Модифікація рекомбінантного аденовірусу імуногенними епітопами білка circumsporozoite плазмодія

Реферат: Винахід належить до рекомбінантного аденовірусу, що отриманий із плазмідного вектора на основі рекомбінантного аденовірусу, де плазмідний вектор на основі рекомбінантного аденовірусу містить послідовність нуклеотидів, яка кодує ген білка circumsporozoite плазмодія (Plasmodium) або його антигенної частини, функціонально зв'язаний із послідовністю гетерологічного промотору, і один або більше генів модифікованих білків капсиду і/або серцевини, причому послідовність імуногенного епітопу білка circumsporozoite плазмодія була вбудована щонайменше в частину одного або декількох генів білків капсиду або серцевини або заміщує вказану частину, і де послідовність імуногенного епітопу являє собою послідовність епітопу, що розпізнається В-лімфоцитами, яка вибрана з (NANP)12, (NANP)14, (NANP)16, (NANP)18, (NANP)20 або (NANP)22. UA 108081 C2 (12) UA 108081 C2 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пріоритет [0001] Дана заявка претендує на пріоритет і являє собою часткове продовження міжнародної заявки № PCT/US09/054212 від 18 серпня 2009 року, яка повністю включена так само, якби вона була повністю наведена в даному описі. Заява про дослідження, фінансоване з федерального бюджету [0002] Даний винахід був зроблений за підтримки держави в рамках Гранту № 1R01AI 081510-01A1 Національного інституту алергії та інфекційних захворювань (NIAID), установи, яка входить до складу Національних інститутів здоров'я. Держава має певні права на даний винахід. Область техніки [0003] Даний винахід відноситься до області медицини й біотехнології. Більш конкретно, винахід відноситься до застосування векторів на основі аденовірусів із модифікованим капсидом для індукції ефективної імунної відповіді на антиген малярійних плазмодіїв, такий як білок circumsporozoite плазмодію, придатний для одержання вакцин від малярії. Рівень техніки [0004] Малярія – тяжке захворювання, що входить до числа найпоширеніших інфекцій у тропічних областях. Щорічно інфікується приблизно 300-500 мільйонів людей, і відсоток захворюваності й смертності є відносно високим. Протікання з ускладненнями і смертність особливо характерні для молодих людей і дорослих, які попадають у ендемічні області малярії і раніше не переносили малярію. За оцінками Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я (ВООЗ) 2-3 мільйони дітей щорічно вмирає від малярії в одній тільки Африці. Широке поширення та зростаюча в багатьох країнах частота виникнення малярії, яка викликається резистентними до лікарських препаратів плазмодіями (Plasmodium falciparum, а останнім часом також Plasmodium vivax) і стійкими до інсектицидів переносниками (малярійний комар), указують на необхідність розробки нових способів боротьби з даним захворюванням (Nussenzweig and Long 1994). [0005] Малярійні плазмодії відрізняються складним життєвим циклом, який включає прееритроцитарні, еритроцитарні та статеві форми паразитів; їхній життєвий цикл є потенційною мішенню для розробки вакцин від малярії. Прееритроцитарні та еритроцитарні форми виявляються в організмі хазяїна, а статеві форми існують у організмі переносника інфекції. Було показане, що вакцинація живими, ослабленими опроміненням спорозоїтами (IrSp) викликає стерильний захист (наприклад, повна резистентність відносно інфікування плазмодіями) у мишей (Nussenzweig et al. 1967), приматів, які не є людиною (Gwadz et al. 1979), і у людей (Clyde et al. 1973, Edelman et al. 1993). Захист, забезпечуваний IrSp, обумовлений нейтралізацією спорозоїтів за рахунок розвитку як гуморальної (B-лімфоцити), так і клітинної (Тлімфоцити) імунної відповіді (Tsuji et al. 2001). Хоча вакцинація IrSp являє собою привабливе рішення, єдиний спосіб одержання спорозоїтів – це розтин слинних залоз комара, і до теперішнього часу технологія вирощування великої кількості спорозоїтів in vitro не відома. Отже, потрібен альтернативний вектор для вакцинації, який може забезпечувати такий самий сильний захисний імунітет проти малярії. [0006] Однією з перспективних мішеней для створення такого вектора вакцини є білок circumsporozoite (CS), який експресується на поверхні спорозоїта. Ефективні нейтралізуючі антитіла спрямовані проти імунодомінантних, видоспецифічних повторюваних доменів білка circumsporozoite (CS). У Plasmodium falciparum (паразит, який викликає малярію у людини) повтори (NANP)n є консервативними в ізолятах із усіх регіонів світу. Цей центральний повтор містить множинні повтори епітопів, які розпізнаються B-лімфоцитами, і, відповідно, білок CS може викликати сильну гуморальну імунну відповідь, запускаючи реакцію В-лімфоцитів (Tsuji et al. 2001). В області С-кінця білка CS є кілька епітопів, які розпізнаються Т-лімфоцитами і які можуть викликати сильну клітинну імунну відповідь (Tsuji et al. 2001). Гуморальна відповідь (антитіла) може призводити до знищення паразитів у результаті взаємодії та нейтралізації інфікувальної здатності спорозоїтів (позаклітинного плазмодію) до попадання в гепатоцит, а клітинна відповідь (відповідь Т-лімфоцитів) може бути спрямована на EEF (внутрішньоклітинні форми плазмодію) за рахунок секреції інтерферона-гама. Зазначені види імунної відповіді запобігають дозріванню і швидкому поділу EEF, у ході яких утворюються тисячі спорозоїтів, які повертаються в кров і інфікують еритроцити, викликаючи захворювання, визначене як малярія. [0007] Було показано, що одна з вакцин від малярії, яка в теперішній час проходить клінічні випробування і являє собою химерний білок RTS, S "GlaxoSmithKline", який складається з поверхневого антигену вірусу гепатиту В та частини білка circumsporozoite плазмодію falciparum (PfCSP) у формі вірусоподібної частки (Заявка на Міжнародний патент № PCT/EP1992/002591 для компанії "SmithKline Beecham Biologicals S.A." від 11 листопада 1992 р.), зменшує інфікування малярією в клінічних дослідженнях (Alonso et al. 2004, Alonso et al. 2005, Bejon et al. 2008). RTS, S викликає розвиток анти-PfCSP гуморальної імунної відповіді, але відносно слабку 1 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 PfCSP-специфічну клітинну відповідь (CD8+) (Kester et al. 2008), що може послужити причиною відносно слабкого захисту, забезпечуваного RTS, S. Напроти, вакцини від малярії на основі аденовірусу можуть викликати захисну клітинну імунну відповідь (Заявка на Міжнародний патент № PCT/EP2003/051019, від 16 грудня 2003 р., Rodrigues et al. 1997). Однак у теперішній час існують дві перешкоди, що обмежують застосування системи на основі аденовірусу як вакцини проти малярії: (1) нездатність викликати ефективну гуморальну відповідь на трансгенний продукт, і (2) передіснуючий імунітет на аденовіруси, зокрема, на аденовірус серотипу 5, який знижує імуногенність вакцини на основі аденовірусу. [0008] Один із підходів, які недавно були взяті на озброєння в роботах із підвищення імунної відповіді, яка викликається аденовірусом, полягає у вбудовуванні епітопа антигену, який розпізнається В-лімфоцитами (наприклад, епітопа бактерії або вірусу), в білки капсида аденовірусу, такі як гексон, білок нитки, пентон і pIX (Worgall et al. 2005, McConnell et al. 2006, Krause et al. 2006, Worgall et al. 2007). [0009] Крім того, щоб обійти проблему передіснуючого імунітету на аденовірус серотипу 5 (Ad5), як платформу для вакцини досліджували аденовіруси інших, менш поширених серотипів, такі як 11, 35, 26, 48, 49 і 50, і було показано, що вони викликають імунну відповідь на трансген, незважаючи на наявність анти-Ad5 імунітету (Заявка на Міжнародний патент № PCT/EP2005/055183 Crucell Holland B.V., від 12 жовтня 2005 р., Abbink et al. 2007). Також, щоб обійти проблему передіснуючого анти-Ad5-імунітету, була розроблена заміна гексона Ad5, який є цільовим білком капсида для нейтралізуючих антитіл, на гексони інших серотипів (Wu et al. 2002, Roberts et al. 2006). [0010] Однак відомостей про покращений вектор на основі аденовірусу, який дозволяв би перебороти обидві зазначені перешкоди одночасно при застосуванні вектора на основі аденовірусу для одержання вакцини проти малярії, у теперішній час немає. У зв'язку з високим поширенням серотипу Ad5 в областях, ендемічних за малярією (Ophorst et al. 2006.), виникає потреба в протималярійній вакцині на основі аденовірусу, яка викликає захисну гуморальну й клітинну імунну відповідь навіть при наявності передіснуючого імунітету до аденовірусу. Сутність винаходу [0011] Даний опис відноситься до різних модифікацій білків аденовірусу, спрямованих на збільшення імунної відповіді на трансген рекомбінантної аденовірусної вакцини і на подолання передіснуючого імунітету до аденовірусу. [0012] Більш конкретно, один варіант реалізації відноситься до рекомбінантного аденовірусу, отриманого з плазмідного вектора на основі рекомбінантного аденовірусу, причому плазмідний вектор на основі рекомбінантного аденовірусу містить послідовність нуклеотидів, яка кодує (i) білок circumsporozoite плазмодію або його антигенну частину, функціонально пов'язану з гетерологічним промотором; і (ii) модифікований білок капсида або серцевини, причому імуногенний епітоп circumsporozoite плазмодію вбудований щонайменше в частину одного білка капсида і/або серцевини або заміщає зазначену частину. [0013] Згідно з деякими варіантами реалізації білок circumsporozoite плазмодію також включає білок circumsporozoite Plasmodium falciparum або Plasmodium yoelii. Білок circumsporozoite також може включати білок із оптимізацією кодонів circumsporozoite Plasmodium falciparum або Plasmodium yoelii, і згідно з деякими аспектами може кодуватися послідовністю нуклеотидів SEQ ID або SEQ ID NO:1 відповідно. [0014] Згідно з іншими варіантами реалізації імуногенний епітоп також включає епітоп circumsporozoite плазмодію, який розпізнається В-лімфоцитами. Епітоп, який розпізнається Влімфоцитами, може бути вбудований у модифікований білок капсида, і згідно з деякими аспектами білок капсида може включати гіперваріабельну ділянку гексона (HVR). HVR може також включати HVR1 або HVR5, у яких частина HVR1 або HVR5 замінена епітопом, який розпізнається В-лімфоцитами. Згідно з іншими аспектами білок капсида може також включати білок нитки капсида, в якому епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами, вбудований у білок нитки. Згідно з деякими аспектами епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами, являє собою білок circumsporozoite Plasmodium falciparum, у якому епітоп, який розпізнається Влімфоцитами, являє собою послідовність повтору, наприклад, (NANP) n (SEQ ID NO:60), причому послідовність повтору може являти собою (NANP)4, (NANP)6, (NANP)8, (NANP)10, (NANP)12, (NANP)14, (NANP)16, (NANP)18, (NANP)20, (NANP)22 or (NANP)28. Згідно з іншим аспектом епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами, являє собою епітоп білка circumsporozoite Plasmodium yoelii, у якому епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами, являє собою послідовність повтору, наприклад, (QGPGAP)n (SEQ ID NO:59), причому послідовність повтору може являти собою (QGPGAP)3, (QGPGAP)4, (QGPGAP)5, (QGPGAP)6, (QGPGAP)7, (QGPGAP)8, (QGPGAP)9, (QGPGAP)11, or (QGPGAP)12. 2 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0015] Згідно з іншими варіантами реалізації імуногенний епітоп також включає епітоп circumsporozoite плазмодію, який розпізнається CD4+ або CD8+ T-лімфоцитами. Епітоп, який розпізнається CD4+ або CD8+ T-лімфоцитами, може бути вбудований у модифікований білок капсида або серцевини. Згідно з деякими аспектами білок капсида може включати гіперваріабельну ділянку гексона (HVR). HVR може також містити HVR1, у якому частина HVR1 заміщена епітопом, який розпізнається CD4+ або CD8+ T-лімфоцитами. Згідно з іншими аспектами білок капсида може також включати білок pVII, і епітоп, який розпізнається CD4+ або CD8+ T-лімфоцитами, введений у білок pVII. Згідно з деякими аспектами епітоп, який розпізнається CD4+ T-лімфоцитами, являє собою білок circumsporozoite Plasmodium falciparum, причому епітоп, який розпізнається CD4+ T-лімфоцитами, являє собою EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT (SEQ ID NO:62). Згідно з іншими аспектами епітоп, який розпізнається CD4+ T-лімфоцитами, являє собою епітоп білка circumsporozoite Plasmodium yoelii, причому епітоп, який розпізнається CD4+ T-лімфоцитами, являє собою YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK (SEQ ID NO:61). [0016] Інші варіанти реалізації відносяться до фармацевтичної композиції або композиції вакцини проти малярії, яка включає рекомбінантний аденовірус відповідно до варіантів реалізації, перерахованих вище. Додаткові варіанти реалізації включають спосіб лікування, профілактики або діагностики малярії, який включає введення терапевтичної кількості фармацевтичної композиції або композиції вакцини проти малярії відповідно до варіантів реалізації, перерахованих вище. [0017] Згідно зі ще одним варіантом реалізації запропонований спосіб лікування, який включає проведення первинної-підтримуючої вакцинації, при якій суб'єкту вводять серію зростаючих доз або однакових доз через задані періоди часу. Періоди часу можуть бути будьякої тривалості, достатньої для того, щоб викликати гуморальну і/або клітинну імунну відповідь. Наприклад, як описано нижче, період часу може становити 3 тижні, але не обмежується цим. Короткий опис рисунків [0018] На Фіг. 1 наведена структурна схема рекомбінантного аденовірусу з модифікованим капсидом відповідно до варіантів реалізації даного винаходу. [0019] На Фіг. 2 наведена структурна схема, яка ілюструє конструкцію ДНК HVR1модифікованого аденовірусу, складової рекомбінантного плазмідного вектора на основі HVR1модифікованого аденовірусу. [0020] На Фіг. 3 наведена структурна схема, яка ілюструє конструкцію ДНК HVR5модифікованого аденовірусу, складової плазмідного вектора на основі рекомбінантного HVR5модифікованого аденовірусу. [0021] На Фіг. 4 наведена структурна схема, яка ілюструє конструкцію ДНК модифікованого за білком нитки аденовірусу, складової плазмідного вектора на основі модифікованого за білком нитки рекомбінантного аденовірусу. [0022] На Фіг. 5 наведена структурна схема, яка ілюструє конструкцію ДНК модифікованого за HVR1 і білком нитки аденовірусу, складової плазмідного вектора на основі модифікованого за HVR1 і білком нитки аденовірусу. [0023] На Фіг. 6 наведена структурна схема, яка ілюструє конструкцію ДНК модифікованого за білком нитки і pVII аденовірусу, складової плазмідного вектора на основі модифікованого за білком нитки і pVII аденовірусу. [0024] На Фіг. 7 наведена структурна схема, яка ілюструє конструкцію ДНК HVR1- і pVIIмодифікованого аденовірусу, складової плазмідного вектора на основі HVR1- і pVIIмодифікованого аденовірусу. [0025] На Фіг. 8 наведена структурна схема, яка ілюструє конструкцію ДНК, модифікованого за HVR1, білком нитки і pVII аденовірусу, складової плазмідного вектора на основі модифікованого за HVR1, білком нитки і pVII аденовірусу. [0026] На Фіг. 9 наведена послідовність нуклеїнової кислоти білка circumsporozoite Plasmodium yoelii з оптимізованими кодонами (PyCS, SEQ ID NO:1) і відповідна послідовність амінокислот (SEQ ID NO:30). [0027] На Фіг. 10 наведена послідовність нуклеїнової кислоти білка circumsporozoite Plasmodium falciparum з оптимізованими кодонами (PfCSP, SEQ ID ) і відповідна послідовність амінокислот (SEQ ID NO:43). [0028] На Фіг. 11 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить три повтори послідовності епітопа PyCS, який розпізнається