно миелопатией, которая может изредка оказывать влияние на центральную нервную систему MS, кроме того, может действовать на периферическую нервную систему способом, общим с HTLV-I Как уже упоминалось, миелопатия, будучи заболеванием спинного мозга, может иметь много различных этиологии MS и НАМ Различные формы миелопатии, большинство из которых осуществляются через воспаление, включают следующие нейросифилис, недостаточность В12 или фолатов, саркоидоз, поперечный миелит, арахноидит, цервикальный спондилит, заболевание двигательного нейрона, нейрофиброматоз, сжатие спинного мозга от опухоли, диска или артрита, люпозный эритематоз спинного мозга и вирусный энцефаломиелит Хроническое воспаление, чаще известное как хроническое активирование или возбуждение иммунной системы, происходит в ответ на устойчивый антиген, происхождение которого может быть экзогенным или эндогенным или может быть результатом аутоиммунного состояния В результате таких хронических воспалений происходит локальное разрушение тканей, и в зависимости от типа воспаления может наблюдаться воздействие на весь организм вследствие производства медиаторов воспаления Такие медиаторы воспаления включают цитокины, растворимые медиаторы, продуцируемые активированными лимфоцитами и макрофагами, и действуют на взаимодействие клеток и физиологическую реакцию Хроническое иммунное возбуждение может происходить в результате инфекционных заболеваний, таких как синдром хронического утомления или синдром токсического шока, или через аутоиммунные механизмы, дающие в результате такие симптомы как ревматоидный артрит, воспалительные заболевания кишечника и варианты, связанные с взаимодействием трансплантат против организма-хозяина Иммунную реакцию на антиген можно разделить на четыре перекрывающиеся фазы инициирование (представление антигена), увеличение 41881 (активация клеток), эффектор и регуляция (Roitt и др "Immunology", Gower Medical Publ London, EK, 1989, "Basic and Clinical Immunology, Stites и др , Eds, Appletonand Lange, Norwalk CT, 1991) Коротко говоря, происходит фагоцитоз антигена клетками, представляющими антиген (АРС), которые должны выражать главную гистосовместимость (МНС) молекул класса II (Class II molecules) на своей поверхности В этом отношении клетки линии макрофаг/моноцит (CD4 положительный) и клетки В (CD4 отрицательный) могут действовать как АРС После фагоцитоза антиген обрабатывается внутри цитоплазмы и выделяется на поверхность антигенных фрагментов в ассоциации с молекулами MHC-II Комбинация антиген/МНС-П включает активацию Т-клеток-помощников (CD4 положительный) антиген-специфическим образом и заставляет их принимать второй антиген-неспецифический сигнал активации Затем активированные Т-клетки-помощники вызывают активацию Т-клеток-эффекторов (цитотоксические лимфоциты, CD4 отрицательный) и В-клеток, продуцирующих антитела Клетки-эффекторы и молекулы способствуют выделению антигена через разнообразные механизмы, антиген-специфические и неспецифические, в результате чего может происходить повреждение тканей организма-носителя, если эффекторные механизмы выражаются неблагоприятным образом при отложении антигена или иммунных комплексов на тканях организма-носителя, реагируя на аутоантигены, или в результате пролонгированной (хронической) иммунной реакции Регуляция иммунной реакции посредством удаления антигена, эффективное подавление или идиотипическая регуляция ограничивает нормальную иммунную реакцию до одной-трех недель Синдром хронического утомления (CFS) или синдром иммунной дисфункции хронического утомления (chronic fatigue immune dysfunction syndrome) (De Fntas и др , Proc Natl Acad Sci 88, 2922-2926 (1991)) является условием неизвестной этиологии, характеризующейся отличным набором симптомов и признаков, которые включают сильную утомляемость, недомогание после физической нагрузки, головные боли, потливость ночью, миалгию, атаксию, субфебрильную температуру и лимфаденопатию (CDWP 1-3 Joncas JH, Приветствие и Введение в Proceedings of a Workshop Chronic Fatigue Syndrome, Can Dis Weekly Report vol 17SI E, January 1991, 1-3) Хотя происхождение CFS неизвестно, его симгтгомы совпадают с избыточным продуцированием цитокинов (Landay и др , Lancet 338, 707-712 (1991)) Симптомы, подобные CFS, наблюдали после терапевтического применения интерферонов (IFN) (Lloyd и др , Med J Aust, 151, 122-124 (1989), Lever и др , Lancet 2, 101 (1988), Mowbray и др , Br Med Bull 47, 886-894 (1991)) и интерлейкина-2 (IL-2) (Cheney и др , Annal Inter Med 110, 321 (1989)) В испытаниях IFN-a на пациентах с CFS лекарство обостряет симгтгомы, способствуя патогенезу через цитокины (Me Bride и др , Вг Med Bull 47,895-907(1991)) Показано, что сыворотка и цереброспинальная жидкость пациентов с CFS содержит повышенный уровень IL-2, IFN и IL-I (Wallace и др , Arth Rheum 32, 1334-1335 (1989), Shepperd The Practitioner 233, 41-46 (1989)) так же, как и IL-6 (Chao и др , J Infect Dis 162, 1412 (1990)) Кроме того, неогтгерин (neopterm), маркер активации макрофага (Chao и др J Infect Dis 162, 1412 (1990)), и IFN-ассоциированный фермент 2'-5'-олигоаденилатсинтетаза (Khmas и др , J Clm Microbiol 28, 1403-1410 (1990)) оба увеличены в CFS, как и другие маркеры активации макрофагов, такие как ICAM-I и LFA-I (Gupta и др, Scand J Immunol 33,319-327(1991)) Ассоциированная с CFS энергия на тестовые антигены кожи (Johnson и др , FASEB J 5, 2706-2712 (1991), ослабление реакции лимфоцитов на митогены (Khmas и др, J Clm Microbiol 28, 1403-1410 (1990)) и растворимые антигены (Gupta и др, Scand J Immunol 33, 319-327 (1991)) совпадают с дисфункцией макрофагов (Pneto и др , Scand J Immunol 30, 13-20 (1989)) и могут быть объяснены аутокринным истощением иммунокомпетентных клеток при хроническом возбуждении, в результате которого происходит иммунодисрегуляция (CDWR 1-3 Joncas JH, Приветствие и Введение в Proceedings of a Workshop Chronic Fatigue Syndrome, Can Dis Weekly Report vol 17SIE, January 1991, 49-50) CFS и синдром приобретенного иммунодефицита (AIDS, см ниже) имеют много общих симптомов (Miller и др , Neurology 41_, 1603-1607 (1991)) и лабораторных показателей (Gupta и др , Scand J Immunol 33, 319-327 (1991)), и одно исследование демонстрирует связь инфекции с ретровирусом HTLV-II, имеющим отношение к HIV, и CFS (Gupta и др, Scand J Immunol 33, 319-327 (1991)) Для CFS не существует общепринятого способа лечения лекарствами Существуют анекдотические сообщения о благотворном действии амантидина, ингибиторов моноаминоксидазы (те фенелзина - phenelzme), жирнокислотных добавок (Me Bride и др , Br Med Bull 47, 895-907 (1991)) и окситригтгофана (Caruso и др , J Int Med Res 1_8, 201-209 (1991)), среди прочего, но контрольные проверки не показали эффективности этих препаратов Энтеротоксин Staphylococcus aureus, токсинI синдрома токсического шока (TSST-I) вызывает синдром токсического шока (TSS) TSST-I принадлежит семейству стафилококковых энтеротоксинов, митогенных для Т-клеток, экспрессирующих специфические Vp гены (Kappler и др , Science 244, 811-813 (1989)) В результате своей неспецифической митогенности стафилококковые энтеротоксины могут вызывать пролиферацию до 20% Тклеток и называются "суперантигенами" (Johnson и др , Sci Am 266, 92-101 (1992)) Необходимо, чтобы макрофаги предоставляли TSST-I Т-клеткам (Pomdexter и др, J Infect Die 151, 65-72 (1985)), однако, как и другие стафилококковые энтеротоксины, TSST-I не требует обработки антигенами для активации Т-клеток (Pontzer и др, Proc Natl Acad 88,125-128(1991)) Нативная молекула присоединяется с внешней стороны антигена, связывая полость молекул МНС класса II с неполиморфным участком р-цепи (Fraser Nature 339, 221-223 (1989)), Johnson и др , FASEB J 5, 2706-2712(1991)) Симптомы TSS (такие как лихорадка, сыпь, гипотензия, тошнота, рвота и понос) совпадают с 41881 Терапия TSS включает немедленное замещение потерянной жидкости для противодействия гиповолемии Если пациент не реагирует на антистафилококковые антибиотики, тогда может понадобиться терапия стероидами (те метилпреднизоном) при тяжелом шоке (Todd, Drugs, 39, 856861 (1990)) Ревматоидный артрит (Marrow и др, "Autoimmune Rheumatic Disease", Blackwell Scientific Publ , Oxford, UK, m 4, cc 148-207 (1987)) является заболеванием, характеризующимся хроническим воспалением и эрозией суставов, которое может поражать до 3% населения, включая детей Симптомы ревматоидного артрита включают утреннюю тугоподвижность суставов, припухлость и боли при движении по крайней мере одного сустава и опухание суставов Неспецифические симптомы, включая летаргию, анорексию и слабость, наряду с лихорадкой и лимфаденопатией (характеристикой иммуного возбуждения), могут предшествовать заболевания суставов Внесуставные проявления ревматоидного артрита включают васкулит, катаракты, увеит, интерстициальный фиброз, перикардит и миокардит, периферическую невропатию, миелоидные отложения, хроническую анемию и подкожные и легочные узелки шают IL-I, IL-6 (Starter Immunol Res 10, 465-471 (1991), Fiocchi, Immunol Res 10, 239-246 (1991) и TNF-a (Mac Dermott, Mt Sinai J Med 57, 273-278 (1990)) у IBD-пациентов Лекарства, используемые для лечения IBD, включают противовоспалительные агенты, такие как сульфазалазин (5-ASA), кортикостероиды, циклоспорин А и азатиоприн (Hanauer, Scand J Gastroenterol 25 (Suppl 175) 97-106 (1990), Peppercorn, Annal Intern Med Ц 2 , 50-60 (1990)) Экспериментально для успешного лечения неспецифического язвенного колита применяли анти-СО4 моноклональные антитела (Emmnch и др, Lancet 338, 570-571 (1991)) Тогда как организм-хозяин может реагировать против генетически несовместимого трансплантата, давая ответную реакцию хозяин-противтрансплантата, иммунокомпетентный трансплантат (такой как костный мозг или ткань кишечника) может давать реакцию против организма-хозяина, давая в результате заболевание трансплантатпротив-хозяина Эти реакции являются промежуточными как аллогенных реакциях, направленных против инородных МНС молекул, и in vitro подражанием им является смешанная реакция лимфоцитов (MLR) Взаимодействия трансплантат/организм-хозяин дают хроническое воспаление вокруг пересаженной ткани при увеличении маркеров иммунного возбуждения, таких как наблюдают при СПИД (Grant, Immunol Today 12, 171-172 (1991)) Общепринятое лечение взаимодействий трансплантат/организм-хозяин включает обработку азатиоприном, циклоспорином А или метилпреднизоном, а по последним данным - рапамицином (rapamycm) (Stepkowski и др Transplantation 53, 258-264 (1992), Huber и др Bibhotheca Cardiologica 43, 103-110 (1988)) Для ингибирования реакции трансплантат/организм-хозяин экспериментально применяли моноклональные антитела, специфические для CD3 (Wissmg и др , Chn Exp Immunol 83 333-337 (1991)) и CD4 (Remke и др , Lancet 338, 702-703(1991)) С развитием ревматоидного артрита связывают генетические факторы и инфекционные агенты, включая бактерии, грибки, микоплазмы и вирусы Легкий ревматоидный артрит можно лечить нестероидными противовоспалительными лекарствами, в то время как тяжелые случаи требуют системного применения кортикостероидов, анти-метаболитов или цитотоксических агентов Экспериментально использовали для лечения ревматоидного артрита анти-СО4 моноклональные антитела (Horneff и др , Cytokme 3, 266-267 (1991), Horneff и др, Arth Rheum 34, 129-140 (1991) и Shoenfeld и др , Chn Exp Rheum 9, 663673 (1991)) Воспалительное заболевание кишечника (IBD) является хроническим воспалительным симптомом, одним из симптомов аутоиммунного заболевания (Snook Gut 31_, 961-963 (1990)) Воспаление и повреждение ткани включает восстановление и активацию нейрофилов, макрофагов и лимфоцитов (Mac Dermott и др , Adv Immunol 42, 285-328 (1988)), которые генерируют цитокины и провоспалительные молекулы, такие как простагландины и лейкотриены (Mac Dermott, Mt Sinai J Med 57, 273-278 (1990)) В результате хронической активации иммунокомпентентных клеток повы Настоящее изобретение касается идентификации группы пептидов, которые облегчают воспалительную реакцию при многих заболеваниях Эти заболевания включают аутоиммунные заболевания, трансплантацию органов, неоплазию, вирусные, бактериальные, грибковые и другие инфекции и, в частности, некоторые