Агент екстракції периплазматичного рекомбінантного білка, спосіб одержання периплазматичного рекомбінантного білка (варіанти), спосіб культивування прокаріотичного мікроорганізму

1. Применение аргинина в ка честве а ген та экстракции периплазматического рекомбинантного белка. 2. Способ получения периплазматического рекомбинантного белка путем суспендирования осадка клеток, полученных при культивировании прокариотического микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий указанный белок, и элементы для его экпрессии в периплазме микроорганизма, в буферном растворе, содержащем агент экстракции бел уму указанные выше недостатки. Настоящее изобретение относится к экстракции рекомбинантных белков, продуцированных прокариотическими микроорганизмами, в частности Е coli. Все больше разрабатывается технологий с использованием методов генной инженерии для получения ценных белков, таких как, например, инсулин, интерлейкины, гормон роста и т.п. ка, с последующим осаждением полученной бактериальной суспензии и извлечением белка из надосадочной жидкости, отл ичающийся тем, что в качестве агента экстракции используют аргинин З.Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют воднощелочной раствор, при этом концентрация аргинина составляет, по меньшей мере, 0,4 М. 4.Способ получения периплазматического рекомбинантного белка путем суспендирования осадка дебриса клеток, полученных при культивировании прокариотического микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий указанный белок, и элементы для его экспрессии в периплазме микроорганизма, в буферном растворе, содержащем агент экстракции белка, с последующим осаждением полученной бактериальной суспензии и извлечением белка из надосадочной жидкости, отл ичающийся тем, что в качестве агента экстракции используют аргинин. 5.Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют воднощелочной раствор, при этом концентрация аргинина составляет, по меньшей мере, 0,4 М. 6. Способ культивирования прокариотического микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий целевой белок, отличающийся тем, что культи вирование проводят в присутствии аргинина при концентрации его, по меньшей мере, 2 г/л 7.Способ по п.6, отличающийся тем, что проводят культивирование в присутствии аргинина в концентрации от 2 до 10 г/л. Обычно микроорганизм трансформируют вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий интересующий белок, и элементы, необходимые для его экспрессии, такие как сигналы регулирования. Затем микроорганизм культивируют в подходящей культуральной среде при подходящих параметрах культивирования, и когда будет получено доста точное количество кле ток микроорга О О) см 27997 низма. добавляют индуктор запуска фазы указанной экспрессии, во время которой продуцируется целевой белок в большом количестве и накапливается. По окончании культивирования суспензию клеток отделяют от культуральной среды, например, центрифугированием или микрофильтрацией, потом проводят процесс экстракции, который часто начинают с операции разрушения стенок микроорганизмов. Экспрессия гена, кодирующего интересующий белок в прокариотическом микроорганизме, может быть цитоплазматической, пери плазматической или секреторной в зависимости от природы использованных элементов экспресии для указанного гена (промотор, терминатор, сайт связывания рибосом, сигнальный пептид и т.д.). Цитоплазматическая экспрессия позволяет получить значительные количества белков. Однако до экстракции интересующего белка необходимо провести стадию денатурации/ренату рации для белков, содержащих один или несколько дисуль фидных мостиков, что является особенно трудной и деликатной стадией при производстве в промышленных масштабах. С тадию денатурации/ренату рации проводят по классическим методикам, хорошо известным специалистам, используя денатурирующий агент в присутствии восстановителя, потом условия ренатурации включают, например, контроль окисления-восстановления раствора. Среди денатурирующих используемых агентов можно привести хлоргидрат гуанидина, который был предложен для способа получения интерлейкина-2 человека. Для этой цели можно сослаться, например, на европейскую заявку на патент ЕР-А2-0 145 390. Системы секреторной экспрессии, в которых интересующий белок находится в культуральной среде, активным образом мало или совсем