Влімфоцитами, (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=3) в HVR1(SEQ ID NO:3, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:31, амінокислоти). Вбудована послідовність (QGPGAP)3 підкреслена. [0029] На Фіг. 12 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого 3 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гексона, який містить чотири повтори послідовності епітопа PyCS, який розпізнається Влімфоцитами, (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=4) в HVR1(SEQ ID NO:4, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:32, амінокислоти). Вбудована послідовність (QGPGAP)4 підкреслена. [0030] На Фіг. 13 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить п'ять повторів послідовності епітопа PyCS, який розпізнається Влімфоцитами, (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=5) в HVR1(SEQ ID NO:5, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:33, амінокислоти). Вбудована послідовність (QGPGAP)5 підкреслена. [0031] На Фіг. 14 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить шість повторів послідовності епітопа PyCS, який розпізнається Влімфоцитами, (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=6) в HVR1(SEQ ID NO:6, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:34, амінокислоти). Вбудована послідовність (QGPGAP)6 підкреслена. [0032] На Фіг. 15 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить сім повторів послідовності епітопа PyCS, який розпізнається Влімфоцитами, (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=7) в HVR1(SEQ ID NO:7, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:35, амінокислоти). Вбудована послідовність (QGPGAP)7 підкреслена. [0033] На Фіг. 16 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить вісім повторів послідовності епітопа PyCS, який розпізнається Влімфоцитами, (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=8) в HVR1(SEQ ID NO:8, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:36, амінокислоти). Вбудована послідовність (QGPGAP)8 підкреслена. [0034] На Фіг. 17 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить дев'ять повторів послідовності епітопа PyCS, який розпізнається Влімфоцитами, (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=9) в HVR1(SEQ ID NO:9, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:37, амінокислоти). Вбудована послідовність (QGPGAP)9 підкреслена. [0035] На Фіг. 18 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить одинадцять повторів послідовності епітопа PyCS, який розпізнається Влімфоцитами, (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=11) в HVR1(SEQ ID NO:10, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:38, амінокислоти). Вбудована послідовність (QGPGAP)11 підкреслена. [0036] На Фіг. 19 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить дванадцять повторів послідовності епітопа PyCS, який розпізнається Влімфоцитами (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=12) в HVR1(SEQ ID NO:11, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:39, амінокислоти). Вбудована послідовність (QGPGAP)12 підкреслена. [0037] На Фіг. 20 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить чотири повтори послідовності епітопа PfCSP, який розпізнається Влімфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=4) в HVR1(SEQ ID NO:12, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:44, амінокислоти). Вбудована послідовність (NANP)4 підкреслена. [0038] На Фіг. 21 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить шість повторів послідовності епітопа PfCSP, який розпізнається Влімфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=6) в HVR1(SEQ ID NO:13, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:45, амінокислоти). Вбудована послідовність (NANP)6 підкреслена. [0039] На Фіг. 22 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить вісім повторів послідовності епітопа PfCSP, який розпізнається Влімфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=8) в HVR1(SEQ ID NO:14, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:46, амінокислоти). Вбудована послідовність (NANP)8 підкреслена. [0040] На Фіг. 23 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить десять повторів послідовності епітопа PfCSP, який розпізнається Влімфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=10) в HVR1(SEQ ID NO:15, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:47, амінокислоти). Вбудована послідовність (NANP)10 підкреслена. [0041] На Фіг. 24 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить дванадцять повторів послідовності епітопа PfCSP, який розпізнається Влімфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=12) в HVR1 (SEQ ID NO:16, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:48, амінокислоти). Вбудована послідовність (NANP)12 підкреслена. [0042] На Фіг. 25 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить чотирнадцять повторів послідовності епітопа PfCSP, який розпізнається Влімфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=14) в HVR1 (SEQ ID NO:17, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:49, амінокислоти). Вбудована послідовність (NANP)14 підкреслена. [0043] На Фіг. 26 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить шістнадцять повторів послідовності епітопа PfCSP, який розпізнається Влімфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=16) в HVR1 (SEQ ID NO:18, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:50, амінокислоти). Вбудована послідовність (NANP)16 підкреслена. [0044] На Фіг. 27 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого 4 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гексона, який містить вісімнадцять повторів послідовності епітопа PfCSP, який розпізнається Влімфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=18) в HVR1 (SEQ ID NO:19, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:51, амінокислоти). Вбудована послідовність (NANP)18 підкреслена. [0045] На Фіг. 28 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить двадцять повторів послідовності епітопа PfCSP, який розпізнається Влімфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=20) в HVR1 (SEQ ID 0, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:52, амінокислоти). Вбудована послідовність (NANP)20 підкреслена. [0046] На Фіг. 29 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить двадцять два повтори послідовності епітопа PfCSP, який розпізнається Влімфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=22) в HVR1 (SEQ ID 1, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:53, амінокислоти). Вбудована послідовність (NANP)22 підкреслена. [0047] На Фіг. 30 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить двадцять вісім повторів послідовності епітопа PfCSP, який розпізнається В-лімфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=28) в HVR1 (SEQ ID 2, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:54, амінокислоти). Вбудована послідовність (NANP)28 підкреслена. [0048] На Фіг. 31 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого гексона, який містить три повтори послідовності епітопа PyCS, який розпізнається Влімфоцитами (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=3) в HVR5 (SEQ ID 3, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:40, амінокислоти). Вбудована послідовність (QGPGAP)3 підкреслена. [0049] На Фіг. 32 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого білка нитки, який містить три повтори послідовності епітопа PyCS, який розпізнається Влімфоцитами (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=3) у послідовності білка нитки (SEQ ID 4, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:41, амінокислоти). Вбудована послідовність (QGPGAP)3 підкреслена. [0050] На Фіг. 33 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого білка нитки, який містить чотири повтори послідовності епітопа PfCSP, який розпізнається Влімфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=4) у послідовності білка нитки (SEQ ID 5, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:55, амінокислоти). Вбудована послідовність (NANP)4 підкреслена. [0051] На Фіг. 34 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого білка pVII, який містить послідовність епітопа PyCS, який розпізнається CD4+-лімфоцитами, YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK, (SEQ ID NO:61) в N-кінці pVII (SEQ ID 6, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:42, амінокислоти). Вбудована послідовність YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK підкреслена. [0052] На Фіг. 35 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого білка pVII, який містить послідовність епітопа PfCSP, який розпізнається CD4+-лімфоцитами, EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT, (SEQ ID NO:62), у С-кінці pVII (pVII-1; SEQ ID 7, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:56, амінокислоти). Вбудована послідовність EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT підкреслена. [0053] На Фіг. 36 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого білка pVII, який містить послідовність епітопа PfCSP, який розпізнається CD4+-лімфоцитами, EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT, (SEQ ID NO:62), перед першим клітинним сигналом внутрішньоядерної локалізації (NLS) pVII (pVII-2; SEQ ID 8, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:57, амінокислоти). Вбудована послідовність EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT підкреслена. [0054] На Фіг. 37 наведені послідовності нуклеїнової кислоти й амінокислот модифікованого білка pVII, який містить послідовність епітопа PfCSP, який розпізнається CD4+-лімфоцитами, EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT, (SEQ ID NO:62), між двома NLS білка pVII (pVII-3; SEQ ID 9, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:58, амінокислоти). Вбудована послідовність EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT підкреслена. [0055] На Фіг. 38 показана експресія білка PyCS у клітинах AD293 після тимчасової трансфекції вектором PyCS-GFP/pShuttle-CMV. Білок PyCS визначали методом вестернблоттінгу з застосуванням моноклональних анти-PyCS антитіл миші (9D3). [0056] На Фіг. 39 показані результати зафарбовування сріблом і вестерн-блоттінгу (А) і твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) (В) очищених рекомбінантних аденовірусів PyCS-GFP з модифікованим капсидом, які проводять для підтвердження вбудовування епітопа (QGPGAP)3 (SEQ ID NO:59; n=3) в білки капсида аденовірусу. При проведенні ELISA планшети для ELISA покривали безпосередньо очищеними аденовірусами, і визначали вбудований епітоп у частках аденовірусу за допомогою анти-PyCS антитіла. [0057] На Фіг. 40 показані результати зафарбовування сріблом і вестерн-блоттінгу (А) і ELISA (В) очищених рекомбінантних аденовірусів PyCS з модифікованим капсидом, які проводять для підтвердження вбудовування епітопа (QGPGAP) n (SEQ ID NO:59) у білки капсида аденовірусу. При проведенні ELISA планшети для ELISA покривали безпосередньо очищеними 5 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аденовірусами, і визначали вбудований епітоп у частках аденовірусу за допомогою анти-PyCS антитіла. [0058] Фіг. 41 ілюструє режим однократної вакцинації аденовірусами PyCS з модифікованим капсидом, які мають повтори (QGPGAP) n (SEQ ID NO:59, n=3, 4, 5, 6, 9, 12) (A), і CD8+-відповідь, що розвивається через два тижні після вакцинації (В). [0059] Фіг. 42 ілюструє режим первинної й підтримуючої вакцинації аденовірусами PyCS з модифікованим капсидом, які мають повтори (QGPGAP)n (SEQ ID NO:59, n=3) (A), PyCSспецифічні гуморальні відповіді до тижня 10 (В) і концентрацію малярійного плазмодію в печінці через 42 години після інфікування спорозоїтом (С). [0060] На Фіг. 43 показаний титр антитіл проти спорозоїта, визначуваний методом непрямого імунофлуоресцентного аналізу (ІФА) (А) і за нейтралізуючою активністю стосовно спорозоїта in vitro (В) в об'єднаних пробах сироватки, отриманих від мишей, підданих вакцинації відповідно до режиму на Фіг. 42. [0061] Фіг. 44 ілюструє режим первинної й підтримуючої вакцинації аденовірусами PyCS з модифікованим капсидом, які мають повтори (QGPGAP)n (SEQ ID NO:59, n=4,6) в HVR1(A), PyCS-специфічні гуморальні відповіді до тижня 9 (В), концентрацію малярійного плазмодію в печінці через 42 години після інфікування спорозоїтом (С) і нейтралізуючу активність стосовно спорозоїта in vitro в об'єднаних пробах сироватки (D). Мишей вакцинували з ад'ювантом або без нього. [0062] Фіг. 45 ілюструє режим первинної і підтримуючої вакцинації аденовірусами PyCS з модифікованим капсидом, які мають повтори (QGPGAP)n (SEQ ID NO:59, n=6, 9, 12) в HVR1(A), PyCS-специфічні гуморальні відповіді до тижня 9 (В), PyCS-специфічні клітинні відповіді CD8+ T-лімфоцитів до тижня 9 (С) і концентрацію малярійного плазмодію в печінці через 42 години після інфікування спорозоїтом (D). Мишей вакцинували з ад'ювантом або без нього. [0063] На Фіг. 46 показана експресія білка PfCSP в клітинах AD293 після тимчасової трансфекції вектором PfCSP/pShuttle-CMV. Білок PfCSP визначали методом вестерн-блоттінгу з застосуванням моноклональних анти-NANP антитіл миші (2A10). [0064] На Фіг. 47 показані результати зафарбовування сріблом і вестерн-блоттінгу (А) і ELISA (В) очищених рекомбінантних аденовірусів PfCSP з модифікованим капсидом, які проводять для підтвердження вбудовування епітопа (NANP)4 (SEQ ID NO:60; n=4) в білки капсида аденовірусу. Вбудований епітоп (NANP)4 (SEQ ID NO:60; n=4) визначали з використанням моноклонального анти- NANP антитіла миші (2A10). При проведенні ELISA планшети для ELISA покривали безпосередньо очищеними аденовірусами. [0065] На Фіг. 48 показані результати зафарбовування сріблом і вестерн-блоттінгу (А) і ELISA (В) очищених рекомбінантних аденовірусів PfCSP з модифікованим капсидом, які проводять для підтвердження вбудовування епітопа (NANP)n (SEQ ID NO:60; n=4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22) в білки капсида аденовірусу. При проведенні ELISA планшети для ELISA покривали безпосередньо очищеними аденовірусами, і визначали вбудований епітоп у частках аденовірусу за допомогою анти-PfCSP антитіла (2A10). [0066] Фіг. 49 ілюструє режим первинної й підтримуючої вакцинації рекомбінантними аденовірусами PfCSP з модифікованим капсидом, які мають (NANP)4 (SEQ ID NO:60; n=4) (A) і PfCSP-специфічні гуморальні відповіді до тижня 9 (В). [0067] Фіг. 50 ілюструє режим первинної й підтримуючої вакцинації рекомбінантними аденовірусами PfCSP з модифікованим капсидом, які мають (NANP) n (SEQ ID NO:60; n=10, 16, 22) в HVR1 (A) і PfCSP-специфічні гуморальні відповіді до тижня 9 (В). [0068] Фіг. 51 ілюструє режим первинної й підтримуючої вакцинації рекомбінантними аденовірусами PfCSP з модифікованим капсидом, які мають (NANP)n (SEQ ID NO:60; n=4, 6, 8, 10) в HVR1 (A) і PfCSP-специфічні гуморальні відповіді до тижня 9 (В). Мишей вакцинували з ад'ювантом або без нього. [0069] На Фіг. 52 показані результати зафарбовування сріблом очищеного аденовірусу з білком нитки й білком pVII-, модифікованим повторами (QGPGAP)3 ((QGPGAP)3-Fib/CD 4-pVII-1/ PyCS-GFP) (А) і титр анти-QGPGAP антитіл до тижня 10 у мишей, вакцинованих (QGPGAP)3Fib/PyCS-GFP і (QGPGAP)3-Fib/CD 4-pVII-1/PyCS-GFP, як описано на Фіг. 49 (B). Результати двох незалежних експериментів відкладені на графіку після нормування із вказівкою медіан титрів антитіл у B-Fib/PyCS-GFP-вакцинованій групі. [0070] На Фіг. 53 наведені схематичні зображення структури білків pVII аденовірусу з послідовністю епітопа