заболевания, при которых инфекция может проявляться условно-патогенным образом, например, при терапии цитотоксинами или радиационной терапии или в ситуации при иммунодепрессивном состоянии Нет необходимости, чтобы пептиды, полезные в настоящем изобретении, напрямую препятствовали патогенным механизмам компонентов, вызывающих заболевание Как будет описано ниже в экспериментальных данных, механизм, при котором эти пептиды могут облегчать симгтгомы таких заболеваний, зависит от их способности модулировать производство и действие цитокинов, продуцированных активированными клетками иммунной системы Модулирование цитокинов не может иметь ограничений для TNF, но может быть действенным для целого ряда интерлейкинов, например, от интерлейкина-1, до интерлейкина10 Представленные данные не являются в нас перевозбуждением иммунной системы (Johnson и др, Sci Am 266, 92-101 (1992)) и избыточным продуцированием цитокинов (Ikejima и др , J Chn Invest 73, 1312-1320 (1984), Micussan и др , Immunology 58, 203-208 (1986)) Эти симптомы воспроизводят на моделях животных путем введения фактора некроза опухолей (TNF) (Miethke и др , J Exp Med 175,91-98(1992)) Массивное иммунное возбуждение такого рода может вести к истощению иммунокомпетентных клеток и может объяснить подавление иммунитета, связанное с энтеротоксиновым шоком (Langford и др , Infect, Immun 22, 62-68 (1978)) и энергией Т-клеток, индуцированных энтеротоксином in vitro (О' Hehir и др , Immunol Lett 30,165-170(1991)) 41881 тоящее время прямым доказательством, но мощной косвенной моделью Таким образом, модель использует одно из наиболее сильных из известных воспалительных соединений, LPS, которое присоединяется к рецепторам на нейтрофилах, моноцитах и макрофагах, в результате эти клетки становятся активированными и начинают продуцировать IL-I и TNF среди прочих цитокинов, начиная, таким образом, воспалительный каскад Параметром, используемым для измерения этого эффекта LPS, является концентрация глюкозы в крови, которая обычно уменьшается под действием TNF или LPS Из сведений, известных из литературы о механизме пептида Т на клеточном уровне, очень удивительным является то, что пептид Т и его аналоги способны значительно уменьшать отрицательное действие LPS Обычно LPS комбинируется с LPS-связывающим протеином (LBP) и усиливает свое действие через CD14 рецептор В современной литературе пептиды, полезные в настоящем изобретении, связывают только с CD4 рецептором, который, как считают, не включен в первичную воспалительную реакцию, связанную с цитокинами, такими как TNF или LPS Более подробно, обнаружено, что специфические группы пептидов, особенно тех, которые имеют по крайней мере 5 аминокислотных остатков, являются очень эффективными агентами, полезными при лечении (среди прочего) MS и НАМ и, вероятно, являются полезными при лечении других типов миелопатии, большинство из которых имеют аналогичный механизм заболевания Из приведенного выше обсуждения очевидно, что многие симптомы и заболевания связаны с хроническим воспалением, однако, кажется, что некоторые из этих заболеваний включают различные механизмы Следовательно, важно найти специфические соединения, полезные для лечения симптомов и заболеваний, связанных с хроническим воспалением, при этом оказывается, что эти соединения взаимодействуют определенным образом с CD4 рецепторами клеток иммунной системы Эти соединения, как указано выше, относятся к пептиду Т и различным его производным Первоначально думали, что такие соединения не оказывают на иммунную систему другого действия, а только очень полезны при блокировании присоединения HIV вируса к клеткам CD4 рецепторов (Ruff и др , IV International Conference on AIDS, Stockholm June, 1988) Первоначально многие пептиды, полезные в настоящем изобретении, были описаны как эффективные в профилактике инфекции и репликации HIV in vitro, смотри Европейский патент ЕР-А0249394 и WO-A-8809338, все они включены максимально возможным по закону цитированием, как и все другие документы, цитированные в данном описании Все соединения, раскрытые в данном описании, полезны для настоящего изобретения Основой исходного пептида является октапептид Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr Его называют пептид Т, так как, 50% аминокислотных остатков являются треонинами Этот пептид идентифицируют из подобласти молекулы др 120, внешнего гликопротеина вируса иммунодефицита человека (HIV), ответственной за присоединение к клетке, несущей CD4 молекулы и, в частности, лимфоциты-помощники, микроглийные клетки в CNS, моноциты и дендритные клетки Связывание происходит посредством специфического присоединения др 120 к CD4 молекуле Обрабатывая пациентов, зараженных HIV, этим пептидом и его производными, описанными ниже, получают в результате эффект потенциального ингибирования связывания всего вируса или нейротоксичной молекулы др 120 с CD4 рецептором клетки Таким образом, клетку защищают от инфекции, и разрушают вирус, неспособный к репликации, путем иммунной защиты Согласно первому аспекту настоящего изобретения предоставляется использование линейных или циклических пептидов общей формулы 1 I-A-D-C-D-E-F-G-H-I (1) где А - Ala, Gly, Val, Ser, Thr или отсутствует, В - Ala, Gly, Val, Ser, Thr или отсутствует, С - Ser, Thr или отсутствует, D - Ser, Thr, Asn, Glu, Arg, lie, Leu или отсутствует, E - Ser, Thr, Asp или отсутствует, F - Thr, Ser, Asn, Arg, Gin, Lys, Trp или отсутствует, G - Туг или отсутствует, Н - Thr, Arg, Gly, Met, Met (o), Cys, Thr, Gly или отсутствует, I - Gly или отсутствует, II - Cys или отсутствует, по крайней мере, одна из аминокислот необязательно замещена мономерным или полимерным углеводом или его производным, такое замещение происходит через гидроксил, и/или аминогруппу, и/или амидогруппу аминокислот, при этом пептид включает, по крайней мере, четыре аминокислотных остатка, или их фармацевтически приемлемых солей в производстве лекарств для лечения или профилактики воспаления Каждая из аминокислот, включенных в общую формулу 1, может находиться в L- или D- стереоизомерной конфигурации, и кандидаты, обозначенные через Н, могут быть этерифицированы или амидированы Пептид включает по крайней мере 4 аминокислоты Тетра-, пента-, гекса-, гегтга-, окта- и нонапептиды, полезные в настоящем изобретении, все являются пептидами, выбранными из последовательности I-A-B-C-D-E-F-G-H-II при исключении остатков, например, по одному, либо с карбоксильного, либо с амино-конца, либо из середины последовательности Понятно, что имея основную последовательность Twr-Thr-Asn-Tyr-Thr, пептиды могут иметь на обоих концах дополнительные аминокислотные остатки, некоторые из которых представлены общей формулой 2 X-Ser-Th r-Th r-Thr-Asn-Tyr-Y (2) 41881 где X является терминальным аминокислотным остатком, выбранным из Ala и D-Ala, a Y является карбоксильным терминальным остатком, выбранным из Thr и Thr-амида Особо предпочтительный пептид группы пептидов имеет упомянутую выше основную центральную последовательность - -Thr-Thr-Asn-TyrThr Обнаружено, что эти пептиды указанной выше общей формулы 2, в частности, вариант пептида Т формулы -Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-, является очень полезными в ингибировании связывания вируса иммунодефицита человека (HIV) с клетками человека путем блокирования рецепторных сайтов на поверхностях клеток Термин пептид Т используют в описании для обозначения пептидов общей формулы 2и, все из которых включают основную центральную последовательность, если не обозначено по-другому Следовательно, имеется в виду, что обозначение пептид Т включает все соединения общей формулы 2, при этом понятно, что все такие соединения являются вариантами октапептида Т, обозначенного также как пептид Т - прототип, формулы D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-AsnTyr-Thr-амид нокислоты для защиты молекулы от разрушения карбоксипептидазой В связи с этим соединениям 5, 6 и 7, перечисленные выше, включают аналоги CD-Thr аминотерминальным остатком и/или амидное производное на карбоксильном конце Кроме того, надо понимать, что еще одна из аминокислот в пептидах может быть замещенной N-алкил (например, С1-С4) аминокислотой вместо первоначальной аминокислоты, примеры включают метил и этил Гидроксильные группы боковых цепей одной или более аминокислот (Ser, Thr, Туг) могут быть преобразованы в эфирные или сложноэфирные группы Могут быть образованы любые (обычно замещенные) алкильные простые или сложные эфиры, такие как (C-iС4) алкильные, арильные или арил(Сі-С4) алкильные сложные эфиры, простые эфиры, тиоэфиры (сложные и простые), например, сложный эфир фенила, простой эфир бензила или тиофенола Предпочтительными простыми эфирами в настоящее время являются эфиры метила, этила и пропила, и предпочтительными сложными эфирами в настоящее время являются эфиры метила, этила и пропила Изобретение может быть полезно как в клинической медицине (для человека), так и в ветеринарии Следовательно, изобретение включает способ лечения или профилактики воспаления, при этом способ включает введение человеку или животному, например, многократное введение, пептида общей формулы 1 Обычно вводят эффективное нетоксическое количество пептида или такое количество, которое устанавливает подходящий баланс между эффективностью и токсичностью в зависимости от обстоятельств конкретного случая В качестве активной части предпочтительные пептиды, применяемые в изобретении, имеют аминокислотную последовательность формулы Гидроксильные группы боковых цепей аминокислот Ser, Thr и/или Туг и амидогруппы аминокислот Asn и/или Gin можно заместить различными углеводами или производными углеводов Производные углеводов могут быть такими, как указано выше Линейные пептиды, применяемые в данном изобретении, можно получить любым подходящим способом, таким как обычные способы твердофазного синтеза пептидов, смотри "Solid Phase Peptide Synthetic Technique", издание 2, J M Stewart, J D Joung, Pierce Chemical Company, 1984, ISBN 0-935940-03-0 Часто используемым твердофазным способом является способ Меррифилда (Mernfield) Возможен и другой способ синтез в растворе Предпочтительный пептид прототип пептида Т, легко получить от Carlbiotech A/S Копенгаген, Дания Циклические пептиды, полезные в настоящем изобретении, можно получить известными способами, такими как, например, описанный Y Hamada в Tetrahedron Letters, 26, 5155 (1985) Циклические пептиды можно получить в форме с дисульфидным мостиком между двумя Cys остатками и/или посредством реакции карбокси-терминальной аминокислоты с амино-терминальным остатком и/или посредством реакции аминотерминального остатка, например, с у-карбоксильной группой Glu, когда Glu находится в положении D Производные углеводов можно получить известными специалистам способами -Thr-Thr-Asn-Tyr-ThrВ рамках изобретения эти пептиды полезны для всех профилактических и терапевтических применений и являются особо предпочтительными для профилактики и лечения симптомов или заболеваний у человека и других животных, связанных с хроническим аутоиммунным заболеванием Наиболее предпочтительными пептидами, полезными в данном изобретении, являются следующие 1 D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-NH2 2 Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr 3 D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr 4 D-Ala-Ala-Ser-Ser-Ser-Asn-Tyr-Met 5 Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr 6 Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr 7 Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr 8 D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr 9 D-Ala-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Asn-Tyr-D-Thr-NH2 10 D-Ser-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr-NH2 Часто преимущественным может быть наличие на аминном конце D-стереоизомера аминокислоты для защиты молекулы от разрушения аминопептидазой, в другом случае или кроме этого на карбоксильном конце может находиться амид ами Некоторые производные пептидов, полезные в настоящем изобретении, являются новыми соединениями и образуют еще один аспект данного изобретения, в соответствии с которым обеспечены линейные или циклические пептиды общей формулы 1 I-A-B-C-D-E-F-G-H-I