не используются грам-отрицательными бактериями изза их низкой продуктивности. Здесь нужно отметить, что бактериальная культурапьная среда с большой плотностью в биореакторе не является идеальной для чувстви тельных рекомбинантных белков из-за, например, опасностей денатурации на поверхности раздела. Периплазматическая экспрессия позволяет получить непосредственно рекомбинантные белки, в принципе правильно уложенные в защищенном пространстве от окружающей среды, и это предоставляет разумный выбор для получения белков, а именно негликозилированных белков. В этом случае, следовательно, нет необходимости п о д в е р г а ть бе лк и с та ди и де н а т ур а ции/ренату рации. Способами разрушения клеток, обычно полезными в этой области, являются, например, лизис клеток под действием ультра звука или механического давления (French Pressure Cell, шаровая мельница), химический лизис или ферментный лизис, осмотический шок и обработка хаотропными агентами или де тер гентами . Э ти мето ды большей частью разрушают клеточные мембраны, при которых плазматические мембраны и мембраны эндоплазматического ретикулюма образуют гомогенную суспензию клеточного дебриса. Осадок клеточного дебриса может быть собран в общем после центрифугирования (ядра, цитосхелет, митохондрии, лизосомы, рибосомы, макромолекулы и т.п.), его природа зависит в частности от длительности и скорости центрифугирования (10 минут для 1000 д, до 3 часов для 150 000 д). Тр удности , встречающиеся во время операций экстракции, меняются а зависимости от типа экспрессии и использованных методов экстракции и заключаются, например в - потере выхода рекомбинантного белка, - потере биологической активности рекомби нантного белка, - протеолитическом разложении рекомбинант ного белка, - токсичности экстрагир ующи х агенто в и обя зательном контроле их удаления, - трудностях промышленного осуществления, - смешивании периплазматических белков с цитоплазматическнми белками. Кроме того, когда продуцированные целевые белки являются гидрофобными или заряженными, они могут ассоциировать с клеточными компонентами, которые сами являются гидрофобными или заряженными, что приводит к особенно трудной экстракции. Промышленное производство целевых рекомбинантных белков с помощью генетической инженерии представляет значительный интерес, но необходимо использовать такие методы экстракции, которые устраняют или сводят к миним Наконец, важно не только получить значительные количества целе вого бе лка, но также нужно, чтобы эти белки не были загрязнены экстрагирующими агентами и сохранили всю свою биологическую активность Для этой цели уже были предложены различные способы , в ча стности для экстракциивыделения интерлейкина-2. В европейской заявке на патент ЕР-А2-0 145 390 описан способ получения негликозилированного, человеческого интерлейкина-2 (ИЛ-2), имеюще го удельн ую ак ти вность вы ше 104 Е/мг, в котором для экстракции ИЛ-2 проводят стадию выделения хроматографией на колонке. Этот способ также требует введения стадии денатурации с помощью хлоргидрата гуанидина. В европейской заявке на патент ЕР-А2-0 147 819 предложен способ получения гомогенного и чистого рекомбинантного интерлейкина-2. Этот способ заключается в культивировании микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий интерлейкин-2, проведении лизиса клеток, извлечении клеточного дебриса, экстракции ИЛ-2 путем промывки клеточного дебриса соответствующим промывочным раствором с последующей хроматографической очисткой раствора, полученного при промывке. Используемые промывочные растворы могут содержать соль, так ую как хлорид на трия или хлоргидрат гуанидина, или детергент, такой как, например, продукт, известный под торговым названием "Тритон X -100". В соответствии с предпочтительным вариантом предусматривается последовательное использование тре х промывочны х ра створов, а именно промывочного раствора, содержащего хлорид натрия, промывочного раствора, содержащего де терген т, и промывочного раствора, со 27997 держащего хлоргидрат гуанидина. В европейской заявке на патент ЕР-А1-0 337 243 описан способ очистки человеческого интерлейкина-2, в котором использована система двух колонок для жидкостной хроматографии с обратимой фазой. Перед стадией хроматографической очистки нерастворимую фракцию бактериального клеточного лизата экстрагируют