PfCSP, який розпізнається CD4+-лімфоцитами, EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT (SEQ ID NO:62), вбудованими перед першим клітинним сигналом внутрішньоядерної локалізації (NLS) pVII (PfCD 4-pVII-2; SEQ ID 9, нуклеїнова кислота; SEQ ID NO:58, амінокислоти) (А) і результат зафарбовування сріблом, яке проводять для 6 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підтвердження вбудовування зазначеного епітопа в pVII (B). [0071] Фіг. 54 ілюструє режим первинної й підтримуючої вакцинації рекомбінантними аденовірусами PfCSP, модифікованими за білками HVR1 і pVII (A), PfCSP-специфічні гуморальні відповіді до тижня 6 (В), PfCSP-специфічні клітинні відповіді CD4+ T-лімфоцитів (EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT; SEQ ID NO:62) до тижня 9 (С). [0072] Фіг. 55 ілюструє нейтралізацію рекомбінантного аденовірусу in vitro пробами сироватки людини. Клітини AD293 інфікували рекомбінантними аденовірусами в присутності розведеної сироватки людини протягом ночі й вимірювали експресію GFP (зеленого флуоресцентного білка) як маркер інфікування. [0073] Фіг. 56 ілюструє дію імунітету проти аденовірусу на індукцію PyCS-специфічної відповіді Т-лімфоцитів на аденовіруси PyCS-GFP з модифікованим капсидом in vivo. На панелі (А) наведений короткий опис дизайну дослідження. На панелі (В) показана PyCS-специфічна CD8+-відповідь Т-лімфоцитів у мишей, вакцинованих диким типом (wt)/"порожнім" аденовірусом двічі, і надалі примірованих аденовірусами PyCS-GFP з модифікованим капсидом. [0074] Фіг. 57 ілюструє дію імунітету проти аденовірусу на індукцію PyCS-специфічної гуморальної імунної відповіді на аденовіруси PyCS-GFP з модифікованим капсидом in vivo. На панелі (А) наведено короткий опис дизайну дослідження. На панелі (В) показана PyCSспецифічна гуморальна імунна відповідь у мишей, вакцинованих диким типом (wt)/"порожнім" аденовірусом двічі, і далі - двома дозами аденовірусів PyCS-GFP з модифікованим капсидом. Шляхи вирішення завдань [0075] Автори даного винаходу виявили новий рекомбінантний аденовірус, який має нову структуру з модифікованим капсидом, і який одержують із плазмідного вектора на основі рекомбінантного аденовірусу. Зазначений рекомбінантний аденовірус здатний інфікувати клітини ссавців, що викликає експресію білка circumsporozoite Plasmodium зазначеними клітинами. Також зазначений рекомбінантний аденовірус містить один або більше білків капсида, які були модифіковані шляхом вбудовування цільового імуногенного антигену, такого як епітоп білка circumsporozoite Plasmodium, який розпізнається В-лімфоцитами або Тлімфоцитами. Зазначений рекомбінантний аденовірус одержують шляхом трансфекції клітин лінеаризованим рекомбінантним плазмідним вектором на основі аденовірусу. Автори даного винаходу застосували отриманий рекомбінантний аденовірус для проведення розширеного дослідження фармацевтичних засобів, які містять як активний інгредієнт рекомбінантний аденовірус, що має профілактичну й лікувальну дію стосовно малярії. У результаті автори даного винаходу показали, що отриманий рекомбінантний аденовірус має бажану фармацевтичну дію. Докладний опис [0076] У наступному описі наведені конкретні деталі для всебічного пояснення й опису варіантів реалізації даного винаходу. Однак фахівці в даній області техніки розуміють, що даний винахід може бути здійснений без наведених деталей. В інших випадках добре відомі структури й функції не були докладно показані або описані, щоб надмірно не ускладнювати опис варіантів реалізації даного винаходу. [0077] Скорочення, застосовувані для амінокислот, пептидів, послідовностей основ і нуклеїнових кислот у даному описі, засновані на скороченнях, зазначених у Домовленості з біохімічної номенклатури IUPAC-IUB (Міжнародний союз теоретичної і прикладної хімії Міжнародний біохімічний союз), Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984), "Guideline for Preparing Specifications Including Base Sequences and Amino Acid Sequences" (Бюро з патентів і товарних знаків США), і відповідають скороченням, широко застосовуваним у даній області техніки. [0078] "Послідовність нуклеотидів", "полінуклеотид" або "молекула ДНК" в даному описі можуть включати дволанцюжкову ДНК або одноланцюжкову ДНК (наприклад, смисловий ланцюг і антисмисловий ланцюг, які утворюють дволанцюжкову ДНК) і не обмежені за своєю повною довжиною. Послідовності нуклеотидів, які кодують імуногенний чужорідний ген, такий як ген, що розкривається нижче в даній заявці, включають дволанцюжкову ДНК, включаючи геномну ДНК, одноланцюжкову ДНК (смисловий ланцюг), включаючи кДНК, одноланцюжкову ДНК (антисмисловий ланцюг), яка має послідовність, комплементарну до смислового ланцюга, та їх фрагменти, якщо не зазначено інше. [0079] У даному описі терміни "послідовності нуклеотидів", "полінуклеотиди" або "молекули ДНК" не обмежуються функціональною областю і можуть включати щонайменше одну область придушення експресії, кодуючу область, лідерну послідовність, екзон та інтрон. Також приклади послідовностей нуклеотидів у полінуклеотидах можуть включати РНК або ДНК. Поліпептид, що містить специфічну послідовність амінокислот, і полінуклеотид, що містить специфічну послідовність ДНК, може включати фрагменти, гомологи, похідні та мутанти полінуклеотида. 7 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклади мутантів послідовності нуклеотидів або полінуклеотида (такі як мутантна ДНК) включають існуючі в природі алельні мутанти; штучні мутанти і мутанти, які містять делеції, заміни, приєднання і/або вставки. Очевидно, що такі мутанти кодують поліпептиди, які мають по суті таку ж функцію, що й поліпептиди, які кодуються початковим немутованим полінуклеотидом. [0080] Даний винахід відноситься до рекомбінантного аденовірусу, який може експресувати антигенну детермінанту плазмодію Plasmodium і містить один або більше модифікованих білків капсида і/або серцевини. Зазначений рекомбінантний аденовірус одержують із плазмідного вектора на основі рекомбінантного аденовірусу. Застосування аденовірусу як вектора докладно обговорюється далі. Плазмідні вектори на основі рекомбінантного аденовірусу, що описані в даній заявці, можна застосовувати як вакцину проти малярії або фармацевтичну композицію, що забезпечує індукцію як гуморальної, так і клітинної імунної відповіді. [0081] З відомих видів Plasmodium (P.) можна вибрати будь-який плазмодій виду Plasmodium, наприклад, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, P. knowlesi, P. berghei, P. chabaudi і P. yoelii. Згідно з деякими варіантами реалізації антигенну детермінанту одержують із специфічного для гризунів Plasmodium yoelii або зі специфічного для людини Plasmodium falciparum. [0082] Згідно з одним варіантом реалізації вектор на основі рекомбінантного аденовірусу з модифікованим капсидом (також називаний у даній заявці вектором на основі рекомбінантного аденовірусу) являє собою плазміду, яка кодує й відтворює рекомбінантний вірус із модифікованим капсидом і/або серцевиною (також називаний у даній заявці рекомбінантним аденовірусом), який має структуру з одним або більше модифікованих білків капсида і/або серцевини. Згідно з зазначеними варіантами реалізації даного опису модифікація білків капсида і/або серцевини може супроводжуватися вбудовуванням щонайменше одного імуногенного епітопа білка circumsporozoite Plasmodium. Як альтернатива, щонайменше частина білка капсида і/або серцевини може бути делетована й замінена щонайменше одним імуногенним епітопом білка circumsporozoite Plasmodium. Згідно з деякими варіантами реалізації імуногенним епітопом є епітоп білка circumsporozoite Plasmodium, який розпізнається В-лімфоцитами або Тлімфоцитами. Додавання епітопа, який розпізнається В-лімфоцитами або Т-лімфоцитами, може служити для підвищення ефективності вектора аденовірусу, застосовуваного як вакцини проти малярії, за рахунок виникнення або посилення гуморальної імунної відповіді на білок CS. Модифіковані білки капсида й серцевини та їхні значення для застосування в рекомбінантному аденовірусі, описаному в даній заявці, також обговорюються далі. [0083] Один або більше модифікованих білків капсида і/або серцевини можуть бути модифікованим білком гексона, модифікованим білком нитки, модифікованим білком pVII або їх сполученням. Згідно з одним варіантом реалізації частину гіперваріабельної ділянки гексона (HVR) і/або частину білка нитки заміняють щонайменше на один епітоп білка circumsporozoite Plasmodium, який розпізнається В-лімфоцитами і/або Т-лімфоцитами. Як альтернатива, один або більше епітопів білка circumsporozoite Plasmodium, які розпізнаються В-лімфоцитами і/або Т-лімфоцитами, можна вводити в HVR білка нитки або гексона. Згідно з деякими аспектами модифікованим HVR може бути HVR1, HVR2, HVR3, HVR4, HVR5, HVR6 або HVR7 Згідно з іншими аспектами модифікованим HVR може бути HVR1 або HVR5. Згідно з деякими варіантами реалізації HVR-модифікований гексон може мати послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO:3 (Фіг. 11), SEQ ID NO:4 (Фіг. 12), SEQ ID NO:5 (Фіг. 13), SEQ ID NO:6 (Фіг. 14), SEQ ID NO:7 (Фіг. 15), SEQ ID NO:8 (Фіг. 16), SEQ ID NO:9 (Фіг. 17), SEQ ID NO:10 (Фіг. 18), SEQ ID NO:11 (Фіг. 19), SEQ ID NO:12 (Фіг. 20), SEQ ID NO:13 (Фіг. 21), SEQ ID NO:14 (Фіг. 22), SEQ ID NO:15 (Фіг. 23), SEQ ID NO:16 (Фіг 24), SEQ ID NO:17 (Фіг. 25), SEQ ID NO:18 (Фіг. 26), SEQ ID NO:19 (Фіг. 27), SEQ ID 0 (Фіг. 28), SEQ ID 1 (Фіг. 29), SEQ ID 2 (Фіг. 30) або SEQ ID 3 (Фіг. 31). Згідно з іншими варіантами реалізації модифікований білок нитки може мати послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID 4 (Фіг. 32) або SEQ ID 5 (Фіг. 33). [0084] Згідно зі ще одним варіантом реалізації епітоп білка circumsporozoite Plasmodium, який розпізнається Т-лімфоцитами, може бути вбудований у білок серцевини pVII у кожному з наступних сайтів: С-кінець, перед першим клітинним сигналом ядерної локалізації (NLS) або між двома NLS. Як альтернатива, епітоп білка circumsporozoite Plasmodium, який розпізнається Тлімфоцитами, може заміняти частину білка pVII. Згідно з деякими варіантами реалізації модифікований білок pVII може характеризуватися послідовністю нуклеїнової кислоти SEQ ID 6 (Фіг. 34), SEQ ID 7 (Фіг. 35), SEQ ID 8 (Фіг. 36) або SEQ ID 9 (Фіг. 37). [0085] Рекомбінантний аденовірус може забезпечувати експресію трансгенного білка або рекомбінантного трансгенного білка. Згідно з деякими варіантами реалізації трансгенний білок або рекомбінантний трансгенний білок являє собою білок circumsporozoite Plasmodium або 8 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антигенну детермінанту, які кодуються плазмідним вектором на основі рекомбінантного аденовірусу, як описано в даній заявці, і експресуються рекомбінантним аденовірусом, отриманим із зазначеного плазмідного вектора на основі рекомбінантного аденовірусу після інфікування однієї або більше клітин-хазяїв. [0086] Таким чином, згідно з деякими варіантами реалізації, плазмідні вектори на основі рекомбінантного аденовірусу містять послідовність нуклеотидів рекомбінантного трансгенного білка. Згідно з одним варіантом реалізації рекомбінантний трансгенний білок може містити антигенну детермінанту P. yoelii, плазмодію, специфічного для гризунів, причому антигенна детермінанта містить ген білка circumsporozoite (CS) P. Yoelii або його антигенної частини. Згідно зі ще одним варіантом реалізації рекомбінантний трансгенний білок може містити антигенну детермінанту P. falciparum, плазмодію, специфічного для людини, причому антигенна детермінанта містить ген білка circumsporozoite (CS) P. falciparum або його антигенної частини. Було показано, що білок CS P. falciparum забезпечує профілактику малярії при застосуванні його як основи для активної імунізації людей проти інфекції, розповсюджуваної комарами. Також антигенна детермінанта може містити імуногенний епітоп, такий як епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами і/або Т-лімфоцитами. [0087] Згідно з деякими варіантами реалізації білок CS є кодон-оптимізованим з метою підвищення рівня експресії в організмі суб'єкта. Оптимізація кодонів основана на необхідному амінокислотному складі, на загальній оптимальній частоті використання кодонів у суб'єкта, який розглядається, а також факторах, яких варто уникати, щоб експресія була адекватною. До таких факторів можна віднести донорні або акцепторні сайти сплайсованого фрагмента, термінуючі кодони, сигнали поліаденілювання (pА), GC- і AT-багаті послідовності, внутрішні ТАТА-бокси або будь-які інші аспекти, відомі в даній області техніки. Згідно з деякими варіантами реалізації послідовність ДНК кодон-оптимізованого трансгена показана на Фіг. 9 (SEQ ID NO:1, P. yoelii) і Фіг. 10 (SEQ ID NO:2, P. falciparum). [0088] Згідно з деякими варіантами реалізації плазмідним вектором на основі рекомбінантного аденовірусу може бути один із наступних плазмідних векторів на основі рекомбінантного аденовірусу, модифікованого послідовністю P. falciparum: вектор на основі HVR1-модифікованого аденовірусу (NANP-HVR1/PfCSP), сконструйований як показано на Фіг. 2, з застосуванням послідовності (NANP) n, яка кодує епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами (SEQ ID NO:60); вектор на основі аденовірусу з модифікованим білком нитки (NANP-Fib/PfCSP), сконструйований як показано на Фіг. 4, із застосуванням послідовності (NANP) n, яка кодує епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами (SEQ ID NO:60); вектор на основі аденовірусу з модифікованими HVR1 і білком нитки (NANP-HVR1/B-Fib/PfCSP), сконструйований як показано на Фіг. 5, із застосуванням послідовності (NANP) n, яка кодує епітоп, який розпізнається Влімфоцитами (SEQ ID NO:60); вектор на основі аденовірусу з модифікованими HVR1 і pVII (NANP-HVR1/CD4-pVII/PfCSP), сконструйований як показано на Фіг. 7, із застосуванням послідовності (NANP)n, яка кодує епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами (SEQ ID NO:60), і послідовності EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT,яка кодує епітоп, який розпізнається CD4лімфоцитами (SEQ ID NO:62); вектор на основі аденовірусу з модифікованим білком нитки й pVII (NANP-Fib/CD4-pVII/PfCSP), сконструйований як показано на Фіг. 6, із застосуванням епітопа (NANP)n, який розпізнається В-лімфоцитами (SEQ ID NO:60), і послідовності EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT, яка кодує епітоп, який розпізнається CD4-лімфоцитами (SEQ ID NO:62); і вектор на основі аденовірусу з модифікованими HVR1, білком нитки й pVII (NANPHVR1/Fib/CD4-pVII/PfCSP), сконструйований як показано на Фіг. 8, із застосуванням епітопа (NANP)n, який розпізнається В-лімфоцитами (SEQ ID NO:60), і послідовності EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT, яка кодує епітоп, який розпізнається CD4-лімфоцитами (SEQ ID NO:62). [0089] Згідно з іншими варіантами реалізації плазмідним вектором на основі рекомбінантного аденовірусу може бути один із наступних плазмідних векторів на основі рекомбінантного аденовірусу, модифікованого послідовністю P. yoelii: вектор на основі HVR1модифікованого аденовірусу (QGPGAP-HVR1/PyCS), сконструйований як показано на Фіг. 2, з застосуванням послідовності (QGPGAP) n, яка кодує епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами (SEQ ID NO:59); вектор на основі аденовірусу з модифікованим білком нитки (QGPGAPFib/PyCS), сконструйований як показано на Фіг. 4, з застосуванням послідовності(QGPGAP) n, яка кодує епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами (SEQ ID NO:59); вектор на основі аденовірусу з модифікованими HVR1 