где (1) A - A l a , Gly, Val, Ser, Thr или отсутствует, В - Ala, Gly, Val, Ser, Thr или отсутствует, С - Ser, Thr или отсутствует, 41881 D - Ser, Thr, Asn, Glu, Arg, lie, Leu или отсутствует, E - Ser, Thr, Asp или отсутствует, F - Thr, Ser, Asn, Arg, Gin, Lys, Trp или отсутствует, G - Туг или отсутствует, Н - Thr, Arg, Gly, Met, Met (O), Cys, Thr, Gly или отсутствует, I - Cys или отсутствует, II - Cys или отсутствует, по крайней мере, одна аминокислота замещена мономерным или полимерным углеводом или его производным, причем такое замещение осуществляют через гидроксильные, и/или аминогруппы, и/или амидогруппы аминокислот, при этом пептид включает по крайней мере четыре аминоксилотных остатка, за исключением гликозилированного пептида Т-прототипа или его фармацевтически пригодной соли Гликозилированный пептид Т раскрыт в работе Urge и др , Biochem Biophys Res Comms 184(2), 1125-1132 (1992), опубликованной 30 апреля 1992, но полезность настоящего изобретения не была раскрыта и предложена Предпочтительные отличительные признаки данного аспекта изобретения такие же, как и для первого аспекта Пегтгиды, полезные в данном изобретении, можно принимать в виде композиций в сочетании с фармацевтически пригодным носителем Таким образом, пептиды можно использовать в фармацевтических композициях и композициях веществ для лечения и профилактики любых заболеваний или симптомов, вызванных дисфункцией организма, соединением или иммунным расстройством, которые дают воспалительную реакцию иммунной системы Пегтгиды или композиции пептидов можно использовать отдельно или в комбинации с другим фармацевтически активным соединением, таким как противоинфекционный агент, например, антибиотик, и/или противовирусный агент, и/или противогрибковый агент, или другим фармацевтически активным соединением, таким как противоопухолевый агент Пегтгиды можно принимать орально, трансбуккально, парентерально, локально, ректально, вагинально, путем ингаляции в нос, путем легочной ингаляции или другими способами В частности, композиции пептидов согласно настоящему изобретению можно составить в виде готовой формы для локального применения, для ингаляции в виде спрея или порошка, для инъекции (например, подкожной, внутримышечной, внутривенной, внутрисуставной или внутриполостной), для вливания или для орального приема, или можно приготовить в форме разовых доз в ампулах или таблетках, или приготовить в сосудах на несколько доз или других контейнерах с добавлением консервантов Композиции могут находиться в таких формах как суспензии, растворы, эмульсии или гели в масляных или водных носителях или могут содержать формулирующие агенты для приготовления данных композиций, такие как суспендирующие агенты, стабилизаторы и/или диспергирующие агенты По-другому, активный ингредиент может быть в форме порошка и/или лиофилизованной форме для прямого применения или для составления композиции с подходящим наполнителем (например, стерильная, апирогенная вода, обычный физиологический раствор или 5% декстроза) перед применением Фармацевтические композиции, содержащие пептиды, могут также содержать другие активные ингредиенты, такие как противомикробные агенты или консерванты Композиции могут содержать от 0,001 до 99% (вес/объем или, предпочтительно, вес/вес) активного вещества Пептид Т, получаемый от Carlbiotech A/S обычно готовят в 5% растворе декстрозы и разливают стерильным образом по многодозовым пробиркам Подходит и вариант приготовления препарата в других носителях, таких как в каждой дозе составляет порядка 8,5 мг/мл для подкожных инъекций при дозе 1 мл Композиции вводят дозами, эффективными для лечения или профилактики, например, 0,0510000 мг пептида в день, в частности 5-1000 мг в день Если пептид, соответствующий изобретению, не является токсичным, можно применять очень большие дозы Однако, обычно это не является необходимым Доза, принимаемая ежедневно в течение курса лечения, зависит от степени воспаления или воспалительной реакции Для введения инъекций или вливаний композиции дневная доза, применяемая для лечения взрослых пациентов, составляет примерно от 0,2 до 20 мг активного вещества на вес тела около 70 мг, это количество можно вводить за 1-4 раза в течение дня, такая дозировка зависит от курса приема и симптомов пациента Описанные выше композиции можно готовить смешиванием или соединяя ингредиенты другим образом Изобретение может быть полезным для профилактики или лечения заболеваний или медицинских симптомов, особенно таких, которые включают воспаление, таких как вирусный, бактериальный или вызванный лекарствами гепатит или менингит, ревматоидный, псориатический, реактивный артрит, остеоартрит или другие артриты, сепсис/септический шок, кожные воспаления, респираторный дистресс-синдром у взрослых (ARDS), отторжение трансплантата, вторичные воспаления после хемотерапии или радиотерапии опухолевых заболеваний Особое применение изобретение находит при профилактике и лечении MS, НАМ и других воспалительных миелопатий (особенно тех, которые отдельно упомянуты выше) и/или симптомов или заболеваний человека, связанных с хроническим иммунным возбуждением Более подробно, изобретение полезно при лечении синдрома хронического утомления, синдрома токсического шока, вызванного инфекцией Staphylococcus aureus, артрита, воспалительных заболеваний кишечника и реакции организма на трансплантат (host-versusgraft) у пациентов с пересаженными органами Таких эффективных результатов достигают (не ограничиваясь какой-либо отдельной теорией) вследствие иммуносупрессивной активности этих соединений при хронических воспалениях Для того, чтобы обеспечить руководство по приему и понимание использования пептидов сог 41881 ласно изобретению, особенно при MS, миелопатиях, таких как НАМ и хроническое воспаление, а также составление композиций, в качестве показателя, основанного на большой работе, уже проведенной, по использованию пептида Т для лечения HIV-инфекции, выбирают следующее Пептид Т является октапептидом, гомологичным области др120, гликопротеину оболочки HIV и человеческому вазоактивному кишечному пептиду (VIP) Первоначально Pert и др (ЕР-А0249394) обнаружили, что он блокирует связывание др120 (гликопротеина оболочки HIV) и, таким образом, блокирует связывание HIV с CD4, специфическим рецептором на границе мембраны, блокируя при этом интернализацию вируса в клетку - процесс, необходимый для репликации вируса CD4 молекула, необходимая для вхождения HIV в клетки, локализована на поверхности лимфоцитов, макрофагов, микроглиальных клеток, нейронов и многих других клеток Показано, что связывание HIV с CD4 рецептором влияет на вхождение вируса, и связывание свободного (не связанного с вирусом) др120 дает в результате нейронную токсичность при использовании и m vitro, и in vivo Обнаружено, что пептид Т и аналоги ингибируют связывание радиоактивного меченного др120 с мембранами гиппокампа крыс при концентрации 0,1 нМ Используя пептид Т и его аналоги, Pert и др (Proc Natl Sci USA 83, 9254-9258 (1986), Pert и др (Clm Neuropharmacol 9(4), S 198 (1986)) имели возможность продемонстрировать снижение детектируемого уровня HIV - обратной транскриптазы, когда в исследованиях HIV - инфекционное™ присутствуют такие пептиды При концентрации пептида Т 100 нМ имеет место снижение уровня обратной транскрипгазы в девять раз Так как, во всех выделенных штаммах HIV др120 не является идентичным, проведено сравнение девяти различных культур HIV, Pert и др (Clm Neuropharmacol 9(4), S 198 (1986)) Обнаружена существенная гомология проверенных изолятов и пептида Т при сравнении центрального пентапептида (Ruff и др , FEBS Lett 2 Ц , 17-22 (1987), Brenneman и др, Nature 335, 639-642 (1988), Brenneman и др , Drug Dev Res 15, 3 6 1 369 (1988), Komisaruk и др , Annals of the NY Acad Sci 527, 650-654 (1988), Buzy и др , The Lancet 22 July, 226-227 (1989)) Сейчас такое сравнение расширено до двадцати изолятов Ингибирование связывания др120 и HIV с CD4, так же как и демонстрация снижения инфекционности HIV в присутствии пептида Т и его аналогов, обеспечивают один возможный механизм действия для объяснения клинических эффектов пептида Т В этом смысле пептид Т при достаточной концентрации может предупреждать новое клеточное инфицирование HIV Начальные исследования в этой области были сфокусированы на CNS по двум причинам в нейронах была обнаружена высокая концентрация CD4 молекул, и одним из основных эффектов HIV инфицирования является развитие неиропознавательнои дисфункции Эти факты особенно важны, так как показывают, что пептид Т транспортируется из крови к головному мозгу посредством активной, насыщаемой транспортной системы, причем его выход осуществляется только диффузией (Barrera и др, Brain Res Bull 19, 629-633 (1987)) Продемонстрирована эффективность пептида Т в устранении симптомов вызванного HIV слабоумия при клинической проверке фазы I (Peptide Т Phase 1 clinical trial) в Университете Южной Калифорнии в Лос-Анжелесе и фазы II в клинике Fenway в Бостоне Оба исследования продемонстрировали улучшения при вызванной HIV неиропознавательнои (neurocogmtive) недостаточности у пациентов с AIDS В настоящее время для объяснения по крайней мере двух возможных механизмов действия пептида Т используют гомологию пептид T/gp120/VIP Во-первых, он конкурентно присоединяется к CD4 (известному рецептору для HIV) на поверхности клеток человека и конкурирует за места связывания и с HIV, и с др120 Связывание пептида Т и его аналогов общей формулы 1 (или в более частном случае общей формулы 2 с CD4 может вызывать блокирующий эффект, предотвращая связывание каких-либо других молекул, способных присоединяться к этому рецептору, по-другому или кроме того, связывание пептида Т с CD4 может вызывать реакцию, аналогичную реакции, вызванной эндогенным лигандом CD4 является антигеном дифференцировки, который определяет подгруппу Т-лимфоцитов клеток помощник/индуктор, а также присутствует в различных клетках, включая нейроны, активированные макрофаги и В-клетки CD4 является доминирующим рецептором для HIV, и первоначально считали, что он является необходимым для клеточной инфекции Используя моноклональное антитело ОКТ4, Pert и др (Proc Natl Sci USA 83, 9254-9258 (1986), Pert и др (Clm Neuropharmacol 9(4), S 198 (1986)) показали, что этот антиген присутствует повсюду в центральной нервной системе (CNS) человека и что в наибольшей концентрации он присутствует в зубчатой извилине, гиппокампе, миндалевидном теле и околокорковом веществе Обнаружено, что такое же распределение существует и у других высших млекопитающих Хотя общеизвестно, что HIV может инфицировать не только лимфоциты, но также нейроны, трудно приписать неврологическую дисфункцию, наблюдаемую у HIV - пациентов, активному CNS HIV инфицированию, так как, активно инфицированным является только небольшое количество нейронов Предполагают, что неврологический дефицит, наблюдаемый при HIV инфицировании, может происходить не только в результате инфекции, но и в результате действия вирусного "токсина", такого как др120 Brenneman и др (Nature 335, 639-642 (1988)) обнаружили, что очищенный др120 от двух изолятов, так же, как рекомбинантный др120, вызывает значительную гибель нейронных клеток в культурах нейронов гиппокампа зародышей мыши Нейротоксичность можно снизить путем предварительной обработки антителами для CD4 и полностью устранена при помощи VIP Так как, нейроны мыши нельзя инфицировать HIV, очевидно, что нейротоксичность вызвана др120 и не является результатом проникновения вируса или репликации 10 41881 VIP (66, 67, 68, 69 T DNYT) и центральный пептид (61-65 TTNYT) участвуют в гомологической последовательности, которая связывает CD4, и которая также обнаружена в изолятах значительно большего др120 Пептид Т при использовании в системах таких же культур нейронов гиппокампа мыши полностью противодействует нейротоксичности, вызванной gp120, Brenneman и др , Drug Dev Res 1_5, 361-369 (1988)) Кроме того, CSF от пациента с ATDS- слабоумием вызывает существенную нейротоксичность в этой системе (44-49% смертность при 1 1000 000 разбавлении) Этот эффект ингибируют пептидом Т, Buzy и др , The Lancet, July 22, стр 226-227 (1989)) Обычно gp120 продуцируется в большом избытке