раствором, содержащим хлоргидрат гуанидина, чтобы получить бактериальный экстракт, который затем разбавляют буфером, не содержащим хлоргидрат гуанидина, потом хроматографируют, элюирование проводят с градиентом ацетонитрила. Теперь неожиданно обнаружено, что экстракция целевого белка, продуцируемого прокариотическим микроорганизмом, трансфор мированным вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий целевой белок, и элементы для экспрессии, такие как сигналы регулирования, необходимые для его периплазматичесшй экспрессии, может быть осуществлена при суспендировании осадка клеток или клеточного дебриса микроорганизмов, полученных при культивировании указанного микроорганизма, в буферном растворе, указанный раствор целесообразно содержит аргинин, аргинин может быть в L или Д форме. В соответствии с первым аспектом, объектом изобретения является применение аргинина в качестве агента экстракции периплазматических белков. В соответствии со вторым аспектом, объектом настоящего изобретения является способ экстракции целевого периплазматического белка, заключающийся в том, что: 1) суспендир уют клеточный осадок, получен ный при культивировании микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, со держащим ген , кодир ующий указанный белок, и все сигналы регулирования, необходимые для его пери плазматической экспрессии, в буферном рас творе, содержащем аргинин, и после определен ного времени контакта в адекватных условиях рН, температуры, концентрации бактерий и т.п., 2) извлекают целевой белок из супернатанта полученной таким образом бактериальной суспен зии. Вариант указанного способа экстракции целевого периплазматического белка заключается в суспендировании осадка клеточного дебриса, полученного после лизиса клеток, полученных при культивировании, в буферном растворе, содержащем аргинин. Экстракция периплазматичесшх белков является особенно эффективной, когда экстрагирующий буфер состоит из водного растаора, содержащего аргинин в концентрации по крайней мере равной 0,4 М аргинина в пределах растворимости аргинина при комнатной температуре в воде (близкой к 0,8 М в чистой воде и выше в присутствии солей), и что его рН является слегка щелочным, предпочтительно равным 8. Ар гин ин являе тся приро дной а-аминокислотой, которая была предложена в качестве вспомогательного агента денатурации/ренатурации/замещения двух цепей Аббокиназы* (мочевой активатор плазминогена), в котором нативный пептид частично замещается синтети ческим пеп тидом во время этой операции. Для этой цели можно сослаться на статью G.A.Hornandberg et T. Wai в Biocimica et Biophysica Acta, 1950,1038, 209215. В способе изобретения или в его варианте не происходит денатурации/ренатурации белка, и аргинин участвует только на уровне экстракции белка из осадка клеток или клеточного дебриса микроорганизмов. Аргинин обеспечивает замечательные эффекты при экстракции белка как на уровне выхода, так и в отношении биологической активности белка. Действительно, было обнаружено, что, например, извлекают зрелую форму ИЛ-13 в способе изобретения с выходом более 95% при полном сохранении его биологической активности Следует отметить, что опыты по экстракции с помощью осмотического шока на той же самой системе экспрессии не приводят к сравнимым выходам Сравнительные опыты показали, что гуаниДИН.НС1, используемый в тех же самых условиях, также позволяет извлекать белок ИЛ-13 с выходом более 95%, тогда как биологическая активность извлеченного таким образом белка ухудшается больше, чем в способе с аргинином Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что аргинин действует как мягкий биологический хаотропный агент в противоположность мощным хаотропным агентам, денатурир ующим при высоких концентрациях, равных или превышающи х 5 М, необходимым, чтобы обеспечить экстракцию, таким как хпоргидрат аргинина. Способ изобретения или его вариант могут быть осуществлены после любого процесса культивирования микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий целевой белок, и элементы для периплазматической экспрессии указанного белка, таких как любые необходимые сигналы регуляции. Для специалиста в этой области очевидно, что способ применим к бактериям, близким к Е.соП, т.