і білком нитки (QGPGAP-HVR1/B-Fib/PyCS), сконструйований як показано на Фіг. 5, із застосуванням послідовності (QGPGAP) n, яка кодує епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами (SEQ ID NO:59); вектор на основі аденовірусу з модифікованими HVR1 і pVII (QGPGAP-HVR1/CD4-pVII/PyCS), сконструйований як показано на 9 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 7, із застосуванням послідовності (QGPGAP) n, яка кодує епітоп, який розпізнається Влімфоцитами (SEQ ID NO:59), і послідовності YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK, яка кодує епітоп, який розпізнається CD4-лімфоцитами (SEQ ID NO:61); вектор на основі аденовірусу з модифікованим білком нитки й pVII (QGPGAP-Fib/CD4-pVII/PyCS), сконструйований як показано на Фіг. 6, із застосуванням епітопа (QGPGAP)n, який розпізнається В-лімфоцитами (SEQ ID NO:59), і послідовності YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK, яка кодує епітоп, який розпізнається CD4лімфоцитами (SEQ ID NO:61); і вектор на основі аденовірусу з модифікованими HVR1, білком нитки й pVII (QGPGAP-HVR1/Fib/CD4-pVII/PyCS), сконструйований як показано на Фіг. 8, із застосуванням епітопа (QGPGAP)n, який розпізнається В-лімфоцитами (SEQ ID NO:59), і послідовності YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK, яка кодує епітоп, який розпізнається CD 4лімфоцитами (SEQ ID NO:61). [0090] Згідно з іншими варіантами реалізації рекомбінантний аденовірус може бути отриманий із використанням одного з наступних плазмідних векторів на основі рекомбінантного аденовірусу, модифікованого послідовностями P. falciparum або P. yoelii: NANP-HVR1/PfCSP або QGPGAP-HVR1/PyCS (Фіг. 2), NANP-Fib/PfCSP або QGPGAP-Fib/PyCS (Фіг. 4), NANPHVR1/B-Fib/PfCSP або QGPGAP-HVR1/B-Fib/PyCS (Фіг. 5), NANP-HVR1/CD4-pVII/PfCSP або QGPGAP-HVR1/CD4-pVII/PyCS (Фіг. 7), NANP-Fib/CD4-pVII/PfCSP або QGPGAP-Fib/CD4pVII/PyCS (Фіг. 6), NANP-HVR1/Fib/CD4-pVII/PfCSP або QGPGAP-HVR1/Fib/CD4-pVII/PyCS (Фіг. 8). Рекомбінантний аденовірус може бути отриманий описаними в даній заявці способами одержання плазмідного вектора на основі рекомбінантного аденовірусу, який має здатність експресувати рекомбінантний трансгенний білок (наприклад, білок CS Plasmodium) у клітинах ссавців. [0091] Очищення рекомбінантного аденовірусу можуть бути здійснене за допомогою відомих способів очищення вірусів. Наприклад, очищення 0,5 – 1,0 мл культури вірусу, отриманої згідно зі способом одержання білків рекомбінантного аденовірусу шляхом зараження клітин комах (1 × 7 10 клітин/чашку діаметром 10 см), таких як клітини AD293. Надосадову рідину культури відбирають через кілька днів після інфікування, і осад, який містить вірус, відділений у результаті центрифугування, розводять буфером, таким як фосфатно-сольовий буферний розчин (ФСБ). Отриману суспензію піддають дії градієнта сахарози від 10 до 60 %, потім центрифугують (25 000 об./хв. протягом 60 хвилин при 4 °C), у результаті відбирають смугу з вірусом. Отриманий вірус додатково розбавляють у ФСБ, після чого центрифугують за тих самих умов, що й попереднє центрифугування, і отриманий очищений осад, який містить вірус, зберігають при 4 °C у буфері, такому як ФСБ. [0092] Ще один варіант реалізації відноситься до фармацевтичної композиції, яка по суті містить щонайменше один активний інгредієнт. Згідно з одним варіантом реалізації активний інгредієнт зазначеної фармацевтичної композиції може включати рекомбінантний аденовірус, який може бути отриманий методами генної інженерії, описаними в даній заявці. Більш конкретно, активний інгредієнт може бути рекомбінантним аденовірусом, який містить модифіковані білки капсида і/або серцевини, у яких частина гіперваріабельної ділянки гексона (HVR), частина білка нитки, частина білка pVII або їхні комбінації замінені щонайменше одним імуногенними епітопом білка circumsporozoite Plasmodium. Як альтернатива, у білок нитки, HVR гексона або білок pVII можна вбудовувати один або більше епітопів білка circumsporozoite Plasmodium, які розпізнаються В-лімфоцитами і/або Т-лімфоцитами. Зазначений вектор на основі рекомбінантного аденовірусу також містить трансгенний білок або рекомбінантний трансгенний білок, який експресується рекомбінантним аденовірусом після інфікування однієї або більше клітин-хазяїв. Зазначеним трансгенним білком або рекомбінантним трансгенним білком може бути білок circumsporozoite Plasmodium або малярійний антиген білка circumsporozoite Plasmodium, причому зазначений малярійний антиген містить щонайменше один імуногенний епітоп (наприклад, такий, що розпізнається В-лімфоцитами або Тлімфоцитами) білка circumsporozoite Plasmodium. [0093] Згідно з деякими варіантами реалізації активним інгредієнтом зазначеної фармацевтичної композиції є рекомбінантний аденовірус, отриманий із плазмідного вектора на основі рекомбінантного аденовірусу, причому зазначений вектор на основі рекомбінантного аденовірусу є одним з наступних плазмідних векторів на основі рекомбінантного аденовірусу, модифікованого послідовностями P. falciparum або P. yoelii: NANP-HVR1/PfCSP або QGPGAPHVR1/PyCS (Фіг. 2), NANP-Fib/PfCSP або QGPGAP-Fib/PyCS (Фіг. 4), NANP-HVR1/B-Fib/PfCSP або QGPGAP-HVR1/B-Fib/PyCS (Фіг. 5), NANP-HVR1/CD4-pVII/PfCSP або QGPGAP-HVR1/CD4pVII/PyCS (Фіг. 7), NANP-Fib/CD4-pVII/PfCSP або QGPGAP-Fib/CD4-pVII/PyCS (Фіг. 6), NANPHVR1/Fib/CD4-pVII/PfCSP або QGPGAP-HVR1/Fib/CD4-pVII/PyCS (Фіг. 8). Зазначені плазмідні вектори на основі рекомбінантного аденовірусу здатні до вироблення рекомбінантних 10 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аденовірусів при їх трансфекції в клітини (наприклад, клітини AD293), причому зазначений рекомбінантний трансгенний білок може експресуватися в клітинах ссавців, включаючи клітини людини. [0094] Фармацевтична композиція, що містить як активний інгредієнт описаний у даній заявці рекомбінантний аденовірус, при введенні суб'єкту підсилює протималярійну профілактичну дію, спрямовану проти малярійного антигену, і знижує титр інфекційності, як описано далі в розділі "Приклади". Таким чином, рекомбінантний аденовірус можна застосовувати для лікування малярії, асоційованої з інфекційним ураженням клітин і тканин-мішеней. Приклади клітинмішеней, які уражаються при малярії, включають клітини крові, клітини печінки, клітини нирок, клітини легень, епітеліальні та м'язові клітини. Приклади тканин, які містять зазначені клітини, включають легені, печінку, нирки, головний мозок, артерії й вени, шлунок, кишечник, сечівник, шкіру та м'язи. [0095] Згідно з деякими аспектами зазначена фармацевтична композиція може підсилювати протималярійну профілактичну дію, спрямовану проти антигенів збудника, наприклад, антигенів малярійного плазмодію, таких як поверхневі антигени спорозоїта (білок circumsporozoite (CSP) і родинний тромбоспондину адгезивний білок (TRAP)) малярійних плазмодіїв, поверхневий мембранний білок мерозоїта (MSPl), малярійний S-антиген, який секретується еритроцитами, інфікованими малярією, і білок-1 P. falciparum на мембрані еритроцитів (PfEMPl)), які присутні на поверхні еритроцитів, інфікованих малярією. Зазначена фармацевтична композиція може підсилювати профілактичну дію стосовно зараження будь-яким плазмодієм, обраним із відомих видів Plasmodium (P), наприклад, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, P. knowlesi, P. berghei, P. chabaudi і P. yoelii, шляхом зниження титру інфекційності. При введенні зазначеної фармацевтичної композиції суб'єкту зниження титру інфекційності може призводити до збільшення періоду виживаності, стадії ремісії або періоду виживаності без інфекції, збільшенню рівня виживаності або виживаності без інфекції в порівнянні з суб'єктами, яким не вводили зазначену фармацевтичну композицію. Таким чином, згідно з деякими аспектами зазначену фармацевтичну композицію можна застосовувати як профілактичний або лікувальний засіб при малярії, викликаній такими патогенами як Plasmodium. Згідно з додатковими аспектами зазначена фармацевтична композиція застосовна як профілактичний або лікувальний засіб при ускладненнях малярії, викликаних такими патогенами як Plasmodium. [0096] Профілактичну дію рекомбінантного аденовірусу згідно з даним винаходом у суб'єкта можна забезпечити, наприклад, шляхом введення фармацевтичної композиції, яка містить рекомбінантний аденовірус із модифікованим капсидом згідно з даним винаходом і допоміжні речовини для введення препарату, хребетним, зокрема ссавцям, включаючи людину, внутрішньом'язовим (в/м), підшкірним (п/ш), внутрішньошкірним (в/ш), внутрішньодермальним (в/д), внутрішньочеревинним (в/ч), назальним або інгаляційним шляхом, і наступної багаторазової вакцинації хребетних фармацевтичною композицією, яка містить як активний інгредієнт рекомбінантний аденовірус, описаний у даній заявці. Щоб оцінити профілактичну дію, можна порівнювати рівень виживаності, стадії ремісії або виживаності без інфекції у суб'єктів, багаторазово вакцинованих зазначеною фармацевтичною композицією й потім інфікованих цільовим патогеном (наприклад, обраним із видів Plasmodium), з рівнем виживаності, стадії ремісії або виживаності без інфекції у суб'єктів, які не одержували зазначену фармацевтичну композицію. [0097] Згідно з деякими варіантами реалізації зазначена фармацевтична композиція може містити фармацевтично ефективну кількість рекомбінантного аденовірусу з модифікованим капсидом і/або серцевиною, як описано в даній заявці, і фармацевтично прийнятну основу, що додатково описана далі. [0098] Ще один варіант реалізації відноситься до вакцини, яка по суті містить щонайменше один активний інгредієнт. Згідно з одним варінтом реалізації активний інгредієнт зазначеної вакцини може включати рекомбінантний аденовірус, отриманий із плазмідного вектора на основі рекомбінантного аденовірусу, описаного в даній заявці. Більш конкретно, активний інгредієнт може бути рекомбінантним аденовірусом, який містить модифіковані білки капсида або серцевини, у яких частина гіперваріабельної ділянки гексона (HVR), частина білка нитки, частина білка pVII або їх комбінації замінені щонайменше одним імуногенними епітопом білка circumsporozoite Plasmodium. Як альтернатива, у білок pVII, білок нитки або HVR гексона, або в їх сполучення, можна вбудовувати щонайменше один імуногенний епітоп білка circumsporozoite Plasmodium. Згідно з деякими варіантами реалізації активний інгредієнт зазначеної вакцини можна одержати з плазмідного вектора на основі рекомбінантного аденовірусу, проілюстрованого на Фіг. 2-8, наприклад, NANP-HVR1/PfCSP або QGPGAP-HVR1/PyCS (Фіг. 2), NANP-Fib/PfCSP або QGPGAP-Fib/PyCS (Фіг. 4), NANP-HVR1/B-Fib/PfCSP або QGPGAP 11 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 HVR1/B-Fib/PyCS (Фіг. 5), NANP-HVR1/CD4-pVII/PfCSP або QGPGAP-HVR1/CD4-pVII/PyCS (Фіг.7), NANP-Fib/CD4-pVII/PfCSP або QGPGAP-Fib/CD4-pVII/PyCS (Фіг. 6), NANP-HVR1/Fib/CD4pVII/PfCSP або QGPGAP-HVR1/Fib/CD4-pVII/PyCS (Фіг. 8). [0099] Згідно з деякими аспектами зазначена вакцина при її введенні суб'єкту спочатку містить рекомбінантний аденовірус, який має одну або більше антигенних частин білка CS Plasmodium (наприклад, епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами, епітоп, який розпізнається Т-лімфоцитами або обидва), вбудованими щонайменше в одну частину білка капсида або серцевини, або замінюючими зазначену частину. Потім зазначена вакцина може експресувати рекомбінантний трансгенний білок, причому зазначеним рекомбінантним трансгенним білком є білок CS Plasmodium, який містить епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами, епітоп, який розпізнається Т-лімфоцитами або обидва. Антигенні частини білка CS Plasmodium виявляються в рекомбінантному трансгенному білку, і модифіковані білки капсида або серцевини сприяють розвитку або посиленню набутого гуморального імунітету, клітинного імунітету або обох, як описано далі в розділі "Приклади". Таким чином, згідно з деякими аспектами рекомбінантний аденовірус, описаний у даній заявці, застосуємо як вакцину для забезпечення виникнення або посилення гуморального імунітету, клітинного імунітету або обох типів. [00100] Згідно з додатковими варіантами реалізації зазначена вакцина може підсилювати профілактичну дію, спрямовану проти інфекційного антигену, наприклад, малярійних антигенів, таких як поверхневі білки спорозоїта малярійного плазмодію (CSP і TRAP), поверхневий мембранний білок мерозоїта MSPl, малярійний S-антиген, який секретується еритроцитами, інфікованими малярією, білок PfEMPl, присутній на поверхні еритроцитів, інфікованих малярією, багатий на серин антиген (SERA), багатий на тирозин кислий матричний білок (TRAMP) і антиген-1 апікальної мембрани (AMAl). Крім того, зниження титру інфекційності (наприклад, зниження титру інфекційності вірусу), яке виникає внаслідок введення вакцини, описаної в даній заявці, може призводити до збільшення періоду виживаності, стадії ремісії або періоду виживаності без інфекції, збільшення рівня виживаності, ремісії або виживаності без інфекції в порівнянні з суб'єктами, яким не вводили зазначену фармацевтичну вакцину. Таким чином, згідно з деякими аспектами зазначена вакцина також застосовна як профілактичний або лікувальний засіб проти малярії, викликаної такими патогенами як Plasmodium. Згідно з додатковими аспектами зазначена вакцина також застосовна як профілактичний або лікувальний засіб при боротьбі з ускладненнями малярії, викликаної такими патогенами як Plasmodium. [00101] Вакцина, описана в даній заявці, може містити терапевтично ефективну кількість рекомбінантного аденовірусу, описаного в даній заявці, і додатково містити фармацевтично прийнятну основу відповідно до стандартного способу. Приклади прийнятних основ включають фізіологічно прийнятні розчини, такі як стерильний фізіологічний розчин і стерильний буферний розчин. [00102] Згідно з деякими варіантами реалізації зазначену вакцину або фармацевтичну композицію можна застосовувати в сполученні з фармацевтично прийнятною кількістю ад'юванта для посилення протималярійної дії. Як ад'ювант можна застосовувати будь-який імунологічний ад'ювант, який може стимулювати імунну систему і збільшувати відповідь на вакцину та сам по собі не володіє якою-небудь специфічною антигенною дією. Багато імунологічних ад'ювантів імітують еволюційно консервативні молекули, називані патогенасоційованими молекулярними структурами (PAMР), і розпізнаються комплексом імунних рецепторів, таких як Toll-подібні рецептори (TLR). Приклади ад'ювантів, які можна застосовувати згідно з варіантами реалізації даного винаходу, включають повний ад'ювант Фрейнда, неповний ад'ювант Фрейнда, дволанцюжкову РНК (ліганд TLR3), ліпополісахариди (LPS), аналоги LPS, такі як монофосфорил-ліпід А (MPL) (ліганд TLR4), флагелін (ліганд TLR5), липопротеїни, ліпопептиди, одноланцюжкові РНК, одноланцюжкові ДНК, аналоги імідазохіноліну (ліганди TLR7 і TLR8), CpG ДНК (ліганд TLR9), ад'ювант Риби (монофосфорил-ліпід А/трегалоза-дикоріноміколат), гліколіпіди (аналоги α-GalCer), неметильовані CpG-острівці, масляні емульсії, ліпосоми, віросоми, сапоніни (активні фракції сапоніну, такого як QS21), мураміл-дипептид, квасці, гідроксид алюмінію, сквален, БЦЖ, цитокіни, такі як GM-CSF (гранулоцито-макрофаго-колонієстимулюючий фактор) та ІЛ-12, хемокіни, такі як MIP 1- α і RANTES (хемокін, який виділяється T-лімфоцитами при активації), аланіл-D-ізоглутамін (MDP), тимозин αl і MF59. Застосовувана кількість ад'юванта може бути обрана належним чином у залежності від вираженості симптомів, таких як розм'якшення шкіри, біль, еритема, лихоманка, головний