относительно количества, необходимого для вирусной репликации, этот избыток может оказывать нейротоксичное действие при количестве, далеком от соразмерности с числом микроглиальных клеток или нейронов, активно инфицированных HIV мя способами, модулируя боль наркотиком или без наркотика, (Komisaruk и др , Annals of the NY Acad Sci 527, 650-654(1988)) На сегодняшний день считают, что введение пептида Т человеку приносит пользу с клинической точки зрения, что установлено во всех опытах при HIV заболевании, при проведении экспериментов (Pilot Swedish Study) при исследовании USC Phase I и Fenway/CRI, при исследовании по программе Toronto Western Hospital Compassionate Use Program, включающей 51 пациента, в случае псориаза и других медицинских симптомов, в докладах из Швеции (Marcusson, Lazega и др , 1989-9 и Marcusson and Wetterberg, 186-10) и для 8 пациентов с псориазом и другими медицинскими симптомами из Торонто Нейропознавательные улучшения обнаружены у HIV-позитивных пациентов, а улучшения общих симптомов обнаружены и у HIV-позитивных, и у HIV-негативных пациентов, причем указанные улучшения зависят, во-первых, от подобного VIP нейротропного и агонистического действия пеггтида Т, а также от противовоспалительного и анти-TNF действия, обсуждаемого ниже Ни одна частная теория не дала никаких рекомендаций в отношении использования этих пептидов при лечении MS и НАМ и с точки зрения приведенных выше рекомендаций и дискуссии в отношении использования различных пептидов общей формулы 2 и их аналогов при лечении HIV, высказана гипотеза, что существуют многочисленные схожие черты выражения заболевания и потенциальные аналоги этиологии болезни Оказывается, что пептид Т действует как агонист и как блокатор иммунной функции, медиатором которой является CD4, в большей степени, чем противовирусным лекарством В исследованиях, относящихся к настоящему изобретению, пептид Т применяли пациенты с заболеваниями без HIV, такими как рассеянный склероз, HTLV-I миелопатия и псориаз Пептид Т может действовать как агонист в дополнение или наряду с отсутствием нейрозащитного действия против вирусного инфицирования и нейротоксичности Непосредственную агонистическую активность демонстрируют двумя способами Ruff и др (FEBS Lett 2Ц, 17-22 (1987)) показали, что пептид Т и два аналога являются потенциальными агонистами хемотаксиса моноцитов человека Их потенция как хемотактических агентов соответствует их относительной способности ингибировать др120 связывание и инфекционность Т-клеток HIV В качестве дополнительной демонстрации агонистической активности пептида Т, пептид Т и VIP оказывают свое клеточное действие посредством регуляции протеинкиназы С Zorn и др , The Endoc Society Abstract (1989)) Следовательно, агонистическая активность пептида Т заключается в продуцировании трансмембранного сигнала, который может влиять на регуляцию протеинкиназы С В шести индивидуальных экспериментах, являющихся частью настоящего изобретения, также продемонстрировано, что пептид Т может понижающе регулировать фермент р56|ск, тирозинкиназу, связанную с цитоплазматической частью связанного с мембраной CD4, подразумевая, таким образом, что соединение пептида Т с CD4 молекулой может продуцировать трансмембранный сигнал К настоящему времени показана эффективность пептидов общей формулы 1 и, в частности, пептидов общей формулы 2, в качестве гипотезы, почему работают данные соединения, предложено следующее 1) Оба заболевания НАМ и MS являются воспалительными и демиелинизирующими заболеваниями, как HIV-заболевание 2) Оба заболевания, возможно, имеют вирусную этиологию, в настоящее время признано, что НАМ вызывается ретровирусом HTLV-I, вирусом того же семейства, что и HIV, предложено, что MS также является проявлением HTLV-I инфекции, синдром хронической утомляемости также присоединяют к ряду возможных вирусных инфекций с ретровирусной и DNA (например, HHV-6) этиологиями 3) Оба заболевания объединяет большое количество общих симптомов, например, утомляемость, потеря равновесия и симптомы аутоиммунных явлений, стоит отметить, что HTLV-I заболевание демонстрирует многочисленные признаки аутоиммунности, такие выражения аутоиммунных явлений, которые сопутствуют, как можно ожидать, ретровирусным заболеваниям Одним общим предметом среди этих заболеваний может Дополнительное подтверждение потенциальной агонистической активности (подобно VIP) пептида Т обеспечивают результаты экспериментальной проверки гипотезы (Komisaruk и др , Annals of the NY Acad Sci 527, 650-654 (1988)), что VIP, выделенный от тазовых нервных окончаний в спинной мозг может давать аналгезию Показано, что налоксон-независимую (naloxonemdependent) аналгезию вызывает введение VIP в серое вещество периферийных каналов крыс, исследователи вводили VIP прямо в спинной мозг крыс и измеряли порог болевой чувствительности к периферическим вредным раздражителям для проверки гипотезы Введение VIP в спинной мозг вызывает аналгезию, как определяли по скрытой реакции - легкие удары хвоста и в голосовом тесте в ответ на удар по хвосту при воздействии дву 11 41881 быть периферическая невропатия, основанная на процессе демиелинирования 4) По-видимому, основанием является общее действующее вещество для димиелинирования и центральной, и периферической нервных систем и общие аутоиммунные проявления при НАМ, MS и HIV заболеваниях 5) Димиелинирование связано с воспалением любой этиологии и, по-видимому, опосредовано, по крайней мере, частично, TNF Ни одна частная теория не дала рекомендаций относительно использования пептидов при лечении симптомов и заболеваний, связанных с хроническим иммунным возбуждением, и с точки зрения приведенных выше рекомендаций и дискуссии в отношении использования различных пептидов общей формулы 2 и их аналогов при лечении HIV предложено, что существует иммуномодуляторный эффект пептида Т, связанного с CD4 Такой эффект показан в следующих примерах, где обнаружено, что пептид Т ингибирует вызванную митогеном пролиферацию периферических моноядерных клеток крови (РВМС) при пикомолярной концентрации и меньшей Авторы обнаружили, что пептид Т разрешает пролиферацию РВМС в ответ на митоген, но в меньшей степени по сравнению с ростом РВМС в его отсутствие Предварительная инкубация РВМС с пептидом Т в течение периода менее 30 минут не оказывает воздействия на стимулирование митогена Однако, выдерживание РВМС с пептидом Т в течение 2 часов с последующим промыванием клеток перед выдерживанием с митогеном дает в результате ингибирование пролиферации, аналогичное тому, тогда клетки инкубируют в присутствии и пептида Т, и митогена Обнаружено также, что пептид Т незначительно влияет на рост РВМС, культивированных в отсутствие митогена Следовательно, считают, что пептид Т способен подавлять нормальную пролиферацию РВМС в ответ на пролиферационные сигналы, не связанные с CD4 ные могут получать одинаковые дозы пептида Т и его аналогов с целью лечения воспаления Теперь проиллюстрируем изобретение следующими не ограничивающими его примерами Примеры ссылаются на приложенные чертежи, в которых Фиг 1 соответствует примеру 6 и показывает действие пептида Т на фактор экспрессии ткани (индуцированный TNF) на клетках эндотелия умбиликальной вены человека Фиг 2а, 2Ь и 2с относятся к примеру 17 и показывают, что пептид Т способен ингибировать лимфопролиферацию в ответ на митогены 105 РВМС культивируют в присутствии PWM (2a), Con А (2Ь) или РНА (2с) со следующим разбавлением пептида Т А без пептида Т, В 10 5 М, С 10 7 М D 1 0 9 М , Е 10 1 1 М, F1 ( Г 3 М, G 1 0 1 5 М , Н 1 0 1 Г М Культуры инкубируют в течение 5 дней, дают импульс Н-тимидином и количество включенной радиоактивности переводят в индекс пролиферации, как описано в примере 17 Звездочка (*) указывает различие в пролиферации, ± является статистически незначительным (р > 0,05) Фиг 3 относится к примеру 17 и показывает, что пролиферация лимфоцитов, индуцированная Con А, в присутствии пептида Т соответствует (но с пониженной скоростью) росту в отсутствие Con А 105 РВМС культивируют в присутствии Соп А в течение 8 дней Культуры облучают и ежедневно собирают клетки, степень лимфопролиферации выражают как количество включенного 3Н-тимидина в минуту (СРМ) Параллельно с Con А добавляют пептид Т (РТ, 10 9 М) Фиг 4 относится к примеру 18 В присутствии немитогенных стимулов, таких как антигены ткани донора, способные вызвать иммунную реакцию со стороны реципиента (вакцина кори, эпидемического паротита, краснухи MMR), суперантигены, такие как Staphylococcal энтеротоксины SEB и TSST-I, и антитела к CD3 (анти-СОЗ), РВМС будет пролиферировать, как указано индексом пролиферации более 1 (-пептид Т) Присутствие пептида Т (+ПЄПТИД Т), добавленного в первый день к этой культивируемой в течение шести дней культуре, не оказывает действия на рост РВМС в ответ на эти стимулы Фиг 5 также относится к примеру 18 Когда РВМС одного пациента (А) культивируют в присутствии РВМС от другого пациента (В), они будут пролиферировать [(А+В(Р-РТ)] как результат распознавания посторонних антигенов (аллоантигенов) на поверхности клеток В присутствии пептида Т [А+В(+РТ)] аллоиммунные клетки еще способны пролиферировать Фиг 6 также относится к примеру 18 Molt-4 является линией самопроизвольно растущих злокачественных Т-клеток человека В присутствии РВМС ингибируется рост РВМС вследствие поражения Molt-4 клетками РВМС (PBMC/Molt-4-PT) В присутствии пептида Т, добавленного на первый день четырехдневного культивирования, поражение Molt-4 опосредованное РВМС, остается без изменений (PBMC/Molt-4+PT) Фиг 7 относится к примеру 19, в котором приведена последовательность стадий, включенных в этот цитотоксический эксперимент Активированные макрофаги способны поражать мечен В настоящее время раскрыта эффективность пептидов общей формулы 1 и, в частности, пептидов общей формулы 2 в лечении симптомов и заболеваний, связанных с хроническим иммунным возбуждением или хроническим воспалением, в качестве гипотезы механизма действия пептида Т и, следовательно, причины, по которой соединения, полезные в изобретении, являются эффективными, предлагают следующее Пептид Т связывает CD4 Следующими далее тестами установлено, что пептид Т ингибирует митоген и вызываемую MLR пролиферацию лимфоцитов Следовательно, считают, что пептид Т может служить в качестве иммуномодуляторного лекарства, которое бы регулировало с понижением усиленную иммунную реакцию, происходящую в хроническом присутствии антигена или по другим упомянутым причинам, и, следовательно, снижало хроническое воспаление Выделение всех этих применений дает общую основу воспаления В соответствии с различными вариантами настоящего изобретения и с точки зрения приведенных выше рекомендаций, полученных из применения пептидов общей формулы 1 и, в частности, пептидов общей формулы 2 при лечении HIV человек или другие живот 12 41881 ные К562 клетки в отсутствие пептида Т (по РТ) Если к культуре макрофага конкурентно с активатором (РТ стадия 1) добавлен пептид Т, на цитотоксичность воздействовать невозможно Если пептид Т добавляют к активированным культурам макрофагов параллельно с мечеными клетками (РТ стадия 2), ингибируют цитотоксичность Варьирование времени добавления пептида Т не изменяет опосредованного пептидом Т ингибирования цитотоксичности, опосредованной макрофагом Фиг 8, которая также относится к примеру 19, показывает, что супернатант культур макрофагов, стимулированных LPS, содержит цитолитические вещества, способные убивать клетки, меченные К562 Меченные клетки содержат внутриклеточную радиоактивность, выделяющуюся при гибели клетки Большее выделение радиоактивности (измеренное как показания счетчика в минуту, срт) указывает на большую гибель В отсутствие пептида Т (А) происходит больше поражений, чем в его присутствии (B-F) Когда концентрацию пептида Т снижают ниже 1x10 15 М цитолитической активности, степень цитотоксичности возвращается к уровню контроля (А) Концентрации пептида Т были следующими она испытывает дизестезию ступней, боль в ногах и ступнях, слабость ног и частое мочеиспускание Неврологическое обследование подтвердило увеличение степени сухожильных рефлексов, мышечную спастичность нижних конечностей и пирамидальную слабость ног Диагноз подтверждается