е . к ба к те р ия м , на з ы ва ем ым гр ам отрицательными, анаэробным, необязательно составляющим группу энтеробактерий. В это семейство энтеробактерий входят,в частности , виды: Escherichia, Salmonella, Erwinia mais, а также Shigella, Klebsieffa, Serratia, Proteus и Enterobacter. Учитывая хаотропный характер аргинина, также оказалось, что аргинин может во многих случаях успешно заменять другие хао тропные агенты. Не имея возможности подтвердить примерами все семейства бактерий из-за разнообразия рассматриваемых живых систем, специалист может применить и приспособить способ экстракции с аргинином к своему конкретному случаю. Такие способы культивирования хорошо известны специалистам. Способы, описывающие культивирование грам-отрицательных бактерий в ферментере, описаны, например, в европейских патентах ЕР-360641 и ЕР-356335, относящихся к получению и использованию штаммов Е.соІІ, называемых SEBR 1250 и ТР 2339. Когда при культивировании получают достаточное количество клеток, культуральную среду подвергают центрифугированию (обычно) или микрофильтрации и полученный осадок биомассы контактир уют с буферным раствором, со держа 27997 щим аргинин, согласно способу изобретения. Как правило, работают при температуре, лежащей между комнатной температурой примерно 25°С и 2°С, предпочтительно 4°С. Время контакта клеточного осадка с буферным раствором, содержащим аргинин , до лжно быть достаточным, чтобы обеспечить переход целевого белка в буферный раствор. Обычно при работе при 4°С время контакта преимущественно составляет примерно 1 час. Экстракция, т.е. переход периплазматического белка в среду, происходит при контактировании биомассы и экстрагирующего буфера с аргинином. Время контакта, обеспечивающее полную экстракцию или не увеличивающуюся, лежит между 30 минутами и 16 часами Опыты показали, что могут быть получены удовлетворительные выходы экстракции в течение нескольких часо в при 4°С. Также было отмечено, что слабое перемешивание биомассы в экстрагирующем буфере для предотвращения седиментации осадка микроорганизмов дает лучшие результаты , т.е. более высокую степень экстракции в зависимости от времени. Способ экстракции, согласно изобретению, удобен для экстракции таким образом как гидрофобных белков, таких как, например, интерлейкины, в частности, ИЛ-13, описанного в европейской заявке на патент ЕР-А1-0 506 574 , так и гидрофильных белков, таких как, например, гормон роста (hGH). Способ изобретения упрощает получение hGH, который обычно требует для своей экстракции применения осмотического шока. Для осуществления экстракции целевого белка непосредственно из суспензии кле точно го осадка предпочтительным будет буферный раствор, содержащий аргинин в концентрации между 0,4 М и 0,8 М. Когда хотят осуществить экстракцию целевого периплазматического белка из осадка клеточного дебриса, согласно варианту способа изобретения, работают таким же образом, как в способе согласно изобретению, до стадии получения осадка клеток, полученного после центрифугирования или микрофильтрации, потом проводят разрушение клеток по хорошо известным специалистам методикам. Методы разрушения клеток описаны, нап р им е р , C .T.C h o m a a nd H .Ya m a za ki , Can.J.MicrobioI.,. 1981, 27, 547-550; L.O.Ingram, Journal of Bacteriology, 1981, 146, 1, 331-336; N.G.Nossal and L.A.Heppel, Joumai of Biological Chemistry, 1966, 241, 13, 3065-3072; «.Bennett, D.K.Taylor and A.Hurst, Biochem. Biophys. Acta. 18 (3), 512-521, (1966) и коллективном труде «Ферментация и ферментная технология», Глава 12, 239-309, J.Willey and Sons Editeurs (1979). Осадок клеточного дебриса, собранный обычно после центрифугирования, суспендируют, потом контактируют с буферным раствором, содержащим аргинин. Время контакта клеточного дебриса с буферным раствором, содержащим аргинин, должно быть достаточным, чтобы обеспечить переход целевого белка в буферный раствор. Обычно при температуре 4°С время контакта, обеспечивающее практически полную экстракцию, составляет 48 часов. Также было отмечено, что слабое перемешивание биомассы в экстрагир ую щем буферном растворе, устраняющее таким образом седиментацию клеточного дебриса, приводит к более высокой степени экстракции в зависимости от времени. Этот вариант способа экстракции, согласно изобретению удобен для экстракции, в частности, целевых периплазматических белков, которые сильно ассоциированы с клеточными мембранами, таких как, например, интерлейкины. Специалистам