біль і біль у м'язах, які можуть проявлятися як частина імунної відповіді у людей або тварин після введення вакцини даного типу. [00103] Згідно з деякими варіантами реалізації, вакцину або фармацевтичну композицію, що 12 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 описані в даній заявці, можна застосовувати в сполученні з іншими відомими фармацевтичними препаратами, такими як пептиди, які сприяють розвитку імунної відповіді, і протимікробні препарати (синтетичні протимікробні препарати). Зазначена вакцина або фармацевтична композиція також може містити інші лікарські або допоміжні речовини. Приклади лікарських або допоміжних речовин, які можна застосовувати в сполученні з вакциною або фармацевтичною композицією, що описані в даній заявці, включають лікарські речовини, які сприяють захопленню рекомбінантного аденовірусу або рекомбінантного трансгенного білка згідно з даним винаходом клітинами, ліпосоми та інші лікарські і/або допоміжні речовини, які полегшують трансфекцію (наприклад, фторвуглецеві емульгатори, ко-хелатори, трубочки, частки золота, біодеградувальні мікросфери та катіонні полімери). [00104] Згідно з деякими варіантами реалізації кількість активного інгредієнта, який міститься у вакцині або фармацевтичній композиції, описаних у даній заявці, може бути обрана з широкого діапазону концентрацій, одиниць вірусних часток (VPU), бляшкоутворюючих одиниць (БУО), відсотків за масою на об'єм (м/о %) або інших кількісних мір для оцінки кількості активного інгредієнта, за умови, що це терапевтично або фармацевтично ефективна кількість. Дозу вакцини або фармацевтичної композиції можна належним чином вибирати з широкого діапазону в залежності від бажаної терапевтичної дії, способу введення (шляху введення), періоду введення, віку і статі пацієнта, інших його станів тощо. [00105] Згідно з деякими аспектами, при введенні людині рекомбінантного аденовірусу як активного інгредієнта зазначеної вакцини або фармацевтичної композиції доза зазначеного 2 14 рекомбінантного аденовірусу може становити приблизно від 10 до 10 PFU 5 12 6 10 (бляшкоутворюючих одиниць), переважно від 10 до 10 PFU, і більш переважно від 10 до 10 PFU на пацієнта, яка розраховується як PFU рекомбінантного вірусу. [00106] Згідно з деякими аспектами, при введенні суб'єкту рекомбінантного аденовірусу як активного інгредієнта зазначеної вакцини або фармацевтичної композиції доза може бути обрана з широкого діапазону в перерахуванні на кількість експресованої ДНК, яка вводиться хазяїну з вакциною, або на кількість транскрибованої РНК. Також доза залежить від ефективності промоторів транскрипції і трансляції, застосовуваних у будь-якому з використовуваних векторів переносу. [00107] Згідно з деякими варіантами реалізації, вакцину або фармацевтичну композицію, що описані в даній заявці, можна вводити шляхом прямих ін'єкцій суспензії рекомбінантного аденовірусу, приготованої шляхом розведення зазначеного рекомбінантного аденовірусу в ФСБ (фосфатно-сольовому буферному розчині) або фізіологічному розчині, в локальну ділянку організму (наприклад, у тканину легенів, печінки, м'яза або головного мозку), шляхом назального введення або інгаляції, або шляхом внутрішньосудинного (в/с) (наприклад, внутрішньоартеріального, внутрішньовенного або у ворітну вену), підшкірного (п/ш), внутрішньошкірного (в/ш), внутрішньодермального (в/д) або внутрішньочеревинного (в/ч) введення. Вакцину або фармацевтичну композицію згідно з даним винаходом можна вводити більше одного разу. Більш конкретно, після первинного введення можна проводити одну або більше додаткових вакцинацій як підтримувальну вакцинацію. Одна або більше вторинних вакцинацій можуть підсилювати бажану дію. Після введення зазначеної вакцини або фармацевтичної композиції можна проводити вторинну вакцинацію фармацевтичною композицією, яка містить рекомбінантний аденовірус, описаний у даній заявці. [00108] Згідно з додатковими варіантами реалізації, застосування різних інших ад'ювантів, лікарських або допоміжних речовин у сполученні з вакциною згідно з даним винаходом, як описано вище, може підсилювати терапевтичну дію, яка досягається при введенні зазначеної вакцини або терапевтичної композиції. Фармацевтично прийнятна основа може містити слідові кількості допоміжних речовин, таких як речовини, що підвищують ізотонічність і хімічну стабільність. Такі допоміжні речовини повинні бути нетоксичними для людини або інших ссавців у застосовуваних дозах і концентраціях, і приклади таких допоміжних речовин включають буфери, наприклад, фосфорну кислоту, лимонну кислоту, бурштинову кислоту, оцтову кислоту та інші органічні кислоти, а також їх солі; антиоксиданти, наприклад, аскорбінову кислоту; низькомолекулярні (наприклад, менш, ніж 10 залишків амінокислот) пептиди (наприклад, поліаргінін і трипептид), білки (наприклад, сироватковий альбумін, желатин і імуноглобулін); амінокислоти (наприклад, гліцин, глутамінова кислота, аспарагінова кислота й аргінін): моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи (наприклад, целюлоза і її похідні, глюкоза, маноза та декстрин), хелатуючі агенти (наприклад, ЕДТА/етилендіамінтетраоцтова кислота/); цукроспирти (наприклад, манітол і сорбітол); протийони (наприклад, натрій); нейонні поверхнево-активні речовини (наприклад, полісорбат і полоксамер); і поліетиленгліколь (ПЕГ). [00109] Вакцину або фармацевтичну композицію, які містять рекомбінантний аденовірус, 13 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 описаний у даній заявці, можна зберігати в формі водного розчину або ліофілізованого препарату в контейнері з однократною дозою або декількома дозами, такому як запаяна ампула або флакон. [00110] Згідно зі ще одним варіантом реалізації запропонований спосіб профілактики малярії або спосіб лікування малярії, який включає введення ефективної кількості вакцини, рецептури або фармацевтичної композиції на основі рекомбінантного аденовірусу. Згідно з даним винаходом також запропонований спосіб стимуляції імунної відповіді, який включає введення суб'єкту ефективної кількості вакцини, рецептури чи фармацевтичної композиції на основі рекомбінантного аденовірусу або їх сполучення. Суб'єкти можуть включати людей, тварин (таких як ссавці, птахи, рептилії, риби та амфібії) або будь-яких інших суб'єктів, які можуть бути інфіковані малярійним плазмодієм. Малярійний плазмодій може включати плазмодій Plasmodium, будь-який обраний із видів Plasmodium (P), наприклад, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, P. knowlesi, P. berghei, P. chabaudi і P. yoelii. [00111] Згідно з деякими варіантами реалізації рекомбінантний аденовірус, що описаний у даній заявці, може один або разом із фармацевтично прийнятною основою входити до складу вакцини, рецептури або фармацевтичної композиції, і його можна вводити суб'єкту. Шляхом введення може бути, наприклад, будь-який із шляхів введення, перерахованих вище. Фармацевтично прийнятну основу для застосування в рамках даного винаходу можна належним чином вибрати з основ, зазвичай застосовуваних у даній області техніки в залежності від форми фармацевтичної композиції, яку потрібно одержати. Наприклад, якщо фармакологічну композицію готують у формі водного розчину, як основу можна застосовувати очищену воду (стерильну воду) або фізіологічний буферний розчин. Коли фармацевтичну композицію створюють у формі інших придатних розчинів, як основу можна застосовувати органічні ефіри, які можна вводити в організм, такі як гліколь, гліцерин і оливкова олія. Зазначена композиція може містити стабілізатори, допоміжні та інші речовини, зазвичай застосовувані в даній області техніки, і зокрема в області виробництва вакцин. [00112] Згідно з додатковими варіантами реалізації кількість рекомбінантного аденовірусу, застосовувана у вакцині, лікарській формі або фармацевтичній композиції, може бути відповідно обрана з широкого діапазону концентрацій, VPU, PFU, відсотків за масою на об'єм (м/о %) або інших кількісних мір для оцінки кількості активного інгредієнта. Згідно з деякими аспектами підходящий діапазон кількості рекомбінантного вірусу в зазначеній композиції переважно становить приблизно від 0,0002 до приблизно 0,2 (м/о %), а більш переважно - від 0,001 до 0,1 (м/о %). Спосіб введення вакцини, рецептури або фармацевтичної композиції на основі рекомбінантного аденовірусу згідно з деякими варіантами реалізації можна відповідним чином вибрати в залежності від лікарської форми, віку і статі пацієнта, інших умов, таких як тяжкість захворювання. Підходящою лікарською формою є форма для парентерального введення, така як розчини для ін'єкцій, краплі, назальні краплі та засоби для інгаляції. Коли зазначену композицію створюють у формі розчинів для ін'єкцій або крапель, композицію вводять внутрішньовенно та змішують із засобами для заповнення об'єму рідини, такими як розчин глюкози або амінокислот, як запропоновано, або можуть уводити внутрішньом'язово (в/м), підшкірно (п/ш), внутрішньошкірно (в/ш), внутрішньодермально (в/д) або внутрішньочеревинно (в/ч). [00113] Згідно з іншими варіантами реалізації добова доза вакцини, рецептури або фармацевтичної композиції на основі рекомбінантного аденовірусу може варіюватися залежно від стану суб'єкта, маси тіла, віку, статі тощо. Згідно з деякими аспектами доза рекомбінантного аденовірусу становить приблизно від 0,001 до 100 мг на кг маси тіла на день. Вакцину, рецептуру або фармацевтичну композицію згідно з даним винаходом можна вводити один або більше разів на день. [00114] Згідно з додатковими варіантами реалізації при введенні людині рекомбінантного аденовірусу як активного інгредієнта вакцини, рецептури або фармацевтичної композиції доза 2 14 рекомбінантного аденовірусу, яка вводиться, приблизно відповідає від 10 до 10 PFU, 5 12 6 10 переважно від 10 до 10 PFU, і більш переважно від 10 до 10 PFU на одного пацієнта, яка розраховується як PFU часток рекомбінантного вірусу. Вакцину згідно з даним винаходом варто вводити відповідно до принципів Належної медичної практики, з урахуванням клінічного стану (наприклад, стан, який потрібно попереджати або лікувати) кожного пацієнта, ділянки введення вакцини, яка містить аденовірус, тканини-мішені, способу введення, режиму дозування та інших факторів, відомих фахівцям у даній області техніки. Отже, належну дозу вакцини, описаної в даній заявці, визначають із урахуванням усього перерахованого вище. [00115] Ще один варіант реалізації даного винаходу відноситься до способу лікування або профілактики малярії в суб'єкта, який включає введення імунологічної або терапевтичної 14 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кількості вакцини проти малярії, яка містить рекомбінантний аденовірус. Рекомбінантний аденовірус у складі зазначеної вакцини проти малярії може містити антигенну детермінанту Plasmodium, а також може містити один або більше модифікованих білків капсида або серцевини. Імунологічно, фармакологічно або терапевтично прийнятною кількістю може бути будь-яка підходяща кількість, при введенні якої генерується ефективна імунна відповідь на одну або більше антигенних частин білка (CS) (тобто, трансген, епітоп, який розпізнається Влімфоцитами, або епітоп, який розпізнається CD4+ T-лімфоцитами), причому запобігається розвиток малярії або зменшується її тяжкість. [00116] Коли конкретний суб'єкт уперше піддається впливу або "примірується" вектором на основі аденовірусу, його імунна система виробляє нейтралізуючі антитіла проти зазначеного конкретного вектора. Імунна відповідь на аденовірус головним чином спрямована проти білків капсида. Отже, наступне введення того ж вектора на основі аденовірусу, або "підтримуюча вакцинація", може знижувати ефективність експресії трансгена. Отже, згідно з деякими варіантами реалізації спосіб лікування або профілактики малярії, описаний вище, може включати етап примірування із застосуванням першого вектора на основі рекомбінантного аденовірусу, а потім один або більше етапів підтримуючої вакцинації із застосуванням одного або більше інших векторів на основі рекомбінантного аденовірусу. Даний спосіб можна застосовувати у суб'єктів, які ще не піддавалися впливу аденовірусу дикого типу, або у суб'єкта, який раніше піддавався дії вектора на основі аденовірусу дикого типу, причому вектор на основі рекомбінантного аденовірусу на етапі примірування застосовують для того, щоб перебороти існуючий імунітет на аденовірус. Додаткові варіанти реалізації і приклади наведені нижче. Аденовірус як вектор [00117] Аденовіруси являють собою ДНК-вмісні віруси, позбавлені ліпопротеїнової оболонки, які містять комплекс білків капсида (описані нижче) та вірусний геном, який набув широкого застосування як засіб доставки одного або більше терапевтичних або антигенних трансгенів у клітини різних типів in vitro і in vivo. Існує багато серотипів аденовірусів. Серед відомих серотипів аденовірусів як вектор для трансдукції чужорідних генів переважно застосовують серотип 5 (Ad5) завдяки його сильній інфекційності в умовах in vivo (Abbink et al. 2007). Експресію антигенного трансгена можна контролювати за допомогою будь-якого промотору або енхансера, відомого в даній області. Промотори, які можна застосовувати для контролю експресії генів, включають промотор цитомегаловірусу (CMV) передранньої стадії, ранній промотор вірусу мавп 40 (SV40), промотор клітинного фактора елонгації поліпептидних ланцюгів-1 альфа (EF1), промотор вірусу саркоми Рауса (RSV) і тетрациклін-регульований промотор (TR), але не обмежуються ними. Сигнал поліаденілювання (pА) після кодуючої послідовності також можна застосовувати для ефективної транскрипції і трансляції. Вектор на основі рекомбінантного аденовірусу, описаний у даній заявці, може бути з дефективною реплікацією, може містити делецію щонайменше в ділянці E1 генома аденовірусу, оскільки ділянка Е1 необхідна для процесів реплікації, трансляції й упакування. Згідно з деякими аспектами також можна видалити ділянки E2, E3 і/або E4. Згідно з додатковими аспектами для більш ефективної трансляції можна застосовувати консенсусну послідовність Козака (Kozak 1987). [00118] Система на основі аденовірусу являє собою перспективний вектор для розробки рекомбінантних вакцин із кількох причин. Одна з причин полягає в тому, що вектори на основі рекомбінантних аденовірусів інфікують більшість типів клітин ссавців (як реплікативних, так і нереплікативних), включаючи типи клітин людини й миші, але не обмежуючись ними. Так, один і той самий вектор можна з успіхом застосовувати і в моделях на мишах, і в клінічних дослідженнях за участю людини. Друга причина полягає в тому, що будь-яка передана генетична інформація залишається поза хромосомами, і вдається уникнути інсерційного мутагенезу та зміни генотипу клітин (Crystal 1995). Ще одна причина полягає в тому, що трансген залишається незмінним після успішних циклів реплікації вірусів. Інші переваги застосування аденовірусу включають те, що рекомбінантний аденовірус: 1) має високо стабільний віріон, 2) добре переноситься, 3) його титр може зростати до високих рівнів, 4) може вміщати великі трансгени, 5) має геном, який детально вивчався протягом багатьох років, і відома повна послідовність ДНК кількох серотипів, що полегшує маніпуляції з геномом Ad шляхом технології рекомбінантних ДНК (Graham and Prevec 1992). [00119] Згідно з одним варінтом реалізації платформу для створення вакцин на основі аденовірусу застосовують як вірусний вектор для розробки вакцини, яка спрямована проти прееритроцитарної форми малярійного плазмодію та забезпечує захист від малярії. Було показано, що серед векторів на основі відомих рекомбінантних аденовірусів (Rodrigues et al. 1997, Bruna-Romero et al. 2001, Anderson et al. 2004, Tao et al. 2005) для одержання вакцини 15 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проти малярії підходить вектор на основі аденовірусу, оскільки він може викликати ефективну захисну клітинну імунну відповідь на прееритроцитарні форми малярійного плазмодію (Rodrigues et al. 1997). Малярійний плазмодій може належати до будь-якого сімейства Plasmodium. Згідно з деякими варіантами реалізації цільовим плазмодієм може бути P. yoelii або P. falciparum. Вектори на основі аденовірусу, які експресують як трансген PyCS, викликають відповідь CD8+ T-лімфоцитів [00120] Аденовірус являє собою перспективний вектор для індукції вираженого імунітету проти малярії, опосередковуваного CD8+T-лімфоцитами (Rodrigues et al. 1997, Rodrigues et al. 1998). Імуногенність рекомбінантного аденовірусу, який експресує білок CS P. yoelii (малярійного плазмодію, специфічного для гризунів), AdPyCS визначали за допомогою моделі малярії у гризунів. Імунізація мишей AdPyCS викликає розвиток повного імунітету у значного відсотка мишей, що перешкоджає виникненню паразитемії (Rodrigues et al. 1997). Зазначений захисний ефект головним чином опосередковується CD8+T-лімфоцитами, про що свідчить виснаження популяції Т-лімфоцитів, і що підтверджується тим фактом, що AdPyCS не міг викликати високі титри антитіл проти малярійного плазмодію. [00121] Щоб кількісно оцінити інфекційність аденовірусу з модифікованим капсидом, у човниковий вектор можна включити касету експресії зеленого флуоресцентного білка (GFP) і сайти клонування для трансгена. Отриманий у результаті човниковий вектор (GFP/pShuttleCMV) містить подвійні промотори pCMV і SV40pAs для трансгена, а також GFP з pmaxGFP ("Amaxa", Німеччина). Оптимізований фрагмент PyCS вбудовували в сайти Kpnl і HindIII вектора GFP/pShuttle-CMV. [00122] Імуногенність Ad(PyCS+GFP) визначали шляхом вимірювання величини CSспецифічної відповіді CD8+- T-лімфоцитів і рівня захисного імунітету проти плазмоїда в 10 печінковій стадії. Введення Ad(PyCS+GFP) різними шляхами при оптимальній дозі 10 вірусних часток (в.