соматосенсорным и слуховым потенциалами и HTLV-I сероположительностью Лечение состояло в ежедневном подкожном введении 8,5 мг пептида Т по утрам Через два месяца введения пептида Т пациентка утверждала, что состояние ее существенно улучшилось, и она способна поднимать обе ноги, а не волочить их по полу Кроме того, она способна работать без палки, может стоять без поддержки помощника или палки, может подниматься по ступенькам впервые за два года и отмечала уменьшение частоты мочеиспускания и никтурии Наиболее изнуряющие функциональные симптомы у нее были связаны с болезненной периферической невропатией, которая сильно ограничивала ее подвижность и социальные контакты и нарушали ее сон, она описывала боль как сильную до непереносимой Боль, ранее не поддающаяся лечению известными способами, стала меньше, переносимой и не влияющей на повседневную активность А пептид Т отсутствует В пептид Т, Ю М С пептид Т, 10 7 М D пептид Т, 10 9 М Е пептид Т, 10 11 M F пептид Т, 10 13 М G пептид Т, 10 15 М Фиг 9 относится к примеру 20 и показывает, что пептид Т оказывает аналогичное действие на анти-TNF при ингибировании эффектов TNF Фиг 10 относится к примеру 21 и показывает, что пептид Т снижает уровни TNF сыворотки у HIV-пациентов Фиг 11 относится к примеру 23 и показывает, что аналог пептида Т 623 удлиняет продолжительность жизни мышей с повышенной чувствительностью при введении летальной дозы LPS Фиг 12 относится к примеру 24 и показывает, что пептид Т ингибирует активацию нейрофилов TNF человека Фиг 13 также относится к примеру 24 и показывает, что аналог 505 пептида Т ингибирует действие TNF в качестве примера и активацию нейрофилов человека Фиг 14 также относится к примеру 24 и показывает, что аналог 505 пептида Т ингибирует LPS активацию нейрофилов человека Фиг 15 относится к примеру 26 и показывает, что пептид Т снижает вызванную TNF экспрессию фактора ткани в HUVEC Примеры с 1 по 4 демонстрируют существенное клиническое действие, которое пептиды, полезные в данном изобретении, оказывают на MS и НАМ Пептид, используемый в каждом из примеров с 1 по 4 является вариантом пептида Т общей формулы 2 с последовательностью D-AlaSer-Thr-fhr-Thr-Asn-Tyr-Thr-aMHfl Пример 1. HTLV-I миелопатия Женщине 45 лет поставлен диагноз HTLV-I, сероположительный, после физической нагрузки После двух месяцев лечения пептидом Т, который был для пациентки новым препаратом, она сообщила о непрерывном уменьшении симптомов и улучшении подвижности Результаты ее неврологического обследования остались без изменения в отличие от двигательной способности, например, ходьбы Ранее она не выходила из своей квартиры, наступившее после лечения улучшение двигательной способности позволило ей путешествовать в ее дом на Карибском море В течение этого путешествия она принимала лекарства без добавок и за пять дней заметила прогрессирующую усталость и слегла от утомления, слабости и боли После двух недель прекращения приема пептида Т симптомы существенно уменьшились через один месяц после повторного курса После двух последовательных курсов лечения она закончила прием препарата с аналогичным рецидивом симптомов и аналогичным их устранением после повторного лечения пептидом Т Пример 2. Рассеянный склероз Женщине 40 лет поставлен диагноз MS с симптомами слабость, потеря равновесия, двоение в глазах и нечувствительность правой руки с 23 лет Ее лечили преднизоном, и позднее физиотерапевтически с малым эффектом Она оставалась неспособной ходить без палки или помощника, проявляла депрессию, горизонтальный нистагм и слабость мыщц-сгибателей бедра с двух сторон, слабость мышц-сгибателей колена и задних мышц-сгибателей стопы Отмечали повышенный тонус двух нижних конечностей и клонус обоих голеностопных суставов Глубокие сухожильные рефлексы 2+ в руках, 3+ обоих колен и голеностопов и подошвенная чувствительность Ее лечили препаратом LIORESAL™ (баклофен baclofen) с некоторым улучшением, однако, она чувствовала прогрессирующее ухудшение до тех пор, пока не оказалась прикованной к креслу-ка 13 41881 талке и начала жаловаться на слабость, мышечную спастичность, клонус, недержание мочи и повторяющееся инфицирование мочевого тракта При ее обследовании MRI сканирование головного мозга показало картину, соответствующую рассеянному склерозу Ее начали лечить пептидом Т, ежедневное введение 8,5 мг подкожно Она сообщила, что значительно ослабились симптомы болезни, включая мышечную, спастичность, точную двигательную координацию никтурию и частоту мочеиспускания, улучшилась концентрация, память и эмоциональная лабильность Ее обследовали через пять недель после начала лечения, были сообщены и продемонстрированы функциональные улучшения Через шесть месяцев пациентка продемонстрировала подтверждение улучшения этих симптомов Уменьшилась частота никтурии, улучшился двигательный контроль, уменьшилось заикание, ее ноги стали менее спастическими, и она могла стоять с минимальной поддержкой Она продемонстрировала заметные улучшения симптомов в области интеллектуальных и двигательных функций через несколько недель после начала лечения пептидом Т, эти улучшения подтвердились через шесть месяцев Симптомы ухудшились, когда пациентка приостановила прием пептида Т на 3 недели, но снова улучшились, когда она снова начала принимать лекарство Ее состояние оставалось стабильным по сравнению с обычным прогрессирующим ухудшением болезни, в течение месяцев она продолжала принимать пептид Т ные и ствола головного мозга, согласующиеся с MS Прием стероидов улучшил атаксию и проблемы со зрением Следующее MRI сканирование примерно через 16 месяцев показало обширное перивентрикулярное заболевание белого вещества с включением corpus collosum Обнаруженная картина типична для демиелинирования, согласующегося с MS В это время пациент демонстрирует остающийся осциляторный горизонтальный пульсирующий нистагм и горизонтальный нистагм с двусторонним пристальным взглядом (gaze), атактическая походка, небольшое ухудшение теста "пятка-голень", но хороший тест "палец-нос" Тонус нижних конечностей увеличен, и пациентка имела невыносимый двусторонний клонус голеностопа Ее коленный рефлекс усилен на правой ноге по сравнению с левой Подошвенные реакции усилены для двух ног На ногах по сравнению с руками она имела ухудшенную фиксацию, вибрацию, слабое осязательное ощущение и ощущение холода Приблизительно через два месяца пациентке начали вводить пептид Т, подкожно, 8,5 мг ежедневно За 1-2 недели она почувствовала существенное улучшение Она почувствовала улучшение чувствительности пальцев, легкое движение рук и улучшение познавательной функции Когда она прекратила прием пептида Т, она отмечала усиление утомляемости и атаксии От употребления преднизона по 150 мг в день она получила минимальное улучшение симптомов После возобновления применения пептида Т она отметила заметное улучшение в отношении утомляемости и атаксии и точную двигательную функцию Пример 5. Рассеянный склероз Женщину 56 лет с развитием головокружения, атаксии, случаями головокружения, нарушениями двигательной функции и распространяющейся слабостью ног лечили дилантином и поместили в госпиталь Последующее исследование показало вертикальный нистагм, некоторые смазанные последствия и нарушение Она была повторно обследована примерно через два года после случаев с головокружением и жалоб на спазмы ног Медицинское обследование показало уменьшение поля зрения с частичной горизонтальной гемианопсией левого глаза в горизонтальной области и сужением поля левого глаза Она показала ухудшение походки (tandem gait), снижение сгибания правого бедра и снижение сухожильных плечелучевых рефлексов в правой руке по сравнению с левой и в правом колене по сравнению с левым Подошвенная реакция снижена, и пациентка имеет вертикальный нистагм с направленным вверх взглядом, как отмечалось выше Пациентка начала применять пептид Т по 8,5 мг ежедневно подкожно и за 10 дней отметила приток энергии и улучшение интеллектуальной функции и улучшение зрения При прекращении лечения пептидом Т симптомы ухудшились до такого состояния, как перед приемом лекарства Проведенное в это время обследование показало отсутствие изменений по сравнению с результатами обследования до начала лечения пептидом Т Пример 3. Рассеянный склероз Женщине 28 лет поставлен диагноз оптический неврит, вторичное проявление рассеянного склероза с симптомами нечувствительность, сниженная двигательная функция и затемнение зрения (20/300 с двух сторон) Результаты соматической неврологической проверки находились в пределах нормы Незначительные случаи нечувствительности и нарушений речи, равновесия и координации происходили в течение 6 часов, наряду с головной болью и потерей зрения Начали применять лечение пептидом Т Через шесть дней повторное обследование показало значительное улучшение зрения (21/30 с двух сторон) В течение следующей недели пациентка отмечала функциональные улучшения В предыдущем случае оптического неврита потребовалось шесть месяцев для восстановления (сравнимо с естественным течением MS) по сравнению с данным случаем, когда восстановление произошло значительно быстрее, чем ожидалось для случая оптического неврита, вызванного MS Пример 4. Рассеянный склероз Женщина 34 лет, страдающая рассеянным склерозом, проявляющимся оптическим невритом и полной потерей зрения на правый глаз в течение 2 недель, нечувствительностью правой, а затем обеих ног Симптомы ухудшались, ей прописали преднизон, и наступило некоторое улучшение У нее ухудшилась атаксия с затемнением зрения и осциллопсией, ей давали преднизон 80 мг в день MRI сканирование показало многочисленные сигналы высокой интенсивности, перивентрикуляр Примеры 5-7 экспериментально показывают значительные эффекты, продемонстрированные пептидами, полезными в данном изобретении 14 41881 Пример 6. Воспаление, вызванное LPS В нулевой момент времени обычным мышам balb /с (самки, 12 недель) вводили LPS (250 JJX, Е coli Е-235, Sigma cat no L-2018) Затем одну группу мышей (50 животных) обрабатывали с интервалами в 30 минут, делая внутрибрюшинные инъекции бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Sigma cat no 6793), растворенного в изотонической стерильной воде без пирогена (2,5 мг BSA на одну инъекцию для каждого животного, каждая инъекция содержала 100 ші) Вторую группу мышей (50 животных) обрабатывали с интервалами в 30 минут, делая внутрибрюшинные инъекции пептида Т (Carlbiotech A/S, партия 109401), растворенного в стерильной изотонической воде без пирогена (2,5 мг пептида Т на одну инъекцию каждому животному, одна инъекция составляла 100 ші) Определяли уровень глюкозы в образцах крови через 3 часа Субъективные параметры, такие как секреция из глаз, диарея и общее состояние оценивали по шкале от (-) до (+++) Как можно видеть из таблицы 1, наблюдается существенная разница в уровнях глюкозы для животных, обработанных пептидом Т и животных, обработанных BSA (плацебо) Субъективные параметры также указывают на значительно более высокий индекс состояния животных, обработанных пептидом Т Таблица 1 Диарея Глюкоза в крови Секреция на глаз Общее состояние 0 Контроль (BSA) Обработка пептидом Т Зч 0 Зч 0 Зч 0 Зч +++ + 4 4=0 7 4 3=0 6 2 0=0 2 2 4=0 5 +++ + +++ + t-тест = 98 р 1,00 соответствует росту, который превышает рост в самой среде При физиологически приемлемых концентрациях пептид Т ингибирует пролиферацию нормальных (HIV серонегативных) периферических моноядерных клеток крови (РВМС), не вызывая значительной цитотоксичности, как показано в таблице 3 Этот эффект является долгодействующим, пептид Т, данный на первый день культивирования, на шестой день культивирования ингибирует пролиферацию, вызванную митогеном Индекс пролиферации ± станд отклонение (SD)1 Таблица 3 Пептид Т 2 Среда3 PWM 4 Con А4 РНА 4 0 10 5 1 00 1 14±0 15 0 73±0 16 2 17±1 10 1 5±0 15 7 47±0 50 ND5 4 47±0 36 4 69±0 42 4 15±0 23 4 55±0 66 2 72±1 20 3 19±0 06 1 98±0 04 1 69±0 48 317 0±41 0 149 0±38 4 123 6±18 1 78 6±23 1 103 8±22 8 ю7 9 ю12 ю 1 SD - стандартное отклонение 2 Концентрация петита Т в молях/л 3 Рост в отсутствие митогенов 4 Митоген лаконоса (PWM), Конканавалин A (Con А) и фитогемагглютимин (РНА) применяют с концентрацией 25 цг/мл 5 ND - не сделано Пример 10. Ингибирование MLR =142 ± 86, для В= 148 ± 84), культивируемые совместно в 200 шп среды, описанной в таблице 3 Пептид Т, добавленный на первый день MLR, ингибирует аллогенно индуцируемую пролиферацию РВМС (таблица 4) MLR осуществляли двумя способами, используя 105 аллогенные РВМС (срт для А = Таблица 4 Ингибирование MLR Пептид Т 1 cpm ± SD2 0 10 5 1365±335 649±263 534±108 764±77 681±222 235±4 371±117 672±261 ю7 9 ю11 ю13 ю15 ю17 ю 1 Концентрация пептида Т в молях/л 2 Показания счетчика (количество сцинтилляций) в мин ± стандартное отклонение 16 41881 радиографии, результаты используют в качестве меры р56 |ск активности Пептид Т ингибирует РНА-индуцируемую активацию и возрастание р56|ск-активности, зависящей от анти-СО4, что определяют (таблица 5) Ickспецифическим исследованием с использованием тирозинкиназы, р56|ск является СО4-ассоциированной тирозинкиназой, включенной в активацию Т-клеток и трансмембранный сигнал (Janeway С А Ann Rev Immunol 10, 645-674 (1992)) Вместо сигнала, обусловленного рецепторами Т-клеток кросс-связывание CD4 моноклональными антиCD4 ингибирует активацию Т-клеток (Burgess и др , Eur J Immunol 21_, 1663-1668 (1991)), возможно, путем активирования р56|ск, включая аутофосфорилирование ингибиторного Туг 505 (Abraham и др , Nature 350, 62-66 (1991)), Abraham и др Cancer Invest 9, 455-463 (1991)) Пептид Т способен ингибировать активацию р56|ск (таблица 5), достигая, таким образом, тех же результатов, что и анти-СО4 (ингибирование активации Т-клеток), хотя и отличающимся механизмом Пример 11. Действие пептида Т на активность р56|ск в PBL бластах PBL (периферические лейкоциты крови)бласты получают инкубацией РВМС при 37°С с РНА (10 цг/мл) в RPMI + 10% FBS в течение 48 часов с последующим добавлением интерлейкина-2 и последующей инкубацией в течение 96 часов Клетки промывают от IL-2 и инкубируют в течение 24 часов, затем промывают от FBS и инкубируют в течение 24 часов, PBL-бласты оставляют либо стимулированными, либо обрабатывают ОКТ4А (анти-СО4) при 10 цг/мл в течение 1 часа, затем крысиным анти-мышиным Ig при 5 цг/мл в течение 5 минут для усиления Ickактивности PBL-бласты предварительно обрабатывают пептидом Т (10 9 М) в течение 2 часов, затем промывают тщательно перед антиCD4 стимулированием После иммунопреципитации с анти-Іск-протеин А-конъюгатами и инкубирования (37°С 10 минут) с 32Р-АТР определяют аутофосфорилирование р56 |ск путем ауто Таблица 5 Воздействие пептида Т на активность р56 в PBL-бластах Без стимуляции -РТ +++ AHTH-CD4 +РТ + -РТ ++++ +РТ ++ 1 - Р Т означает пептид Т 2 ++++ высоко активный + слегка активный Известно, что анти-СО4 антитела ингибируют пролиферацию РВМС, вызванную митогеном так же, как и вызванную антигеном, in vitro выделение лимфокина, функцию Т-помощника и MLR (Bank и др, J Exp Med 162, 1294-1303 (1985)) Возможны два механизма анти-СО4-ингибирования функции Т-клеток 1) AHTH-CD4 антитела вызывают стерические препятствия CD4/MH С II взаимодействию, которое происходит через активацию Т-клетки Пептид Т, по-видимому, не участвует в этом эффекте, так как, он является производным последовательности др120, известной тем, что присоединяется к CD4, и место присоединения др120 к СО4-молекуле удалено от места присоединения МНС II (Fleury идр (1991)) 2) Кросс-связывание CD4 многовалентным анти-СО4-антителом вместо TcR/CD3 стимуляции посылает отрицательный сигнал к Т-клетке (Bank H f l p . J Exp Med 162, 1294-1303-0985)) Пептид T моновалентен, следовательно, не может кросссвязывать CD4 рецепторы, следовательно, его механизм ингибирования активации Т-клеток должен отличаться от механизма анти-СО4 Обработка воспалительных признаков мышиным анти-СО4 дает в результате множество нежелательных побочных эффектов, включая крапивницу, лихорадки, жар и тремор, которые могут требовать медицинского вмешательства Кроме того, сообщается о снижении количества CD4 клеток, уменьшении пролиферации на митогены и антигены и уменьшение остаточных гиперчувствительных реакций после введения анти-С1Э4, измерении опосредованной клетками иммунной функции (Horneff и др , Cytokme 3, 266-267 (1991), Horneff и др Arth Rheum 34, 129-140 (1991), Wofsey и др Semin Immunol 2, 419-425 (1990)) Введение анти-СО4 конкурентно с антигеном может ингибировать и первичную, и вторичную иммунную реакцию (Waldor N К Immunol Ser 45, 573-586 (1990)) Кроме того, применение в качестве терапевтических агентов ксеногенных (нечеловеческих) протеинов ограничено вследствие потенциальной возможности образования антител, направленных против инородных протеинов, которые могут опосредовать шок и реакции гиперчувствительности типа III после повторного введения Пример 12. Влияние пептида Т на индуцированную антигеном пролиферацию РВМС РВМС инкубируют, как описано в тексте к таблице 3 в примере 9, в присутствии живой разбавленной вакцины кори, паротита и краснухи (Merck Sharp и Dohme, Канада) с финальным разбавлением 1 20 Пептид Т добавляют либо на первый день инкубации, или ежедневно Результаты выражают в виде индексов пролиферации ± стандартное отклонение 17 41881 Таблица 6 Влияние пептида Т на индуцированную антигеном пролиферацию РВМС Концентрация пептида Т (моль/л) Индекс пролиферации ± стандартное отклонение 1 день 0 10 7 9 ю11 ю13 ю15 ю17 ю19 ю Ежедневно 3 26±0 55 4 02±0 78 1 91 ±0 46 5 35±1 46 5 46±1 37 5 56±0 60 3 99±0 18 6 15±2 59 Хотя пептид Т может ингибировать индуцированную антигеном пролиферацию РВМС при ежедневном введении in vitro, авторы не уверены, что это оказывает существенный эффект на нормальную иммунную реакцию, когда введение происходит in vivo (как показано Goodwin и др , V International Conf Aids, Монреаль, июль 1989, Abstract # W BP286) Возможны два объяснения, которые не являются взаимоисключающими 1 Макрофаги могут быть более чувствительными к пептиду Т, чем Т-клетки, так как Тклетки принимают значительно больше сигналов потенциального активирования, чем CD4/MHC II взаимодействия Таким образом, введение пептида Т может понижающе регулировать макрофаги при добавлении его в первый день культивирования in vitro, ингибируя способность макрофагов к присутствующим митогенам и антигенам Т-клеток В-клетки могут действовать как АРС на месте макрофагов в присутствии антигенов, но не в присутствии митогенов, которые неспецифичны относительно антигенов (объяснение результатов таблицы 3) Оставшиеся В-клетки устойчивы к пептиду Т, так как они являются СО4-отрицательными В присутствии разовой дозы пептида Т они могут представлять антиген к Т-клеткам, позволяя пролиферацию РВМС в ответ на антиген Когда пептид Т добавляют ежедневно к культивируемым Тклеткам, которые могут быть менее чувствительны к действию пептида Т, то могут ингибироваться макрофаги Это может объяснить результаты, представленные в таблице 4 Ежедневное введение пептида Т in vivo может действовать не так, как при ежедневном введении in vitro, так как период полураспада пептида Т in vivo короче, чем in vitro In vitro сывороточные добавки инактивируют нагреванием для разрушения протеолитических ферментов, которые активно разрушают пептид Т in vivo Таким образом, ежедневное введение пептида Т in vivo будет давать в результате ингибирование активности макрофагов, но не активности Тклеток, и будет позволять дальнейшую экспрессию антигена, управляющего иммунной реакцией Это должно объяснить эффективность пептида Т в случае хронических воспалительных симптомов, таких как ревматоидный артрит (см ниже), где характеристические воспалительные клетки являются макрофагами Острое воспаление характеризуется нейрофильными (CD4 отрицательными) инфильтратами и не должно поддаваться действию пептида Т Требование представления антигена (фагоцитоз, разрушение и представление) в уп 1 83±0 36 0 98±0 16 1 56±0 14 1 38±0 51 1 56±0 61 1 60±0 60 2 27±1 09 равляемой антигеном иммунной реакции дает в результате задержку сигнала Т-клеток Следовательно, пептид Т, добавленный к культуре in vitro в первый день культивирования, не будет влиять на сигнал Т-клеток в последующие дни Стимуляция митогеном пролиферации РВМС (таблица 3) является промежуточным событием, не требующим действия антигена, и может быть ингибирована долгосрочным действием при конкурентном введении пептида Т Необходимо, чтобы пептид Т был представлен конкурентно с сигналом активации для проявления его иммунодепрессивного действия При хроническом воспалении или иммунном возбуждении все отвечающие клетки будут принимать сигналы пролиферации все время Ежедневное введение пептида Т in vivo ингибирует хроническое иммунное возбуждение Так как, время полураспада пептида Т составляет менее 1 часа (Ruff и др , Prog Neuro-Psychopharmacol & Biol Psychiat.T 15, ее 791-801 (1991)), будут ингибированы те сигналы пролиферации, которые возникнут в течение часа после введения пептида Т Так как все отвечающие на сигнал хронического возбуждения клетки отвечают постоянно, они будут регулироваться с понижением в течение этого 1 часа и останутся регулируемыми с понижением в течение длительного времени Вследствие дискретного расписания представления антигенов и того факта, что не все эпитопы антигена представлены в одно и то же время (следовательно, не все Т-клетки, способные отвечать, активируются одновременно), проходит 23 часа до следующей инъекции пептида Т, в которые исследуют антиген-специфические иммунные реакции Хотя некоторые антиген-специфические иммунные реакции можно ингибировать в течение 60 минут после введения пептида Т, большинство из них, которые происходят в дискретные моменты времени, будут продолжаться Таким образом, пептид Т способен ингибировать хроническое иммунное возбуждение и воспаление, разрешая в то же время экспрессию антиген-специфических иммунных реакций Пример 13. Артрит Мужчину 67 лет лечили ежедневным введением пептида Т (8,5 мг подкожно) от сильного псориаза, не поддающегося лечению всеми известными способами Кроме того, сопутствующим заболеванием был болезненный артрит колен, который хотя и присутствовал в течение более 10 лет, прогрессировал до такой степени, что не позволял 18 41881 Введение пептида Т продолжали в течение 10 дней После прекращения введения возобновилась гиперэстения, и в течение 2 дней пациентка принимала Toradol без заметного эффекта В течение следующих четырех дней из медицинских препаратов пациентка принимала только пептид Т, последовало полное освобождение от боли и гиперэстении и восстановление нормального сна Через 5 дней после прекращения введения пептида Т не произошло рецидива симптомов болезни, орального приема лекарств больше не потребовалось Пример 15. Синдром хронической утомляемости Женщина 45 лет с CFS выраженным сильной утомляемостью, требующей частого сна, головной болью, шумом в ушах, случаями диареи, депрессией, непереносимостью света (light headedness) и ослаблением слуховой памяти Она начала ежедневный прием пептида Т (8,5 мг подкожно) и отметила улучшения, произошедшие в течение недели Через два месяца она сообщила, что 50% ее проходят нормально Ее утомляемость снизилась, а оставшаяся усталость связана только с увеличением активности, которое стало возможным только после начала приема пептида Т Ее память улучшилась, а головные боли стали менее частыми Через три месяца после начала применения лекарства она стала себя чувствовать еще лучше Она могла гулять в течение продолжительного времени впервые за два года, частота головных болей снизилась почти до нуля Через пять месяцев приема лекарства ее утомляемость исчезла, она не испытывала головокружения и работала в саду, присматривала за детьми и снова ездила на машине на большие расстояния Пример 16. пациенту заниматься нормальной ежедневной деятельностью в течении шести месяцев до его первого визита Псориаз был только временно улучшен введением пептида Т, а боль в коленях начала проходить через три недели после начала приема лекарства Пациент не испытывал боли в течение трех месяцев, когда он продолжал лечение пептидом Т У него не было боли еще в течение двух месяцев после прекращения применения пептида Т, и он был способен вернуться к своей повседневной деятельности В течение восьми месяцев у него не было боли Серьезность артрита (до применения пептида Т) была такова, что ему посоветовали провести замену коленного сустава Такое