Гуманізоване моноклональне антитіло, специфічне до комплексу abtcr/сd3 людини

Реферат: Винахід стосується гуманізованого моноклонального антитіла, яке специфічне до комплексу αβTCR/CD3 людини, нуклеїнової кислоти, що його кодує, клітини, яка експресує нуклеїнову кислоту. Винахід також стосується зазначеного гуманізованого антитіла для застосування при супресії опосередкованої Т-клітинами відповіді у пацієнта, де Т-клітинна імунна відповідь пов’язана з трансплантацією тканини, розсіяним склерозом та діабетом 1 типу. UA 115533 C2 (12) UA 115533 C2 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід відносять до антитіла, специфічного до альфа- та бета-рецептора Т-клітин (αβTCR). Зокрема, винахід відноситься до гуманізованого антитіла αβTCR, яке походить від моноклонального антитіла BMA031 миші, та застосуванню зазначеного гуманізованого антитіла в імуносупресивній терапії. Вступ Застосування імуносупресивних засобів при аутоімунних захворюваннях та терапії при трансплантології є добре задокументованим, однак, цей спосіб є далеким від оптимального. У пацієнтів, яких лікували цими засобами, поширені токсичність, опортуністичні інфекції, цитокінова буря та підвищений ризик раку. Застосування біологічних препаратів в цій галузі в деякій мірі поліпшило результат у пацієнта, однак, ці побічні ефекти поки що залишаються вираженими. Загальновідомо застосування поліклональної антисироватки проти лімфоцитів з метою імуносупресії. Однак, виготовлення антисироватки є трудомістким, в неї спостерігають властивості, які відрізняються в серіях, а специфічність, яку можна отримати при застосуванні поліклональної антисироватки, обмежена. Одержання моноклонального антитіла за допомогою технології гібридоми вперше було описане Köhler и Milstein (Nature 256:495-497 (1975)). Порівняно з поліклональною антисироваткою моноклональні антитіла (mAb) більш специфічні та мають більш стабільні властивості. mAb найчастіше та найуспішніше застосовують для імуносупресивної терапії в клінічній трансплантології. Однак, більшість mAb, застосовуваних в якості імуносупресивних засобів для лікування аутоімунних захворювань та у пацієнтів після трансплантації, мають значний імуносупресивний потенціал, приводячи, в зв'язку з цим, до небажаної дії на функції широкого спектру імунних клітин, не всі з яких, імовірно, пов'язані з відторгненням трансплантата. Моноклональні антитіла миші проти антигенів поверхневого рецептора Т-клітини вперше отримали у 1979 р. за допомогою технології гібридоми (Kung et al. (1979) Science 206:347-349). З трьох моноклональних антитіл, відкритих Kung et al., одне антитіло, позначене як муромонабCD3 (OKT3) проявило специфічність до CD3 рецептора Т-клітини, реагуючи більш ніж з 95 % периферичних зрілих Т-клітин без дії на незрілі тимоцити. Зв'язування OKT3 з комплексом CD3 викликає інтерналізацію рецептора CD3 та втрату CD3 позитивних клітин на периферії. Успішне лікування за допомогою OKT3 пов'язано зі швидким зниженням CD3 позитивних Т-клітин від приблизно 60 % до менш ніж 5 %. OKT3 широко застосовували з метою лікування пацієнтів з гострим відторгненням алотрансплантата після трансплантації нирки (Russell, P.S., Colvin, R.B., Cosimi, A.B. (1984) Annu. Rev. Med. 35:63 та Cosimi, A.B., Burton, R.C., Colvin, R.B. et al. (1981) Transplantation 32:535). Крім цього, OKT3 та комплемент кроля застосовували для очищення зрілих Т-клітин з кісткового мозку донора для попередження гострої реакції трансплантат проти хазяїна (GVHD) при алогенній трансплантації кісткового мозку (Prentice, H.G., Blacklock, H.A., Janossy, G. et al. (1982) Lancet 1:700 та Blacklock, H.A., Prentice, H.G., Gilmore, M.J. et al. (1983) Exp. Hematol. 11:37). Незважаючи на те, що лікування OKT3, імовірно, є ефективним для попередження GVHD при алогенній трансплантації кісткового мозку при гострому лейкозі, сумісне in vitro/in vivo лікування OKT3 не попереджувало GVHD при терапії тяжкого комбінованого імунодефіциту (Hayward, A.R. et al. (1982) Clin. Lab. Observ. 100:665). Обробка Т-клітин з OKT3 викликає ряд реакцій, несумісних з імунною супресією, включаючи активацію Т-клітин, продукцію імунних медіаторів та T3-модуляцію. Вважають, що комплекс T3-антигена, що розпізнається CD3-mAb (наприклад, OKT3), грає ключову роль під час активації Т-клітин. Альфа/бета T-лімфоцити розпізнають ліганди MHC з пептидами завдяки мультимерному білковому ансамблю, званого комплексом CD3 αβ-антигенного рецептора Т-клітини (TCR). Ця структура складається з варіабельного димеру αβ TCR, який зв'язується з антигенами та трьома інваріантними димерами (CD3γε, δε и ζζ), які залучені до транспорту поверхневого TCR·CD3, його стабілізації та трансдукції сигналу. Альфа-бета рецептор Т-клітини (αβTCR) експресується на більшості (приблизно 95 %) T-клітин та відіграє ключову роль в активації Т-клітини шляхом включення антигену, презентованого на MHC. 5 % клітин, що залишилися, є гамма-дельта рецепторпозитивними Т-клітинами (γδTCR). Популяція γδTCR позитивних клітин відіграє важливу роль у вродженій імунній відповіді при захисті від опортуністичних інфекцій бактеріального, вірусного та грибкового походження. Гамма-дельта Т-клітини не відіграють ролі у відторгненні трансплантата при трансплантації. Таким чином, цілеспрямований вплив на популяцію αβTCR позитивних клітин без впливу на популяцію γδTCR позитивних клітин повинен передбачати суттєву терапевтичну ефективність, зберігаючи, в той же час, базовий імунний захист проти опортуністичних інфекцій. 