ч.) викликало такий же характер протималярійних захисних відповідей, які, як було показано, викликав AdPyCS, причому при п/ш і в/м шляху введення розвивалася найбільш сильна відповідь, яка призводить до найбільшого ступеня пригнічення печінкової стадії плазмодію у мишей, інфікованих живими спорозоїтами P. yoelii. Даний факт показує, що як вакцина Ad(PyCS+GFP) поводиться аналогічно AdPyCS (Rodrigues et al 1997), і можливо застосовний при визначенні тропізму AdPyCS in vivo. Білки капсида і серцевини аденовірусу [00123] Описані вище дослідження підтверджують, що вектори на основі рекомбінантного аденовірусу, які експресують білок CS, забезпечують сильну клітинну імунну відповідь, опосередковувану CD8+ T-лімфоцитами, але не викликають помітної гуморальної відповіді. Відповідно, оскільки гуморальна відповідь на аденовірус дикого типу часто може бути пов'язана з білками капсида, були сконструйовані вектори на основі рекомбінантного аденовірусу з модифікованими білками капсида й серцевини, щоб 1) підсилити гуморальний імунітет за рахунок активації В-лімфоцитів, 2) підсилити гуморальний імунітет за рахунок активації Тлімфоцитів і 3) перебороти існуючий імунітет на аденовіруси. [00124] Аденовірус являє собою ДНК-вмісний вірус, позбавлений ліпопротеїнової оболонки, з "оголеної" дволанцюжкової ДНК, ікосаедричної форми з 20 гранями у вигляді рівносторонніх трикутників. Капсид аденовірусу складається з 252 капсомерів, із яких 240 – це тримери гексона, а 12 – пентамери пентонів. Білок нитки, що відходить від кожної основи пентона, обумовлює приєднання до клітини-хазяїна за рахунок взаємодії з рецепторами клітини. Вторинна взаємодія виникає між мотивом RGD (Асп-Арг-Глі) в основі пентона з αvβ3, αvβ5 і аналогічними інтегринами, які полегшують наступну інтерналізацію аденовірусу в клітину (Mathias et al. 1994, Wickham et al. 1993). Більшість аденовірусів використовують рецептори до Коксекі-аденовірусу (CAR) як рецептор клітин (Bergelson et al. 1997). Крім того, було показано, що молекули MCH (Головний комплекс гістосумісності) I класу, VCAM (молекула адгезії судинного ендотелію 1 типу) і гепаран сульфат опосередковують приєднання і вхід Ad5 (Chu et al. 2001, Hong et al. 1997). Після входу шляхом ендоцитозу Ad5 швидко виходить із внутрішньоклітинних компартментів у цитозоль (Meier and Greber 2003, Leopold and Crystal 2007). Потім віріон переміщається в ядро за допомогою мікротрубочок. Білок нитки "скидається", як ранній білок капсида, у ході даного процесу (Nakano et al. 2000, Hong et al 2003). Аденовіруси різних серотипів демонструють різні патерни міграції (Miyazawa et al. 1999, Miyazawa et al. 2001). Зміна або модифікація білка нитки може впливати на міграцію, що може бути особливо важливим для переробки і представлення антигену після інфікування антиген-презентуючої клітини (АПК). [00125] Білок нитки аденовірусу являє собою тример, який підрозділяють на хвостовий, стовбурний і головний домен білка нитки (Henry et al. 1994, Rux and Burnett 2004, Chroboczek et 16 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 al. 1995). Відома третинна структура головного домена, і в сукупності з дослідженнями мутагенезу зазначені дослідження дозволяють візуалізувати області, які беруть участь у CARвзаємодії та тримеризації (Kirby et al. 1999, Xia et al. 1995). Стовбурні відростки білка нитки, які відходять від віріона, і голівка білка нитки містять домен взаємодії з рецепторами до Коксеківірусу й аденовірусу (CAR) (Roelvink et al. 1999, Bewley et al. 1999). Сайт зв'язування CAR у голівці білка нитки складається первинно з залишків з петлі AB і петлі CD, а вторинно поширюється до FG і петлі HI, а також до β-складчатостей В, Е и F (Roelvink et al. 1999, Bewley et al. 1999). Петля HI є найбільш добре вивченим сайтом вбудовування в голівці білка нитки (Worgall et al. 2004, Mizuguchi and Hayakawa 2004, Koizumi et al. 2003, Belousova et al. 2002, Noureddini and Curiel 2005, Nicklin et al. 2001), і вбудовування епітопа в петлю HI (залишки 543 і 544) призвело до утворення білка з імунітетом проти такого епітопа (Krause et al. 2006). Отже, імунодомінантний, отриманий із CS, епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами, спочатку вбудовували в петлю HI білка нитки. [00126] Гексон являє собою найбільш численний білок у капсиді аденовірусу; його кількість становить 720 копій на віріон. У зрілому вірусі гексон існує в формі гомотримерних капсомерів, які утворять собою фасетки ікосаедричного віріона (Rux and Burnett 2004). Була отримана кристалічна структура гексонів аденовірусів 2 і 5 серотипів (Ad2 і Ad5), що виявило складну молекулярну архітектуру (Athapilly et al. 1994, Roberts et al. 1986, Rux and Burnett 2000). Основа кожної мономерної субодиниці складається з двох мотивів бета-складчатостей, які присутні в білках капсида багатьох ікосаедричних вірусів. Три довгі петлі (DE1, FG1 і FG2) проходять від структури основи та утворюють опорну область кожної молекули (Rux and Burnett 2004). Послідовності в зазначених петльових доменах видаються над поверхнею капсида, утворюючи зовнішню частину віріона. Зіставлення аденовірусів різних серотипів показує, що послідовності, розташовані на зовнішній стороні капсида, мало консервативні, як за довжиною, так і за послідовністю амінокислот (Crawford-Miksza and Schnurr 1996). Крім того, було показано, що послідовності, розташовані в зазначених мало консервативних доменах, іменованих гіперваріабельними ділянками (HVR), містять детермінанти, до яких утворюються серотипспецифічні антитіла (Top 1975, Rux and Burnett 2000, Top et al. 1971). [00127] На основі зіставлення ранніх послідовностей HVR були ідентифіковані в усій молекулі гексона (Crawford-Miksza and Schnurr 1996, Roberts et al 2006). Оскільки HVR мало консервативні при порівнянні різних серотипів і, очевидно, не беруть участь у підтримці структурної цілісності гексона, можна вносити в зазначені домени невеликі зміни, не роблячи впливу на життєздатність вірусу (Rux and Burnett 2000). Наприклад, у HVR2, HVR3, HVR5, HVR6 і HVR7 можна вбудовувати гексагістидиновий маркер, не знижуючи життєздатності вірусу (Wu et al. 2005). Так HVR гексонів часто застосовують як мішені для ефективної індукції відповіді антитіл на пептиди, розташовані в HVR гексона (Worgall et al. 2005, Crompton et al. 1994). У зв'язку з малою консервативністю HVR5 гексона між серотипами стосовно довжини і його розташуванням ближче всього до зовнішньої поверхні капсида аденовірусу (Rux and Burnett 2000, Crawford-Miksza and Schnurr 1996) він спочатку був обраний як сайт для вбудовування епітопа. Також кристалічна структура гексона показує, що HVR5 являє собою гнучку петлю на поверхні капсида, що вказує на здатність HRV5 умістити відносно великі пептиди без порушення структурної цілісності капсида (Roberts et al. 1986). Недавно були ідентифіковані гексон-специфічні епітопи, які розпізнаються CD4+ і CD8+-лімфоцитами (Leen et al. 2008), і відповідь CD4+ T-клітин зосереджена у людини проти консервативних залишків у білку гексоні (Onion et al. 2007, Heemskerk et al. 2006). [00128] Серцевина аденовірусу складається з вірусного генома та чотирьох білків серцевини. Термінальний білок (TP) ковалентно пов'язаний із 5'-кінцем кожного лінійного ланцюга ДНК вірусу в двох копіях віріона. Три інших білки серцевини - mu (μ), V (pV) і VII (pVII) пов'язані з ДНК вірусу нековалентно й неспецифічно. Основним білком серцевини є pVII, його кількість становить приблизно 700-800 копій на віріон, і він служить гістоноподібним центром, навколо якого накручується ДНК вірусу, утворюючи нуклеосомну структуру. Модифікація білків капсида аденовірусу для підвищення гуморального імунітету [00129] Згідно з деякими варіантами реалізації описані вектори на основі аденовірусу зі спорозоїтами (CS), які містять імунодомінантний білок CS як епітоп, який розпізнається Влімфоцитами, у білку капсида аденовірусу (вбудований у гексон або білок нитки). Трансген може перебувати під контролем такого промотору як CMV з метою підвищення клітинної і гуморальної імунної відповіді на білок CS. [00130] Центральна область повторів являє собою консервативну структуру білка CS, характерну для всіх видів Plasmodium, і було показано, що антитіло на таку повторювану послідовність має нейтралізуючу активність стосовно спорозоїтів. Приклади повторюваних 17 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностей у білку CS Plasmodium включають повтор (NANP)n (P. falciparum; SEQ ID NO:60), повтор ANGAGNQPG (P. vivax; SEQ ID NO:63) і повтор NAAG (P. malariae; SEQ ID NO:64), які можна вбудовувати в білки капсида аденовірусу. Згідно з деякими варіантами реалізації в HVR1 гексона аденовірусу 5 серотипу можна вбудовувати чотири або більше повтори PfCSP - (NANP)n (SEQ ID NO:60). Згідно з деякими варіантами реалізації в HVR1 гексона аденовірусу 5 серотипу можна вбудовувати два, чотири, шість, вісім, десять, чотирнадцять, шістнадцять, вісімнадцять, двадцять, двадцять два, двадцять чотири, двадцять шість або двадцять вісім повторів PfCSP (NANP)n (SEQ ID NO:60; n=2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28). Повторювану послідовність (NANP)n можна додатково вбудовувати в петлю HI білка нитки. [00131] Згідно з деякими варіантами реалізації були картовані імунодомінантні епітопи, які розпізнаються нейтралізуючими В-лімфоцитами і які вбудовуються в CS, з метою розробки покращених вакцин на основі аденовірусу з білком CS. У мишей, вакцинованих рекомбінантним білком CS P. yoelii CS (PyCS), генерувалися високі титри антитіл проти двох основних імунодомінантних епітопів, які розпізнаються В-лімфоцитами, QGPGAP (SEQ ID NO:59) і QQPP (SEQ ID NO:65), але проба на нейтралізацію in vitro показує, що нейтралізуюча активність може бути обумовлена гуморальною імунною відповіддю на епітоп QGPGAP (SEQ ID NO:59) як такий, оскільки нейтралізацію вдається відвернути шляхом додавання до середовища пептиду (QGPGAP)3 (SEQ ID NO:59; n=3). Згідно з деякими варіантами реалізації в HVR1 гексона аденовірусу 5 серотипу вбудовують три або більше повтори PyCS - (QGPGAP)n (SEQ ID NO:59). Згідно з деякими варіантами реалізації в HVR1 гексона аденовірусу 5 серотипу можна вбудовувати три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять або дванадцять повторів PyCS - (QGPGAP)n (SEQ ID NO:59; n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12). Повторювану послідовність (QGPGAP)n можна додатково вбудовувати в петлю HI білка нитки. [00132] Пептид – епітоп, який розпізнається В-лімфоцитами, повинен бути присутнім на поверхні віріонів аденовірусу, щоб імунна система могла ефективно розпізнавати зазначений епітоп. Такими сайтами вбудовування можуть бути HVR гексона й структури петлі у волоконному білку, і можна сполучати різні сайти вбудовування. Модифікація білків капсида і серцевини аденовірусу для підвищення активації Т-хелперів [00133] Згідно зі ще одним варіантом реалізації епітоп, який розпізнається CD4+ лімфоцитами, специфічний для трансгена, можна вбудовувати в такі білки аденовірусу як pVII, pV і гексон з метою підвищення імуногеності вакцини на основі аденовірусу. Професійні антиген-презентуючі клітини (АПК), такі як дендритні клітини (ДК) і В-лімфоцити, можуть захоплювати розділені на частині патогени, такі як віруси, шляхом ендоцитозу і представляти CD4+-епітопи в патогені CD4+ T-лімфоцитам, які діють як клітини-хелпери при розвитку гуморальної і/або клітинної імунної відповіді. pVII і гексон можна легко використовувати як цільові білки аденовірусу для вбудовування антигенних CD4+-пептидів, оскільки в одному віріоні велике число їхніх копій (700-800 копій pVII і 720 копій гексона). Модифікація білків капсида аденовірусу для подолання існуючого імунітету до аденовірусів [00134] Згідно з деякими варіантами реалізації білки капсида аденовірусу - білок нитки і гексон – можна модифікувати шляхом вбудовування епітопів, які розпізнаються В- і Тлімфоцитами, з метою подолання проблеми існуючого імунітету до аденовірусу і/або для посилення гуморальної відповіді на вакцину на основі аденовірусу. За оцінками у 80 % молодих людей у популяції в крові циркулюють нейтралізуючі антитіла на аденовірус (Douglas 2007), особливо на 5 серотип (Ad5). У дослідженнях, де аденовірус застосовували як генотерапевтичний вектор, було показано, що наявність нейтралізуючих антитіл у тварин обмежує експресію трансгенів, які доставляються аденовірусами. Крім нейтралізуючих антитіл обмеженню експресії рекомбінантних генів також сприяють відповіді CD8+T-лімфоцитів (Yang et al. 1995, Yang et al 1996). Раніше повідомлялося, що такий передіснуючий імунітет до аденовірусу знижує ефективність вакцин на основі рекомбінантних аденовірусів (Papp et al. 1999), а також знижує імуногенність вакцини на основі аденовірусів у клінічних дослідженнях (Priddy et al. 2008). [00135] Гексон є основною мішенню імунних відповідей, спрямованих на капсид аденовірусу (Roy et al. 2005, Wohlfart 1988), і, ймовірно, обумовлює ефективну ад'ювантну дію аденовірусу, включаючи індукцію відповідей CD4+ і CD8+ T-лімфоцитів. Отже, одна зі стратегій, які були застосовані для подолання імунітету до аденовірусу, полягає в тому, щоб замінити весь гексон або його частину іншим білком, наприклад, білком рідких серотипів, таких як аденовірус 11, 24, 26 і 35. Оскільки гексон є основною мішенню нейтралізуючих антитіл проти аденовірусу (Youil et al. 2002, Sumida et al. 2005), можна замінити гексон або HVR гексона на аналогічні ділянки рідких серотипів (Wu et al. 2002, Roberts et al. 2006). [00136] Згідно зі ще однією стратегією, описаною в одному з варіантів реалізації даної 18 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 заявки, гексон аденовірусу можна модифікувати шляхом заміни HVR1 або HVR5 на антигенний пептид з метою подолання передіснуючого імунітету до аденовірусу або наявності нейтралізуючих антитіл на аденовірус, які утворилися внаслідок раніше проведеної вакцинації вектором на основі аденовірусу. Згідно з деякими варіантами реалізації антигенним пептидом може бути імуногенний епітоп білка CS Plasmodium, і згідно з певними аспектами зазначений епітоп може містити центральну повторювану послідовність, послідовність епітопа, який розпізнається CD4+-лімфоцитами, або послідовність епітопа, який розпізнається CD8+лімфоцитами. [00137] Повторне введення вектора на основі Ad того ж серотипу неприпустиме через розвиток анти-Ad імунітету після вакцинації. Отже, для багатьох вакцин на основі Ad підтримуюча вакцинація утруднена через порушення експресії і представлення антигену, який кодується трангеном (Yang 1995, Hackett et al. 2000, Harvey et al. 1999, Mastrangeli et al. 1996). Додавання специфічного епітопа в капсид Ad, такого як епітопи, описані в наступних прикладах, може скоротити або усунути дану перешкоду згідно з деякими варіантами реалізації. [00138] Наступні приклади наведені з метою проілюструвати варіанти реалізації, і їх не слід інтерпретувати як такі, що обмежують об'єм яких-небудь заявлених варіантів реалізації. У випадку, якщо згадуються конкретні матеріали, це зроблено винятково з метою ілюстрації, але не з метою обмеження винаходу. Фахівець у даній області може розробити еквівалентні засоби або реактиви без додаткової винахідницької активності і не виходити за межі області даного винаходу. Очевидно, процедури, що описані в даній заявці, допускають різноманітні варіації, які виходять за рамки даного винаходу. За задумом авторів винаходу такі варіанти включені в об'єм даного винаходу. Приклад 1: Конструювання плазмідних векторів на основі аденовірусу з модифікованим капсидом, який містить білок circumsporozoite плазмодію, і часток рекомбінантного аденовірусу Картування епітопів [00139] Спочатку вибирали імунодомінантний епітоп, який розпізнається нейтралізуючими Влімфоцитами. Не вакцинованих раніше мишей Balb/c тричі імунізували рекомбінантним білком PyCS із неповним ад'ювантом Фрейнда, і об'єднану сироватку застосовували для визначення критичного епітопа нейтралізуючого антитіла. [00140] Якщо коротко, при проведенні тесту на нейтралізацію як клітини-мішені застосовували клітини HepG2 людини, які експресують CD81. CD81 являє собою молекулу, необхідну малярійному плазмодію для утворення паразитофорних вакуолей у гепатоцитах, де вони розмножуються і переходять у стадію шизонтів (Silvie et al 2006), що призводить до значного збільшення інфекційності спорозоїтів in vitro. [00141] У зазначеному тесті синтетичні пептиди PyCS додавали в лунки, де вони блокували пептид-специфічне антитіло. Результати картування епітопів показали, що центральна повторювана послідовність PyCS, QGPGAP (SEQ ID NO:59), є більше ефективним нейтралізуючим епітопом PyCS, ніж послідовність QQPP (SEQ ID NO:65). Відповідно, для модифікації білків капсида, гексона і/або білка нитки застосовували вбудовування епітопа (QGPGAP)n (SEQ ID NO:59). Конструювання плазмідних векторів з модифікованим капсидом [00142] "Човниковий" вектор на основі аденовірусу pShuttle-CMV (STRATAGENE) модифікували шляхом вбудовування касети експресії GFP нижче сайту клонування. Спочатку у фрагмента BsmBI-Sac (pCMV+GFP) і фрагмента Sac-BsmBI (сигнал поліА SV40) pmaxGFP ("Lonza", Кельн, Німеччина) "затуплювали кінці" і вбудовували їх у "затуплені" сайти Sall і Kpnl в pUC19, відповідно. Фрагмент BamHI-EcoRI отриманого в результаті pCMV-GFP/pUC19 вбудовували в ті ж сайти SV40p/pUC19 з отриманням фрагмента SV40 p-pCMV-GFP. У зазначеного фрагмента "затуплювали кінці" і вбудовували його в сайт EcoRV вектора pShuttleCMV. Отриманий у результаті човниковий вектор (GFP/Shuttle-CMV) містив подвійні промотори pCMV і SV40pAs для трансгену і GFP. [00143] Ще одну модифікацію човникового вектора на основі аденовірусу одержували шляхом заміни області промотору CMV на промотор CMV5 із pQBI-AdCMV5 (QBIOgene). Щоб сконструювати вектор pShuttle-CMV5, фрагмент SgrAI-Kpnl вектора заміняли фрагментом, який містить послідовність промотору CMV5 і розташовану вище послідовність із промотору CMV у векторі pShuttle-CMV. [00144] Ген CS (PyCS) P. yoelii піддавали оптимізації кодонів за винятком повторів (QGPGAP)n (SEQ ID NO:59) шляхом ПЛР, яка перекривається, на основі алгоритму оптимізації кодонів JCat (http://www jcat de/). [00145] Як шаблонову послідовність для оптимізації кодонів застосовували послідовність амінокислот PfCSP штаму 3D7 P. falciparum. Оптимізацію кодонів для експресії білка у людини 19 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проводили за допомогою оптимізуючої комп'ютерної програми Integrated DNA Technologies (Технології інтегрованих ДНК, Coralville, IA США). Фрагменти ДНК, які кодують увесь PfCSP за винятком GPI-заякореного мотиву на С-кінці (Фіг. 10; SEQ ID ), синтезували за допомогою Технології інтегрованих ДНК. [00146] Ген із оптимізацією кодонів PyCS (Фіг. 9; SEQ ID NO:1) або ген PfCSP (Фіг. 10; SEQ ID ) вбудовували в сайти Kpnl і HindIII вектора pShuttle-CMV, pShuttle-CMV5 або GFP/pShuttleCMV. Отримані човникові вектори на основі аденовірусу, які кодують білок circumsporozoite плазмодію, застосовували для гомологічної рекомбінації з використанням AdEasy-1 для конструювання генома аденовірусу, який містив ген антигену circumsporozoite плазмодію й послідовність, яка кодує інтактний білок аденовірусу. Якщо коротко, човникові вектори на основі аденовірусу, які кодують білок circumsporozoite плазмодію, лінеаризували шляхом розщеплення ферментом Pmel, і спільно трансформували клітини E. coli BJ5183 лінеаризованим човниковим вектором і вектором pAdEasy-1 (Bruna-Romero et al 2003) з метою гомологічної рекомбінації. [00147] На Фіг. 1 в узагальненому вигляді представлена і проілюстрована модифікація білків капсида аденовірусу. На Фіг. 2 проілюстрована модифікація послідовності HVR1 в ДНК генома аденовірусу. Якщо коротко, AdEasy-1 розщеплювали за допомогою ферменту Sfil, і фрагмент 6,4 т.п.н. субклонували в сайти EcoRI і PstI pUC19 за допомогою лінкерних олігомерів EcoRI- SfiI і PstI- SfiI. Для заміни HVR1 на епітоп circumsporozoite плазмодію, який розпізнається Влімфоцитами, ділянку, яка містить сайти Agel і Ndel, ампліфікували шляхом двоетапної ПЛР із застосуванням праймерів, які містили послідовність епітопа замість послідовності HVR1. Продукт ПЛР розщеплювали за допомогою Agel і Ndel, і потім застосовували для заміни нативної ділянки Agel-Ndel фрагмента Sfil у векторі Sfil/pUC19. Після підтвердження послідовності фрагмент Sfil у ДНК генома аденовірусу заміняли фрагментом Sfil, який містить послідовність епітопа спорозоїта, і одержували гексон, модифікований за HVR1. Згідно з деякими варіантами реалізації гексон, модифікований за HVR, може містити послідовність нуклеїнової кислоти відповідно до SEQ ID NO:3 (Фіг. 11), SEQ ID NO:4 (Фіг. 12), SEQ ID NO:5 (Фіг. 13), SEQ ID NO:6 (Фіг. 14), SEQ ID NO:7 (Фіг. 15), SEQ ID NO:8 (Фіг. 16), SEQ ID NO:9 (Фіг. 17), SEQ ID NO:10 (Фіг. 18), SEQ ID NO:11 (Фіг. 19), SEQ ID NO:12 (Фіг. 20), SEQ ID NO:13 (Фіг. 21), SEQ ID NO:14 (Фіг. 22), SEQ ID NO:15 (Фіг. 23), SEQ ID NO:16 (Фіг 24), SEQ ID NO:17 (Фіг. 25), SEQ ID NO:18 (Фіг. 26), SEQ ID NO:19 (Фіг. 27), SEQ ID 0 (Фіг. 28), SEQ ID 1 (Фіг. 29), SEQ ID 2 (Фіг. 30) або SEQ ID 3 (Фіг. 31). [00148] Щоб вмонтувати (NANP)28 (SEQ ID NO:60; n=28) у HVR1, частину центральної повторюваної ділянки PfCSP з оптимізацією кодонів ампліфікували шляхом ПЛР із використанням праймерів, які містять гексон-специфічну послідовність на 5’-кінці й NANPспецифічну послідовність на 3’-кінці, і отриманий у результаті фрагмент ДНК вбудовували в ділянку Agel-Ndel шляхом другої ПЛР. [00149] Для модифікації за HVR5, як показано на Фіг. 3, в петлю L1 HVR5 гексона в Ad Easy1 уводили сайт Xbal, а потім синтезований фосфорильований дволанцюжковий олігомер, який кодує епітоп circumsporozoite плазмодію, вбудовували в сайт Xbal. Вбудовування підтверджували шляхом секвенування (Фіг. 31; SEQ ID 3). [00150] Для модифікації білка нитки, як показано на Фіг. 4, фрагмент Spel-Pacl вектора AdEasy-1 субклонували в сайти EcoRI і Pstl pUC19 за допомогою лінкерних олігомерів EcoRIPacl і PstI-Spel. Щоб вмонтувати послідовність епітопа circumsporozoite плазмодію, який розпізнається В-лімфоцитами, в петлю HI голівки білка нитки, ділянку, яка містить сайти EcoNI (або Nhel) і Mfel ампліфікували шляхом двоетапної ПЛР із застосуванням праймерів, які містили послідовність епітопа. Продукт ПЛР розщеплювали за допомогою EcoNI (або Nhel) і Mfel, і потім застосовували для заміни нативної ділянки EcoNI (або Nhel) -Mfel білка нитки у векторі SpelPacl/pUC19. Після підтвердження послідовності (Фіг. 32, SEQ ID 4; Фіг.33, SEQ ID 5) фрагмент Spel-Pacl вектора AdEasy-1 заміняли фрагментом Spel-Pacl, який містить послідовність епітопа. Отриману ДНК аденовірусу з модифікованим білком нитки застосовували для гомологічної рекомбінації човниковим вектором на основі аденовірусу, який кодує білок circumsporozoite плазмодію, і одержували ДНК аденовірусу з білком нитки, модифікованим шляхом вбудовування circumsporozoite плазмодію. [00151] Щоб сконструювати ДНК аденовірусу з модифікованим HVR1 і білком нитки, яка містить дві вставки епітопів, фрагмент Sfil-Sfil ДНК аденовірусу з модифікованим білком нитки заміняли фрагментом Sfil-Sfil, який містить епітоп білка circumsporozoite в HVR1, як показано на Фіг. 5. [00152] Щоб модифікувати С-кінець pVII, ділянку, яка містить сайти Sfi I і Sal I, ампліфікували шляхом двоетапної ПЛР із застосуванням праймерів, які містили послідовність епітопа білка спорозоїта. Продукт ПЛР розщеплювали за допомогою SfiI і SalI, і потім застосовували для 20 UA 108081 C2 5 10 15 20 заміни нативної ділянки SfiI-SalI вектора SfiI/pUC19 (Фіг. 6, 7 і 8). Після підтвердження послідовності (Фіг. 34, SEQ ID 6; Фіг. 35, SEQ ID 7) фрагмент SfiI-SfiI у ДНК аденовірусу з HVR1 і/або білком нитки, модифікованим шляхом вбудовування circumsporozoite плазмодію, заміняли фрагментом SfiI-SfiI, який містить епітоп білка circumsporozoite плазмодію в pVII. [00153] Щоб вмонтувати послідовність епітопа білка спорозоїта, який розпізнається CD4+лімфоцитами, EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT (SEQ ID NO:62), в pVII, фрагмент довжиною приблизно 7,7 т.н. вектора pAdEasy-1 підготовляли шляхом розщеплення RsrII і клонували між сайтами EcoRI і HindIII плазміди pUC19 за допомогою лінкера RsrII (RsrII/pUC19). Ділянку, що містить сайти AscI і BglII в RsrII/pUC19, ампліфікували шляхом двоетапної ПЛР із застосуванням праймерів, які містили послідовність епітопа. Продукт ПЛР розщеплювали за допомогою AscI і BglII, і потім застосовували для заміни нативної ділянки AscI і BglII у плазміді RsrII/pUC19. Після підтвердження послідовності (Фіг. 36, SEQ ID 8; Фіг. 37, SEQ ID 9), фрагмент RsrII у ДНК аденовірусу, модифікованого за HVR1, заміняли фрагментом RsrII, який містить послідовність епітопа. [00154] Рекомбінантні аденовіруси, перераховані в Таблиці 1 (P. yoelii) і Таблиці 2 (P. falciparum) нижче, були сконструйовані для оцінки впливу вбудовування епітопа на інфекційність, імуногенність і чутливість до передіснуючого імунітету до аденовірусу. Застосовувані вектори на основі рекомбінантних аденовірусів були векторами з дефектною реплікацією на основі аденовірусу 5 серотипу з делетованими E1 і E3 (STRATAGENE). На Фіг. 1 наведена структурна схема рекомбінантного аденовірусу з модифікованим капсидом із вбудованим білком спорозоїта плазмодію. Антиген Рекомбінантний аденовірус wt/порожній Трансген CMV Немає wt/GFP CMV GFP wt/ PyCSGFP CMV PyCS+GF P Гексон Білок нитки pVII Гексон Білок нитки pVII Положення (а/к) Гексон Білок нитки pVII Промотор Білок адено- Сайт вірусу інсерції Послідовність, Довжина яка вбудовується (QGPGAP) 3-Fib/PyCSGFP CMV CMV PyCS+GF P PyCS+GF P PyCS+GF P Гексон HVR1 зі 138 до 164 (QGPGAP)3 18 Гексон HVR5 між 268 і 269 (QGPGAP)3 18 Білок нитки pVII (QGPGAP) 3-HVR5/ PyCS-GFP CMV Білок нитки pVII (QGPGAP) 3-HVR1/ PyCS-GFP Гексон Петля HI між 543 і 544 (QGPGAP)3 18 Білок нитки pVII 21 UA 108081 C2 Антиген Рекомбінантний аденовірус (QGPGAP) 3-HVR1/Fib/ PyCS-GFP Промотор Трансген CMV PyCS+GF P Білок адено- Сайт вірусу інсерції Гексон Білок нитки pVII (QGPGAP) 3-Fib/PyCD 4pVII-1/ PyCS-GFP CMV PyCS+GF P Білок нитки pVII Білок circums porozoit e P. yoelii (PyCS) wt/cmv 5PyCS Положення (а/к) Послідовність, Довжина яка вбудовується HVR1 зі 138 до 164 (QGPGAP)3 18 Петля HI між 543 і 544 (QGPGAP)3 18 Петля HI між 543 і 544 (QGPGAP)3 між 198 і Стерміную YNRNIVNRLLGD кінець чим ALNGKPEEK кодоном 18 21 (QGPGAP) 7-HVR1/cmv 5-PyCS CMV5 PyCS PyCS Гексон HVR1 зі 138 до 164 (QGPGAP)3 18 Гексон HVR1 зі 138 до 164 (QGPGAP)4 24 Гексон HVR1 зі 138 до 164 (QGPGAP)5 30 Гексон HVR1 зі 138 до 164 (QGPGAP)6 pVII CMV5 PyCS Білок нитки (QGPGAP) 6-HVR1/cmv 5-PyCS CMV5 PyCS Білок нитки pVII (QGPGAP) 5-HVR1/cmv 5-PyCS CMV5 PyCS Білок нитки pVII (QGPGAP) 4-HVR1/cmv 5-PyCS CMV5 Білок нитки pVII (QGPGAP) 3-HVR1/cmv 5-PyCS PyCS Гексон Білок нитки pVII CMV5 Гексон HVR1 зі 138 до 164 (QGPGAP)7 42 Білок нитки pVII 22 UA 108081 C2 Антиген Рекомбінантний аденовірус (QGPGAP) 8-HVR1/cmv 5-PyCS Промотор Трансген CMV5 PyCS Білок адено- Сайт вірусу інсерції Положення (а/к) Послідовність, Довжина яка вбудовується PyCS Гексон HVR1 зі 138 до 164 (QGPGAP)9 54 Гексон HVR1 зі 138 до 164 (QGPGAP)11 66 Гексон HVR1 зі 138 до 164 (QGPGAP)12 72 pVII CMV5 Білок нитки (QGPGAP) 12-HVR1/cmv 5-PyCS pVII PyCS Білок нитки CMV5 48 pVII (QGPGAP) 11-HVR1/cmv 5-PyCS (QGPGAP)8 Білок нитки PyCS зі 138 до 164 pVII CMV5 HVR1 Білок нитки (QGPGAP) 9-HVR1/cmv 5-PyCS Гексон Таблиця 2 Рекомбінантні аденовіруси (білок circumsporozoite Plasmodium falciparum) Білок Рекомбінантн Промот Трансг Сайт Положенн Послідовність, аденовіру ий аденовірус ор ен інсерції я (а/к) яка вбудовується су Гексон Білок wt/PfCSP CMV PfCSP Білок нитки circumsporopVII zoite P. зі 138 до falciparum Гексон HVR1 (NANP)4 164 (PfCSP) (NANP) 4PfCSP CMV Білок HVR1/PfCSP нитки pVII Антиген 23 Довжина 16 UA 108081 C2 Продовження таблиці 2 (NANP) 4HVR1/Fib/PfC SP (NANP) 6HVR1/PfCSP CMV CMV PfCSP PfCSP Петля HI Гексон CMV PfCSP Гексон Білок нитки pVII HVR1 Білок нитки pVII Петля HI Гексон (NANP) 4Fib/PfCSP HVR1 Білок нитки pVII Гексон (NANP) 8HVR1/PfCSP CMV PfCSP Білок нитки pVII Білок circumsporozoite P. falciparum (PfCSP) CMV PfCSP PfCSP (NANP)4 16 (NANP)4 16 (NANP)6 зі 138 до 164 HVR1 (NANP)8 зі 138 до 164 зі 138 до 164 Білок нитки pVII HVR1 40 (NANP)12 зі 138 до 164 (NANP) 16HVR1/PfCSP CMV PfCSP PfCSP HVR1 Білок нитки pVII HVR1 зі 138 до 164 (NANP)16 зі 138 до 164 Білок нитки pVII Гексон (NANP) 18HVR1/PfCSP CMV PfCSP Білок нитки pVII Гексон (NANP) 20HVR1/PfCSP CMV PfCSP Білок нитки pVII Гексон (NANP) 22HVR1/PfCSP wt/cmv 5PfCSPCMV5 PfCSP CMV CMV5 PfCSP PfCSP 48 Гексон CMV 32 Гексон (NANP) 14HVR1/PfCSP 24 HVR1 Білок нитки pVII 16 Гексон (NANP) 12HVR1/PfCSP CMV (NANP)4 Гексон (NANP) 10HVR1/PfCSP між 543 and 544 зі 138 до 164 між 543 і 544 зі 138 до 164 Білок нитки pVII Гексон Білок нитки pVII 24 HVR1 (NANP)14 (NANP)18 зі 