драматическое избавление от боли является экстраординарно редким у пациентов с эрозивным ревматоидным артритом даже при оперативном лечении общепринятыми способами В течение этого времени он принимал только нестероидные противовоспалительные лекарства, которыми он пользовался в предыдущие два года Пример 14. Артрит Женщине 47 лет поставили диагноз артрит поверхности сустава в 1977, в течение следующего года она многократно обращалась за помощью Программа по разработке спины и упражнения дали в результате ремиссию до 1992 Сдавливающее повреждение позвоночника в мае 1992, повторившийся артрит поверхности суставов проявились в виде интенсивной гиперэстении левого бедра и тазобедренного сустава, прогрессируя за 8 часов и включив верхнюю часть ноги, что характерно для предыдущих случаев, которые обычно продолжались 3-4 недели, облегчение приносил постельный режим и нестероидные противовоспалительные препараты На следующий день боль усилилась и характеризовалась ощущением сильного жжения с острой болью в области поясницы, которую не облегчали препараты Toradol® или Naprosyn® (полная доза) Пациентка была прикована к постели в течение следующего дня, нарушения сна продолжались в течение 48 часов Через пять дней после этого случая пациентка получила MOS анкету для хронического заболевания и хронических болей спины в диапазоне 40 77 из 100 После этого дня ей дали пептид Т (10 мг подкожно), что снизило гиперэстению и дало возможность спать в течение 12 часов Оральный прием лекарств прекратили За следующий день прекратилась гиперэстения, сон был нормальный и только присутствовала очень мягкая боль в параспинальных мышцах В течение следующих 2 дней пациентке давали пептид Т, боль полностью прекратилась, и улучшились показатели MOS до 71 и 87,4 (эти значения сравнимы с показателями людей без острых или хронических заболеваний) Синдром хронической утомляемости Женщина 32 лет с EBV+, выраженным сильной утомляемостью в течение пяти месяцев, что не позволяет ей работать более 1 1/2 часа в день Предполагаемый диагноз, пост-инфекционная невромиастения, сделан на основании утомляемости, сниженной концентрированное™, слабость мышления, миалгия и фарингит За пять дней применения пептида Т (8,5 мг ежедневно подкожно) ее утомляемость значительно ослабла и полностью исчезла через месяц до такой степени, что она могла возобновить работу с полным рабочим днем и заниматься три раза в неделю гимнастикой Она принимала пептид Т в течение 35 дней и в течение шести месяцев симптомов не проявлялось Перед началом курса приема пептида Т и через 30 дней лечения состояние пациентки определяли при помощи прибора Patient Symptom Inventory (устройство для самооценки, которое измеряет глубину симптомов по шкале от 0 до 4), отмечены заметные улучшения всех симптомов День 0 День 30 0 0 2 1 2 3 2 3 3 4 Утомляемость Жизнеспособность Концентрация Замедленность мышления Трудность подбора слов Оказалось, что пептид Т действует как противовоспалительный агент Следовательно, пеп тид Т должен быть новым нестероидным противовоспалительным лекарством (NSAID) Такие тра 19 41881 диционные противовоспалительные лекарства, как аспирин и ибупрофен, имеют два потенциальных механизма действия ингибирование циклооксигеназы, снижающей производство простагландина, и ингибирование функции нейрофилов (Altman RD Arth Rheum 19 (Suppl 2) 1-5 (1990), Vane и др Postgrad Med J 66 (Suppl 4) 2-17 (1990)) Сообщают, что ингибирование циклооксигеназы усиливает (более, чем подавляет) пролиферацию РВМС, управляемую митогеном (Vane и др , Int J Immunopharmacol 5, 107-114 (1983)), а нейрофилы (CD4 отрицательный) должны быть устойчивы к пептиду Т, следовательно, пептид Т может иметь уникальный механизм противовоспалительного действия Противовоспалительный азатиоприн ингибирует пролиферацию лимфоцитов, ингибируя синтез ДНК и РНК Пролиферацию обоих лимфоцитов, В и Т, ингибируют, действуя азатиопорином (Bnggs, J D Immunol Lett 29, 89-94 (1991) Так как, клетки В являются CD4 отрицательными и могут действовать как АРС в присутствии пептида Т (см выше), пептид Т должен иметь механизм действия, отличающийся от механизма азатиоприна Циклоспорин является противовоспалительным лекарством, которое ингибирует пролиферацию лимфоцитов посредством ингибирования транскрипции IL-2 и IFN-y гена путем его связывания с циклоспорином и инактивации последнего, который является изомеразой, необходимой для трансдукции сигнала (Halloran и др, Clm Biochem 24, 3-7 (1991)) Так как, пептид Т может также действовать натрансдукцию сигнала (таблица 3), он не имеет сильных побочных действий, связанных с терапией циклоспоринами Побочные эффекты, вызванные циклоспорином, включают почечную тубулярную атрофию, нефротоксичность, гипертонию, гирсутизм, гипертрофию десны, треморы, конвульсии и парестезию (Bnggs J D Immunol Lett 29, 8994 (1991)) В практике применения настоящего изобретения не отмечено существенных побочных действий, присущих применению пептида Т для каждого эксперимента из исходного пептида 3 Т Н-Тимидин (5 Сі/ммоль) получают из Amersham Выделением РВМС цельную кровь от здорового взрослого донора погружают в гепарин и выделяют периферические моноядерные клетки крови (РВМС) посредством центрифугирования с градиентом плотности на Histopague M (Sigma Chemical Co) РВМС удаляют с поверхности раздела, промывают три раза в RPMI, содержащей гентамицин (100 цг/мл) и повторно суспендируют с концентрацией 1x106 РВМС/мл в RPMI, содержащей 10% сыворотку зародыша теленка и гентамицин 105 РВМС культивируют в присутствии 100 шп суспензии митогена в кювете с 96 ячейками Финальная концентрация митогена составляет PWM 25 Ш-/МЛ, РНА 12,5 цг/мл и Con A 6,25 цг/мл 10 цл рабочего раствора пептида Т (или RPMI в качестве отрицательного контроля) добавляют к суспензии и инкубируют культуры клеток всего 5 дней во влажной атмосфере 5% ССЬ, 37°С Затем на культуры воздействуют Н-тимидином (в RPMI) за 1824 часа до сбора Количество включенного 3Н-тимидином определяют, используя Beckman™ LS 8000 жидкостной сцинтилляционный счетчик, пролиферацию выражают как количество сцинтилляций в минуту (срт) или индекс пролиферации (PI) с р т для (РВМС + митоген) Pl = — с р т для (РВМС + среда) PI, равный 2, указывает на то, что количество клеток выросло в два раза по сравнению с оставшимся (нестимулированным) количеством Все эксперименты повторяли трижды Сообщенные результаты характеристичны для экспериментов по репликации Продуцирование фактора а некроза опухолей (TNF а) 5x106 РВМС/мл инкубируют в присутствии Con A (6,25 г/мл) в течение 48 часов во влажной атмосфере, 5% ССЬ, 37°С Добавляют пептид Т (10 9 М) в момент времени t = 0 и 24 часам В конце инкубации добавляют Sephadex™ G25 (Pharmacia), 10 цг/мл, и инкубируют в течение 10 минут для удаления митогена РВМС и Sephadex центрифугируют, а супернатант проверяют на уровень TNFa, используя прибор для радиоиммунного исследования TNFa из Amersham Образцы анализируют дважды Статистический анализ данные анализируют, применяя ANOVA-тест для двух образцов с 95% доверительным интервалом, таким, что р < 0,05 считают существенной разницей Пример 17. Пептид Т ингибирует пролиферацию лимфоцитов, индуцированную митогеном Конканавалин А (Соп А), митоген лаконоса (PWM) и фитогемагглютин-Р (РНА-Р) получают от Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA) Пептид Т синтезируют в Carlbiotech Ltd (Копенгаген, Дания) и поставляют в виде хлорида (раствора соли при 8,5 мг/мл в бензиловом спирте в качестве консерванта) и хранят при 4°С Пептид Т разбавляют до концентрации рабочего раствора в культуральной среде (RPMI) Разбавленный раствор пептида Т готовят свежим Таблица 7 1 х 105 РВМС культивировали в присутствии митогенов с пептидом Т (1x10 9 М), добавленным конкурентно с митогенами (день 1) или в последующие дни, как указано Клетки культивировали всего 6 дней Результаты выражены в виде индексов пролиферации ± стандартное отклонение PWM Без пептида Т Пептид Т день 1 день 2 день 3 день 4 СопА РНА 4 29±0 25 313±0 21 3 20±0 20 2 65±0 17 3 22±0 28 21 0±5 7 6 2±0 5 6 0±1 1 9 9±0 1 9 5±1 6 197±3 148±13 101 ±7 148±7 131±10 20 41881 Результаты Когда пептид Т добавляют в первый день культивирования, он способен ингибировать пролиферацию лимфоцитов в ответ на PWM (фиг 2а), Con А (фиг 2Ь) и РНА (фиг 2с) Пептид Т способен ингибировать РНА-стимулированные Р ВМС-культуры при концентрации 1x10 1 3 М Культуры, стимулированные Con А или PWM, пептид Т ингибирует при концентрации менее 1x10 1 М После введения in vivo пептид Т достигает максимальной концентрации плазмы 5,5 х 10 8 М, следовательно, опосредованная пептидом Т иммуномодуляция должна быть активной при концентрациях лекарства, легко достижимых в плазме и CSF Культуральная среда, которой разбавляют пептид Т, не оказывает воздействия на пролиферацию При наиболее эффективной концентрации используемого пептида пролиферацию лимфоцитов в ответ на РНА ингибируют на 26%, PWM - 38% и Con A - 36% дня), пролиферация лимфоцитов в присутствии пептида Т изменяется параллельно с ростом в отсутствие лекарства, но с меньшей скоростью (фиг 3) В отсутствие митогена пептид Т оказывает отрицательное действие на РВМС Следовательно, пептид Т не является цитотоксичным для реагирующих лимфоцитов, а также не дает задержки начала пролиферации Пептид Т позволяет клеткам расти, но с уменьшенной скоростью Пептид Т способен ингибировать пролиферацию лимфоцитов, индуцированную митогеном, будучи добавленным к РВМС после того, как они подвергались действию митогенов (таблица 7) Этот эффект присутствует даже тогда, когда пептид Т добавляют через три дня после воздействия митогена Ингибирование лимфопролиферации пептидом Т наиболее ясно, когда его добавляют к культурам, стимулированным Con A В дополнение к лимфопролиферации присутствие пептида Т снижает количество TNFa, выделяемого в супернатант (SN) РВМС-культуры, стимулированной в течение 48 часов Con А (таблица 8) Ни пептид Т, ни RPMI не проявляют какой-либо активности в RIA относительно TNFa В отсутствии Соп А в супернатанте культуры не детектируют TNFa Ингибирование пролиферации лимфоцитов может быть результатом цитотоксичности, задержкой инициирования пролиферации, снижением скорости роста или любой комбинацией указанных факторов Когда пролиферацию РВМС измеряют ежедневно в течение периода роста (2-4 Таблица 8 6 РВМС (5x10 РВМС/мл) культивировали втечение 48 часов в присутствии или в отсутствии Con A (6,25 цг/мл) ± пептид Т (10 9 М, добавляли одновременно с митогеном), уровни TNFa в супернатантах культур определяли, как описано TNFa (мол/100 мкп) < 1 < 1 69,0 ±6,9 47,0 ±0,1 RPMI + пептид Т PBMC+RPMI+пептид Т РВМС + Con A РВМС + Con А + пептид Т такие как Staphylococcal (энтеротоксины А и В (SEA и SEB) и токсин-І синдрома токсического шока (TSST-I) стимулируют рост приблизительно 20% от общего набора клеток (Sci Am 266, 92 (1992)) путем взаимодействия с определенными Vp сегментами TcR (Science 244, 811 (1989)) Анти-СОЗ способен стимулировать рост 100% Т-клеток, независимо от дополнительной функции клетки, путем прямого образования комплексов TcR/CD3 Так как, митогены представляют искусственную неспецифическую форму активации лимфоцитов, оценивают действие пептида Т на лимфопролиферацию в ответ на "воскресшие" антигены, анти-СОЗ, суперантигены и MLR Кроме того, исследовали функции эффекторов Т-клеток и рост самопроизвольно пролиферирующих линий злокачественных клеток в присутствии пептида Т Кроме отдельно указанных случаев условия экспериментов обычно были такими, как указано в примере 17 Пептид Т не ингибирует лимфопролиферацию, вызванную не митогенами При добавлении в первый день шестидневного культивирования пептид Т способен ингибировать лимфопролиферацию, индуцирован Пример 18. Пептид Т ингибирует лимфопролиферацию, индуцированную не митогеном В противоположность митогенам, которые индуцируют сигналы пролиферации лимфоцитов путем лигирования МО/MAC и Т-клеток через половинки углеводородов на разнообразные рецепторы поверхности клеток, стимулированная не митогенами лимфопролиферация опосредована "воскресшими" антигенами, суперантигенами, антителами к CD3 (анти-СОЗ) и аллогенными МНС молекулами и медленно взаимодействует с комплексом рецептор анти гена Т-клетки/СОЗ (TcR/CD3) В этом отношении немитогенные стимулы более специфичны, чем митогены На "воскресшие" антигены отвечают только те лимфоциты, которые комплементарны эпитопам возбужденных антигенов Обычно, они составляют небольшую фракцию общей совокупности лимфоцитов Реакции на аллогенные МНС, характеризующиеся смешанной реакцией лимфоцитов (MLR), опосредованы узнаванием инородных молекул МНС класса II рецепторами TCR отвечающих клеток (Adv Immunol 31_, 271 (1981)) Приблизительно 10% Т-клеток является аллореактивными (Lancet 339, 824 (1992)) Суперантигены, 21 41881 ную Соп А, но не оказывает никакого действия на лимфоциты, отвечающие на "воскресший" антиген (вакцины кори, паротита, краснухи, MMR), антитела к CD3 или суперантигены SEB и TSST-I (фиг 4) Аналогично, пептид Т не действует на рост лимфоцитов в смешанной реакции лимфоцитов (фиг 5) Molt-4 - это клеточная линия Т-лимфомы человека, р56|ск отрицательная, и Jurkat - это линия Т-клеток человека, р56|ск положительная, которая растет самопроизвольно в отсутствие экзогенного стимула Результаты, представленные в таблице 9, показывают, что пептид Т незначительно влияет на рост Molt-4 или Jurkat клеточных линий Таблица 9 Действие пептида Т на рост клеточных линий Растили две самопроизвольно растущие линии злокачественных Т-клеток человека (Jurkat и Molt-4) в отсутствие (Media - Р Т) или в присутствии (Media + Р Т) пептида Т, добавленного в первый день культивирования Рост измеряли по количеству включенного 3Н-тимидина, количество сцинтилляций в минуту (срт) не переводили в индекс пролиферации Большее значение с р т соответствует большему росту клеток День 1 День 2 ДеньЗ День 4 День 5 День 6 День 8 MolM День 1 День 2 ДеньЗ День 4 День 5 День 6 День 8 Media -P.T.