в данной области хорошо известно, что экстрагирующий буфер, содержащий аргинин, согласно изобретению, также может содержать дополнительный детергент, который будет улучша ть выход и/или скорость экстракции целевого белка. Среди дополнительных детергентов, которые могут бы ть использованы, специалист буде т выбирать те, которые позволят сохранить преимущества использования аргинина как экстрагирующего агента, в частности, со хранение биологической активности целевого белка. Среди эти х мягких дополнительных детергентов можно привести, например, алкилгликозиды, например, алкилмальтозиды, а - или р-нонил-Д-глюкопиранозиды, а - или р-ок тил-Д-глюкопиранозиды или а - или р-алкилкарбамоилметил-Д-глюкопиранозиды, например, HecamegR, очень низкая токсичность которых позволяет считать возможным нахождение его в следовы х количества х как составного агента в конечном продукте. Для осуществления экстракции целевого белка из суспензии осадка клеточного дебриса предпочтительно использовать буферный раствор, содержащий аргинин в концентрации между 0,4 М и 2,5 М; концентрация 2,5 М аргинина может быть получена, в частности, в присутствии солей. Кроме того обнаружено, что аргинин оказывает значительное благоприятное действие на выходы рекомбинэнтного периплазматического секретированного белка, если его добавляют не в обычных и очень высоких концентрациях к белкам, которые встречаются в культуральных средах, полученных из гидролизатов коммерческих белков, и которые позволяют удовле творить потребность в аргинине применяемого штамма. С другой стороны, было обнаружено, что благоприятное действие, оказываемое аргинином, является особенно значительным, если концентрации аргинина, добавленного в культуральную среду, лежат между 2 г/л и 10 г/л. Итак, согласно другому аспекту изобретения, его объектом является способ культивирования прокариотических микроорганизмов, трансформированных с помощью вектора экспрессии, содержащего ген, кодирующий целевой белок, который заключается в культивировании указанного микроорганизма в присутствии аргинина в концентрации, по крайней мере равной 2 г/л и, в частности, при концентрации между 2 г/л и 10 г/л. Специалист в этой области может оптимизировать эту концентрацию аргинина в зависимости от случая. Этот способ особенно пригоден для получения белков с активностью типа цитокина, в частности, ИЛ-13, такой как описана в европейской заявке на патент ЕР-А1-0 506 574. Теперь изобретение будет описано более детально с помощью примеров, которые приведены 27997 только для иллюстрации. Пример 1 Экстракция периплазматического ИЛ-13 из Е.соІІ в присутствии аргинина из осадка клеток 1) Культивирование в колбе В этом примере используют штамм Ecoli RB 791 (Roger Brent, PNAS 78 (1981) стр. 42044208), тран сформиро ванный плазми дой р922, полученной по способам, аналогичным способам, описанным в патента х ЕР 360 641 и 356 335, последовательность ДНК которой представляет собой последовательность SEO 1D № 1, Различные последовательности, которые составляют эту плазмиду р922 указаны ниже. Последовательность промотора Характеристические гексануклеотиды TTGCTT и ТАТААТ промоторов у E.coJi, обозначены жирным шрифтом: Терминатор гена 10 фага т 7 SIJ CCCCiattKA ДГДАСТАКД ТААССССГГО GQGCCTCTAA АССаСТСГГС HindHI В63 АССССТТПТ TG CTO AAAG АО G СМСТЛТА TCOGG ATtTTA CCAAG CTTG G 913 CCG GATCAAA СПТГСТССТ СПТССАСДС GITAG TAAAT G AAnTTCTC 963 TATG AGO r TTKTAAACAA CTTTCAACAG TITCAGCGG O IT ft TCACAATAC Терминатор фага fd 1013 AAACGAACAA CTAAACG AAT T GCG AATAAT ААГПТГТСА CCTTG AAAAT IO63 CTCCAAAAAA AAACG CTCCA AAACO ACCCT ТГААТГСГГАТ CGCTTTATCA 1113 GCTT GCT rTC CACG GAATT T CTT AAACAG CTT GATACCG AT ACTT GCCC 1163 T CGACAAT G AC AACAACCAT C GCCCACCCAT AACCG ATAT A TT CDG CGCT 12Я T nAtXICT T GCA GGGAQT CAAA СССС ОЛПТ GCGGCAT CGA T Ген, кодирующий репрессор оперона лактозы S acII Xhol T CGAGT GGGT TT GAGCCGAT САСАСТ Т СТ С T TAACCCAGA ACCTAAACGC 1 125* CCCCt»AAG ATAAAG C TCTA AAGCCT GGCC T G CCTAftT G CTCAG AAC A CT 13O TCACATTAAT TGCCTTGCCS; TCACT CCCCQ CTTTCCAG CCG U TC AAACCT G І35Ц 51 AT CT CGACT G CACGGT GCAC СААТ ССТ Т СТ GGCCT CAGGC AGCCAT CCGA TCCT GCCAGC T GCATTAAT G AAT CG XCAA CCCGCGGGG □AGGCGG A TTT l'HOi 101 ACCT GT CGT A T GGCT OT GCA GGT CGT AAAT CACT CCAT AA T T CCT GT CGC CCCTATT GGG CCCCAGGG G G rTTTCTTT T CACCAG G CACGGG T T T A C^AC 1