138 до 164 64 72 56 HVR1 (NANP)20 HVR1 зі 138 до 164 (NANP)22 80 88 UA 108081 C2 Продовження таблиці 2 (NANP) 22HVR1/cmv 5- CMV5 PfCSP 5-PfCSP (NANP) 28HVR1/cmv 5- CMV5 PfCSP PfCSP Гексон HVR1 зі 138 до 164 (NANP)22 Білок нитки pVII Гексон HVR1 Білок нитки pVII зі 138 до 164 CMV PfCSP HVR1 Білок нитки pVII (NANP) 4Білок HVR1/Fib/PfC CMV circumsporozoD 4-pVIIite P. falciparum 1/PfCSP (PfCSP) (NANP) 4HVR1/PfCD 4-pVII2/PfCSP (NANP) 4HVR1/PfCD 4-pVII3/PfCSP CMV CMV С-кінець Гексон Білок нитки Петля HI pVII С-кінець Гексон (NANP) 4Fib/PfCD 4- CMV pVII-1/PfCSP HVR1 Білок нитки PfCSP PfCSP PfCSP PfCSP (NANP) 22HVR1/PfCD CMV5 PfCSP 4-pVII-3/cmv 5-PfCSP (NANP) 28HVR1/PfCD 4-pVII-3/cmv CMV5 PfCSP 5-PfCSP 112 Гексон (NANP) 4HVR1/PfCD 4-pVII1/PfCSP зі 138 до (NANP)17(NVDP)1 164 88 (NANP)4 між 198 і термінуюч EYLNKIQNSLSTE им WSPCSVT кодоном між 543 і (NANP)4 544 між 198 і термінуюч EYLNKIQNSLSTE им WSPCSVT кодоном зі (NANP)4 138до164 16 20 16 20 16 між 198 і термінуюч EYLNKIQNSLSTE pVII С-кінець им WSPCSVT кодоном зі 138 до Гексон HVR1 (NANP)4 164 Білок нитки між Середи EYLNKIQNSLSTE pVII кодонами на WSPCSVT 92 і 93 зі 138 до Гексон HVR1 (NANP)4 164 Білок нитки між Середи EYLNKIQNSLSTE pVII кодонами на WSPCSVT 140 і 141 зі 138 Гексон HVR1 (NANP)22 до164 Білок нитки між Середи EYLNKIQNSLSTE pVII кодонами на WSPCSVT 140 і 141 зі 138 (NANP)17(NVDP) Гексон HVR1 до164 1 Білок нитки між Середи EYLNKIQNSLSTE pVII кодонами на WSPCSVT 140 і 141 20 16 20 16 20 88 20 112 20 [00155] Плазміду на основі геномної ДНК аденовірусу з модифікованим капсидом очищали, 25 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переводили в лінійну форму шляхом розщеплення за допомогою Pacl і застосовували для трансфекції клітин AD293. [00156] Частки аденовірусу готували з трансфекованих клітин AD293 шляхом проведення чотирьох циклів заморожування/розморожування й застосовували для наступної ампліфікації вірусу. Після останньої ампліфікації частки аденовірусу очищали шляхом центрифугування в градієнті щільності CsCl. Потім відбирали доріжку й піддавали її діалізу проти буфера для діалізу, щоб видалити CsCl. Кількість часток вірусу (v.p.) визначали на основі OD (оптичної 12 щільності) на довжині хвилі 260 нм (1 OD260=1,25 × 10 v.p./мл) (Bruna-Romero et al. 2003). [00157] Під час процедури ампліфікації серед аденовірусів із модифікованим капсидом спостерігалися лише невеликі відмінності в рості аденовірусу, що вказує на те, що модифікація не чинить ніякої несприятливої дії на інфекційність і продуктивність аденовірусів. Приклад 2: Імунна відповідь, специфічна стосовно білка circumsporozoite Plasmodium yoelii Перевірка рекомбінантних аденовірусів із білком Plasmodium yoelii [00158] Човникові вектори на основі аденовірусу, які несуть білок circumsporozoite плазмодію, застосовували для тимчасової трансфекції, щоб підтвердити експресію білка circumsporozoite плазмодію з застосуванням клітин AD293 (Фіг. 38). Через 24 години після трансфекції клітини піддавали лізису в буфері для розведення проб із SDS (додецил-сульфатом натрію), після чого проводили електрофорез у поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (SDS PAGE) і вестерн-блоттінг із моноклональним анти-PyCS антитілом (9D3). [00159] Щоб підтвердити вбудовування епітопа в білки капсида аденовірусу, очищені рекомбінантні аденовіруси аналізували методом електрофорезу в SDS-ПААГ (2 × 109 v.p./доріжку), а також проводили вестерн-блоттінг (1 × 109 v.p./доріжку) з антитілом до спорозоїту, яке розпізнавало повтори (QGPGAP) n (SEQ ID NO:59), як показано на Фіг. 39A і 40A. Інтенсивність смуг на Фіг. 39А корелювала з числом копій білка капсида у віріоні аденовірусу: число копій білка нитки (36 копій на віріон) у двадцять разів менше, ніж число копій гексона (720 копій на віріон). Нижня смуга на доріжці 4 на Фіг. 39А, імовірно, відповідає розщепленому гексону. Інтенсивність смуг на Фіг. 40A корелювала з числом повторів (QGPGAP)n (SEQ ID NO:59), вбудованих у HVR1. [00160] Щоб оцінити, чи є присутнім епітоп PyCS, який розпізнається В-лімфоцитами, на поверхні віріона, серійні розведення часток очищеного рекомбінантного аденовірусу наносили на планшет для твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) і проводили детекцію за допомогою анти-PyCS антитіла, яке розпізнає повтори (QGPGAP) n (SEQ ID NO:59). Антитіло розпізнало всі аденовіруси з модифікованим капсидом (Фіг. 39B і 40B). Результати ELISA вказують на те, що епітоп PyCS, який розпізнається В-лімфоцитами, вбудований у білки капсида, стабільно з'являється на поверхні віріонів аденовірусу. Імунна відповідь, специфічна для білка circumsporozoite Plasmodium yoelii, після вакцинації аденовірусом з модифікованим капсидом, який містить PyCS [00161] Самок мишей BALB/c у віці шести-восьми тижнів придбали в "Taconic" (Гудзон, Нью Йорк, США) і утримували в стандартних умовах у Центрі досліджень лабораторних тварин Університету Рокфеллера. Для вакцинації аденовіруси розводили у ФСБ і вводили внутрішньом'язово в зазначених дозах. [00162] Для оцінки імуногенності рекомбінантних аденовірусів після однократної вакцинації групи раніше не вакцинованих мишей BALB/c (п'ять тварин на групу) вакцинували шляхом внутрішньом'язового введення різних рекомбінантних PyCS аденовірусів у кількості 1 × 109 v.p. і оцінювали клітинні імунні відповіді (КІВ) через 2 тижні після вакцинації методом імуноферментних плям (Фіг. 41А). [00163] Кількість PyCS-специфічних секретуючих IFN-γ CD8+T-лімфоцитів у селезінці вакцинованих мишей визначали методом імуноферментних плям (ELISPOT) із застосуванням синтетичного пептиду, який відповідає епітопу, який розпізнається CD8+T-лімфоцитами (SYVPSAEQI; SEQ ID NO:66), у білку PyCS. Якщо коротко, планшети на 96 лунок з нітроцелюлози (Milititer HA, "Millipore") на одну ніч покривали антимишачим інтерфероном γ mAb, R4. після інкубації протягом ночі при кімнатній температурі лунки багаторазово промивали культуральним середовищем і блокували культуральним середовищем протягом 4 годин. У лунки для тесту ELISPOT додавали 5 × 105 спленоцитів, узятих у вакцинованих мишей, у присутності або під час відсутності 10 мкг/мл пептиду епітопа, який розпізнається CD8+Tлімфоцитами, і інкубували протягом 24 годин при 37 °C і 5 % CO2. Після рясного промивання планшетів ФСБ, який містить 0,05 % Tween 20 (PBST), додавали біотинільовані моноклональні антитіла до інтерферон γ миші, XMG1.2, в PBST, і інкубували протягом ночі при 40 °C. Після промивання буфером PBST планшети інкубували з міченим пероксидазою авідином 26 UA 108081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ("eBiosciences"). Плями з'являлися при додаванні субстрату 3-аміно-9-етилкарбазолу (АЕК) ("BD Biosciences"). [00164] Усі аденовіруси з модифікованим капсидом викликали порівнянний рівень клітинного імунітету проти аденовірусів із інтактним білком капсида в даній дозі (Фіг. 41B). [00165] Далі мишам BALB/c, які не піддавалися раніше вакцинації, вводили кілька доз 10 рекомбінантних аденовірусів із збільшенням дози, тобто 1 × 108, 1 × 109 і 1 × 10 v.p., з 3тижневими інтервалами, як показано на Фіг. 42А. PyCS-специфічну гуморальну відповідь визначали методом ELISA. Із хвостової вени вакцинованих мишей брали по п'ять мікролітрів крові й розводили в 495 мкл ФСБ, потім зазначені проби центрифугували при 5 000 об/хв протягом 5 хв для приготування проб розведеної плазми (x100). Планшети для ELISA Maxisorp покривали CS-специфічним пептидом ((QGPGAP)3; SEQ ID NO:59, n=3) у концентрації 5 мкг/мл у 0,1М натрій-карбонатному буфері (pН 9,5) і залишали на ніч при 4 °C. Планшети промивали й блокували 1х розріджувачем протягом 2 годин при кімнатній температурі. Потім планшети промивали повторно й додавали в них по 100 мкл плазми або сироватки, підданої послідовному дворазовому розведенню в 1х розріджувачі; далі планшети інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі. Планшети промивали й інкубували зі 100 мкл міченого пероксидазою хріну (HRP-міченого) антитіла кози до IgG миші. Усі пептиди були синтезовані компанією "Biosyntheis" (Луісвіл, Техас, США). [00166] При такому ж режимі вакцинації всі аденовіруси з модифікованим капсидом викликали гуморальну відповідь із утворенням анти-(QGPGAP)3, який за рівнем значно перевищував відповідь на wt/PyCS-GFP до тижня 10 (Фіг. 42B). [00167] Для визначення ефективності вакцини на основі аденовірусу з модифікованим капсидом вакцинованих мишей інфікували, вводячи їм 2 × 104 контагіозних спорозоїтів P. yoelii шляхом ін'єкції у хвостову вену на тижні 10. Через 42 години після інфікування спорозоїтами концентрацію паразитів визначали, підраховуючи число плазмодій-специфічних рибосомальних РНК у печінці мишей і виражаючи його як відношення абсолютного числа копій рибосомальної РНК плазмодію до абсолютного числа мРНК GADPH (гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази) миші. Для статистичного аналізу значення піддали логарифмічному перетворенню, і далі для визначення відмінностей був застосований односторонній ANOVA (дисперсійний аналіз) з наступним застосуванням критерію Дуннетта. [00168] Вакцинації з застосуванням (QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP, (QGPGAP)3-Fib/PyCS-GFP або (QGPGAP)3-HVR1/Fib/PyCS-GFP викликали більш високий рівень захисту, ніж вакцинація з застосуванням wt/PyCS-GFP, і призводили до значно більш низьких концентрацій плазмодію в мишей, інфікованих малярією (Фіг. 42C). [00169] Далі оцінювали функціональні властивості PyCS-специфічного антитіла, яке індукується у відповідь на аденовіруси з модифікованим капсидом. Спочатку, щоб перевірити, чи здатна сироватка мишей, вакцинованих аденовірусом на тижні 10 (Фіг. 42A), розпізнавати інтактні спорозоїти, проводили непрямий імунофлуоресцентний аналіз (ІФА). У тесті ІФА висушені на повітрі спорозоїти на предметних стеклах із множинними мазками інкубували з 3 % бичачим сироватковим альбуміном (БСА) у ФСБ протягом однієї години, а потім інкубували з розведеною сироваткою протягом однієї години. Після промивання предметні стекла інкубували зі вторинними антитілами із флуоресцентною міткою протягом однієї години. Далі предметні стекла промивали, і на них визначали ІФА титри як максимальне розведення, яке дає флуоресценцію під флуоресцентним мікроскопом. І (QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP, і (QGPGAP)3HVR1/Fib/PyCS-GFP давали максимальні ІФА-титри проти спорозоїтів (Фіг. 43A), що вказує на те, що вбудовування епітопа (QGPGAP)3 в HVR1 гексона аденовірусу надає аденовірусу здатність до індукції повноцінної відповіді антитіл не тільки проти синтетичного пептиду, але також і проти нативного епітопа, присутнього в малярійному плазмодії. [00170] На другому етапі, щоб визначити, чи виробляються в мишей, вакцинованих аденовірусом з модифікованим капсидом (Фіг. 42А), "функціональні" антитіла, здатні нейтралізувати інфекційність спорозоїтов, проводили тест на нейтралізацію спорозоїтів in vitro. [00171] У тесті на нейтралізацію in vitro спорозоїти P. yoelii додавали до CD81/HepG2 у планшеті на 96 лунок у присутності 30-кратно розведеної об'єднаної сироватки, отриманої від вакцинованих аденовірусом мишей. Після двогодинної інкубації неінфіковані спорозоїти відмивали середовищем і потім зазначені клітини культивували протягом 42 годин. Відношення кількості рибосомальної РНК плазмодію до мРНК GADPH людини вимірювали за допомогою ПЛР у режимі реального часу (Ophorst et al. 2006). [00172] Проби об'єднаної сироватки, узятої в мишей, вакцинованих аденовірусом з модифікованим капсидом, зокрема (QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP і (QGPGAP)3-HVR1/Fib/PyCSGFP, майже повністю (99 %) придушували інфекційність спорозоїтів in vitro (Фіг. 43B). Примітно, 27 UA 108081 C2 5 10 що ступінь придушення в даному тесті був обернено пропорційним титрам ІФА, показаним на Фіг. 43А. Захист від еритроцитарної стадії малярії [00173] Далі визначали, чи захищає вакцинація rAd з модифікованим капсидом від розвитку еритроцитарної стадії малярії після зараження спорозоїтом. Експерименти проводили двічі, і в кожному експерименті 20 мишей BALB/c у кожній групі вакцинували три рази з застосуванням wt/PyCS-GFP або (QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP, як показано на Фігурі 42А, і через 4 тижні після останньої вакцинації мишей інфікували, вводячи внутрішньовенно 50 спорозоїтів P. yoelii. Мазки крові, офарблені за Гімзе, досліджували через 3-12 днів після зараження з метою виявлення еритроцитарної стадії малярії. У групі, вакцинованої wt/CS-GFP, були інфіковані 30 із 40 мишей (75 %), а в групі без вакцинації були інфіковані 35 з 40 мишей (87,5 %) (Таблиця 3, нижче). Миші, вакциновані (QGPGAP)3-HVR1/CS-GFP, були краще захищені, ніж миші, вакциновані wt/CS-GFP; у даній групі були інфіковані тільки 15 з 40 мишей (37,5 %), що узгоджується з результатом оцінки захисту, у якій вимірювали концентрацію паразитів у печінці (Фігура 42C). 15 Таблиця 3 Детекція еритроцитарної стадії інфікування малярійним плазмодієм після вакцинації wt/PyCS-GFP або (QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP. Вакцинація Кількість мишей (яким уводили спорозоїти) Кількість мишей (інфікованих) Захист (%) 20 20 20 18 14 10 10 30 50 20 20 20 17 16 5 15 20 75 40 40 40 35 30 15 87,5 75 37,5 Експеримент 1 Відсутня wt/PyCS-GFP (QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP Експеримент 2 Відсутня wt/PyCS-GFP (QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP Усього Відсутня wt/PyCS-GFP (QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP 20 25 30 35 40 Первинна-підтримуюча вакцинація 1 [00174] Потім, раніше не вакциновані миші BALB/c одержували "бустер-дози" HVR1модифікованих аденовірусів із PyCS, які містили чотири або шість повторів (QGPGAP)n (SEQ ID NO:59; n=4, 6), з ад'ювантом або без нього, у декількох зростаючих дозах (тобто, 1 × 108, 1 × 10 109 і 1 × 10 v.p.) з 3-тижневими інтервалами, як показано на Фіг. 44А. У даному експерименті як ад'ювант застосовували Sigma Adjuvant System ("Sigma-Aldrich"), що містить 200 мкг/мл сапоніну ("Sigma-Aldrich"). Один флакон Sigma Adjuvant System (1 мл) містить 0,5 мг монофосфорил-ліпіду А (знешкодженого ендотоксину) з Salmonella minnesota і 0,5 мг синтетичної трегалози-дикоріноміколату в 2 % олії (сквален) -Tween 80 у воді. Перед вакцинацією розчин аденовірусу змішували з рівною кількістю ад'юванта. 100 мікролітрів суміші аденовірус-ад'ювант уводили внутрішньом'язово. PyCS-специфічну гуморальну й клітинну імунну відповідь оцінювали, як було описано вище. Була виявлена тенденція, що полягає в тому, що HVR1-модифікований аденовірус, який містить шість повторів, призводив до більш високого титру антитіл, ніж аденовірус, який містить чотири повтори, а застосування ад'юванта збільшувало титр антитіл (Фіг. 44B). Напроти, ад'ювант не чинив ніякої дії на клітинний імунітет (дані не показані). [00175] Щоб визначити ефективність вакцини на основі HVR1-модифікованих аденовірусів із PyCS, по п'ять мишей у кожній групі інфікували, вводячи їм 2 × 104 контагіозних спорозоїтів P. yoelii шляхом ін'єкції у хвостову вену на тижні 9. Через 42 години після інфікування спорозоїтами концентрацію паразитів визначали, як описувалося вище. Для статистичного аналізу значення піддали логарифмічному перетворенню, і далі для визначення відмінностей був застосований односторонній ANOVA з наступним застосуванням критерію Дуннетта. Була виявлена така тенденція, що HVR1-модифікований аденовірус, який містить шість повторів, більш ефективно скорочував концентрацію паразитів, ніж аденовірус, який містить чотири 28