(CMP±S.D.) 7445±261 14728±1349 41203±6127 50930±1030 80046±1072 109201±8805 113667±7266 Media -P.T.(CPM±S.D.) 6182±1296 13111±370 29175±5594 39920±3407 54686±1472 56824±3580 10835±264 Пегтгит Т не ингибирует опосредованное РВМС поражение Molt-4 клеток Когда РВМС смешивают с аллогенными клетками Molt-4, рост Molt4 ингибируется (фиг 6) Аллореактивные РВМС распознают Molt-4 в качестве инородных клеток и генерируют цитотоксичные эффекторные клетки, которые поражают Molt-4 Molt-4 не является цитотоксичной линией клеток и не может генерировать аллореактивные эффекторные клетки Когда к этой реакции добавляют пептид Т, на РВМС-опосредованное ингибирование Molt-4 пролиферации не оказывается никакого воздействия (фиг 6), предполагают, что пептид Т не действует на генерацию функций цитотоксичных эффекторов Различить рост аллореактивных Т-клеток от роста выживших Molt-4 не возможно, так как пептид Т не влияет ни на рост аллореактивных Т-клеток (фиг 5), ни на рост Molt-4 (таблица 9) Media +P.T.(CPM±S.D.) 8345±131 17441±1360 40002±1572 49852±1011 79748±8474 114967±7342 109144±14052 Media +P.T.(CPM±S.D.) 6639±726 15001±1509 32401±850 39839±10740 50269±5436 57570±4968 19510±4217 МО/MAC вовлечен в патогенез HIV-заболеваний Все МО/MAC экспрессируют CD4 (J Immunol Meth 135, 59 (1990)), и, следовательно, могут быть инфицированы HIV Предполагают даже, что МО/MAC может быть первой клеткой, которую инфицирует HIV в процессе инфицирования (Annal N Y Acad Sci 616, 1 (1990)) МО/MAC не так восприимчивы к инфицированию HIV, как CD4 положительные Т-клетки (TIPS 1_2, 28 (1991)) и могут быть ответственны за основание устойчивой или скрытой HIV-инфекции МО/MAC может быть ответственным за трансмиссию HIV в CNS, где он включает основной тип клеток, инфицированных HIV (Compr Ther 17, 57 (1991)) В CNS МО/MAC может опосредовать неврологическое нарушение, выделял нейротоксический др120 (Science 248, 364 (1990)), tat (J Virol 65, 961 (1991)) или производимые МО/MAC нейротоксины (Science 250, 1593 (1990)) Интересно отметить, что активированный МО/MAC включен в патогенез других неврологических заболеваний, таких как рассеянный склероз (Acta Neuropathol 80, 208 (1990), Pathol Immunopathol Res 6, 241 (1987), Ann Rev Immunol 1_0, 153 (1992) и болезни Альцгеймера (Eur Neurol 28, 30(1988)) Пример 19. Клетки линии дифференцировки моноцит/макрофаг (МО/MAC) являются долго живущими непролиферирующими клетками, которые характеризуют реакции хронических воспалений МО/MAC действуют как неспецифические фагоциты, клетки, представляющие антиген (инициирующие антиген-специфические иммунные реакции), как иммунорегуляторные клетки и цитотоксичные эффекторные клетки МО/MAC генерируют разнообразные внутриклеточные и внеклеточные цитотоксичные эффекторные молекулы, включая реактивные кислородные интермедиаты, лизосомные ферменты и альфа-фактор некроза опухолей (TNF) Инфицированный HIV МО/MAC демонстрирует дополнительную дисфункцию клеток (Clm Immunol Immunopathol 59, 436 (1991), J Immunol 146, 2297 (1991)) Кроме того, HIV индуцирует активацию МО/MAC, как показывает пониженные уровни неоптерина, маркера зависящей от Т-клеток активации МО/MAC, и пониженные уровни монокинов (TNF, IL-I и IL-6) 22 41881 In vitro МО/MAC можно активировать IFN-y и липополисахаридами (LPS), которые инициируют по крайней мере четыре различных межклеточных сигнала, включая избыточное выделение кальция (Immunol Today 10, 33 (1989)) Производство TNF можно инициировать IFN-активацией МО/MAC, но оно требует LPS для начала выделения (J Ехр Med 175 405(1992)) Предполагают, что роль TNF в HIV-заболеваниях основана на наблюдении, какие макрофаги пациентов с AIDS выделяют TNF в большем количестве, чем у нормального пациента (Am Rev Respir Dis 144, 195 (1991)), и повышенные уровни TNF связывают с движением от скрытой HIV - инфекции к AIDS (Am J Med 85,289(1988)) Потенциальные эффекты TNF, вносящие вклад в HIV патогенез, включают TNF-опосредованную кахексию (New Eng J Med 327, 329 (1992), J Nutr 122, 749 (1992)), аутокринное/паракринное уменьшение репликации HIV (Immunol Today V\_, 176 (1990)), гиперактивацию иммунной системы (Biotherapy 3, 127 (1991)), ингибирование Zidovudme (AZT = азидодезокситимидина), ddl и ddC (VIII Int Conf AIDS Abst # PoA 2326 (1992), J Intern Med 228, 549 (1990)), распространение аутореактивного СО4-специфического CTL (VIII Int Conf AIDS Abst # PoA 2365 (1992), поражение миелина и олигодендроцитов (AIDS 5, 1405 (1991)), цитопению (Am Rev Respir Dis 144, 195 (1991)) и апоптоз (Immunol Ser 56, 315 (1992)) TNF также вовлечен в патогенез рассеянного склероза TNF является цитотоксичным для производящих миелин олигодендроцитов (Ann Rev Immunol 10, 153 (1992)) и может вызывать повреждение миелина прямо давая волдыри и опухание миелиновогослоя (Annal Neural 23,339(1988)) Методы исследования Исследование цитотоксичности макрофагов Определение МО/MAC цитотоксичности является двухстадийным исследованием После выделения сросшихся клеток (в основном, МО/MAC) от РВМС МО/MAC активируют лимфокинами (включая IFNгамма и LPS) После промывания, которое удаляет активаторы, к активированным МО/MAC добавляют меченные 3Н тимидином К562-клетки и инкубируют в течение 3 дней Степень цитотоксичности пропорциональна количеству радиоактивных меток, выделившихся в супернатант культуры, и представлена следующей схемой РВМС Сросшиеся клетки (1 час, 37°С на пластике) Стадия 1 активация (8 часов) цитокины LPS (1 цг/мл) Стадия 2 Эффектор (3 дня) 3Н-Т К562 Выделение Н-Т Цитотоксичность супернатанта МО/MAC Супернатант (SN) активированных МО/MAC собирают с монослоев сросшихся клеток, производных РВМС, которые подвергаются действию LPS в течение 23 часов Этот супернатант проверяют на цитотоксическую активность против 3Н-тимидинмеченных клеток К562 в 48 часовом эксперименте, проводимом при 37°С SN выдерживают при 4°С в течение ночи или хранят в замороженном виде при -20°С в течение более долгого периода перед использованием Результаты Пептид Т ингибирует МО/МАС-опосредованную цитотоксичность Присутствие пептида Т на различных стадиях эксперимента по проверке цитотоксичности демонстрирует, что, так как пептид Т не действует на способность оставшихся МО/MAC активироваться, он способен ингибировать цитотоксичность активированного МО/МАС (фиг 7) Пептид Т не влияет на активность лекарства, будет ли он добавлен одновременно с мечеными клетками или ежедневно при культивировании Лечение пептидом Т снижает уровень неоптерина, но зависящее от пептида Т уменьшение неогтгерина сыворотки не связано с уменьшением IL-I сыворотки Когда проверяют сыворотки пациентов с зависимыми от пептида Т сниженными уровнями неогтгерина (уровень которого изначально был повышенным) на IL-I, не находят корреляции между двумя значениями (таблица 10) Однако, уровни неоптерина до введения пептида Т являются повышенными, вто время, как уровни IL-I сыворотки нормальные Таблица 10 Концентрации сывороточных IL-I и неоптерина Сыворотку берут у пациентов с HIV-заболеваниями и хранят при -20°С Концентрации неоптерина и IL-I определяют методом RIA (радиоиммуноанализа) Значения IL-I и неоптерина до и после введения пептида Т определяют для одних и тех же образцов сыворотки Пациент норм BL CI TS LB BG ВС IM RH [Неоптерин] (нМ) [IL-l](fMonb/100jin) до пептида Т 4±0 03 4 1±0 03 3 7±0 03 4 2±0 14 3 9±0 13 4 35±0 06 3 5±0 14 5 23±0 17 4 1±0 01 после пептида Т N/A 4 7±0 05 4 2±0 02 4 2±0 26 4 35±0 003 4 6±0 02 3 8±0 12 4 2±0 07 4 6±0 11 23 до пептида Т ND ND ND ND ND 52 0±4 0 47 3±0 8 27 8±0 8 13 15±2 85 после пептида Т ND ND ND ND ND 16 85±0 05 32 5±3 5 19 75±0 25 8 9±0 6 41881 Пептид Т ингибирует цитотоксичность супернатантов МО/МАС-культур Способность супернатантов МО/МАС-культур лизировать меченные К562-клетки определяют в присутствии пептида Т SN культур МО/MAC используют с финальным разбавлением 1 6 в ячейках культивирования Как показано на фиг 8, пептид Т способен блокировать лизис К562, опосредованный SN МО/MAC, даже при концентрации 1x10 13 М Пример 20. Пептид Т оказывает аналогичное действие на анти-скарификатор в ингибировании действия TNF 105 РВМС культивируют в присутствии PWM, Con А или РНА (см пример 17) Параллельно с митогеном к культурам добавляют пептид Т (10 9 М), анти-TNF МоАЬ # 47 при разбавлении 1 200 (анти-TNF) или их комбинацию После пяти дней инкубации на культуры воздействуют 3Н-тимидином за 18-24 часа до сбора Количество включенного 3Н-тимидина переводят в индекс пролиферации (см пример 17) Данные анализируют методом A NOVA для двух образцов, используя 95% доверительные интервалы Пример 21. Пептид Т снижает уровни TNF сыворотки у HIV-пациентов У пациентов с IV стадией HIV-заболевания определяют уровни TNF сыворотки до и после лечения пептидом Т Пациенты прини мают лекарство от 2 недель до 11 месяцев Результаты представлены на фиг 10 Повышение уровня TNF сыворотки у пациента BG связано с развитием условно-патогенной инфекции Пример 22. Пептид Т пролонгирует жизнь мышам с чувствительностью, повышенной действием D-галактозамина, модель септического шока Пятьдесят мышей BALB/c/Swiss (самки, 1-ое скрещивание) приблизительно 8-недельного возраста разбили на пять групп и давали им следующие дозы 1 16 мг D-галактозамина + 20 jirTNF+bbO 2 16мг D-галактозамина + 20 цг TNF + МАЬ 47 3 16 мг D-галактозамина + 20 jj.rTNF+100 цг пептида Т 4 16 мг D-галактозамина 20 jj.rTNF+10 пептида Т 5 16 мг D-галактозамина + 20 цг TNF + 1 пептида Т D-Галактозамин повышает чувствительность мышей к действию TNF в этих экспериментальных моделях септического шока МАЬ 47 является анти-TNF моноклональным антителом широкого действия, получаемым от Peptide Technology Limited Через 12 часов оценивали защитное действие пептида Т Полученные результаты приведены в таблице 11 Таблица 11 А 1 2 3 4 5 в С D Е F G н 0 0 0 1 1 0 4 1 1 1 0 10 8 5 2 0 4 1 3 2 0 2 1 1 1 0 3 1 1 0 0 6 2 0 0 0 10 8 5 1 Параметры Живые 0 14 9 7 4 Доза TNF TNF+ j I Индекс пролиферации +/- квадратичн.откл. ~~т— 1 \ і \ \ \ \ m \ * \ \ 1 1 k е \ H \ \ •• і і \ | | —1 Ф \ і ч \ а \ \ \ \ \ -п 1 1 \ \ \ СП "H \ \ \ S О \ \ \ г~\ і і і 1 ! со \ \ • \ 1 • • 1 і \ \ 1 \ \ і 1 ті і і і 1Л і \H • \ 1 № О \ о 1Л j \ \ \ 1 о • ч і і 1 \ . \ \ о 1 1 1 со л о о | 1 \ О UJ О о Индекс пролиферации +/- квадратичн. откл, \ \ ОЭ ОЭ Н \ \ N \, \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ Индекс пролиферации Колличество сцинтилляций счетчика в минуту +/- квадратичн.откл. СРМ •/ - SD О СО О е е СО СО о о о н + я