1 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Моноклональне антитіло BMA031 до IgG2b миші (Borst et al. (Nov. 1990) Hum. Immunol. 29(3):175-88; EP0403156) є специфічним до загальної детермінанти на комплексі TCR альфа/бета/CD3 та не зв'язується з гамма-дельта TCR. BMA031 є дуже імуносупресивним та здатним до індукування апоптозу активованих Т-клітин шляхом механізму індукованої активації клітинної загибелі (AICD) (Wesselborg et al. (May 1993) J. Immunol. 150(10): 4338-4345). In vitro воно пригнічує змішану лімфоцитарну реакцію та попередньо проявило клінічну ефективність в попередженні відторгнення трансплантата при деяких варіантах трансплантації цілих органів, а також при лікуванні гострої реакції трансплантат проти хазяїна (aGVHD) (Kurrle et al. (Feb 1989) Transplant Proc. 21(1): 1017-1019). BMA031 не взаємодіє з гамма-рецепторами людини Fc (FcγR) в більшій частині популяції людини (приблизно 10 % людей мають FcγR, які зв'язуються з ізотипом IgG2b миші). Відповідно, це антитіло не викликає активацію Т-клітин шляхом перехресного зв'язування з рецептором T-клітини, та, таким чином, воно не викликає активацію Т-клітин або пов'язане вивільнення цитокінів. В зв'язку за цим, його профіль є вкрай переважним відносно OKT3. Однак, BMA031 є антитілом миші та, отже, не є придатним для повторного введення людям внаслідок активованої в них відношенні реакції антитіл людини до антитіл миші (HAMA). Були описані декілька гуманізованих варіантів BMA031 (див. EP 0403156; також Shearman et al., (1991) J. Immunol. 147:4366-4373). Як вказано в EP0403156, звичайне пересаджування CDR було неуспішним щодо збереження зв'язування антигена. Один клон зі значними змінами каркаса, EUCIV3, успішно зв'язувався з T-клітинами; однак, як вказано в EP0403156, зв'язування з αβTCR було не таким ефективним, як у батьківського антитіла BMA031, як встановлено за допомогою аналізів конкурентної проточної цитометрії. Також було показано, що здатність EuCIV3 пригнічувати імунну відповідь in vitro значно знижена порівняно з BMA031 (див., фіг.2). На додаток до цього, EuCIV3 спочатку отримали на каркасі дикого типу IgG1 або IgG4 людини, який зберігає зв'язування з FcγR. Таким чином, ці гуманізовані антитіла робили можливою активацію, проліферацію Т-клітин та супровідне вивільнення цитокінів та, відповідно, суттєво відрізнялись за вихідними властивостями від BMA031. В даній галузі техніки відома модифікація антитіла глікозилюванням. Наприклад, відомо, що неглікозовані антитіла можуть характеризуватися значно модифікованою функціональністю; див. Boyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318. Проте, неглікозильовані форми гуманізованого BMA031 або похідні з модифікованими профілями глікозилювання раніше не були описані. Таким чином, в даній галузі існує необхідність в гуманізованому антитілі до αβTCR, яке при зв'язуванні поліпшує властивості EUCIV3 та переважно зберігає імуносупресивні та не характерні для Т-клітини активуючі властивості BMA031. Короткий опис даного винаходу В першому аспекті пропонується гуманізоване моноклональне антитіло, яке містить CDR до BMA031 та зберігає афінність зв'язування BMA031 зі своїм когнатним антигеном. В першому варіанті здійснення вказане гуманізоване антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить CDR, викладені в SEQ ID NO:7, 12 або 13, та каркас IGH3-23 людини, викладений в SEQ ID NO:17, причому положення 6 каркаса є донорським залишком; в альтернативному варіанті здійснення в положенні 18 каркаса знаходиться донорський залишок. Необов'язково, в положенні 49 та/або 69 каркаса знаходяться донорські залишки. В другому варіанті здійснення гуманізоване моноклональне антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR, викладеними в SEQ ID NO:15 або 16, та каркас IGHV1-3*01 людини, викладений в SEQ ID NO:18, причому одне або декілька положень 38, 44 та/або 48 є донорським залишком; в альтернативному варіанті здійснення положення 44 та 48 каркаса є донорськими залишками. В третьому варіанті здійснення гуманізоване моноклональне антитіло містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR, викладені в SEQ ID NO:14, та каркас IGKV3-11*01 людини, викладений в SEQ ID NO:19, причому положення 70 та/або 71 каркаса є донорськими залишками. Необов'язково, положення 46 є донорським залишком. Приклади антитіл, відповідно до першого варіанта здійснення, включають антитіла, які містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з важких ланцюгів, які містять послідовності, викладені в SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:12 та SEQ ID NO:13, та послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, яка містить послідовність, викладену в SEQ ID NO:14. Приклади антитіл, відповідно до другого варіанта здійснення, включають антитіла, які містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з важких ланцюгів, які містять послідовності, викладені в SEQ ID NO:15 та SEQ ID NO:16, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить послідовність, викладену в SEQ ID NO:14. Гуманізовані антитіла, 2 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідно до описаних варіантів здійснення, є гуманізованими варіантами BMA031. Їх первинні структури відрізняються від структури гуманізованого антитіла EuCIV3, яке характеризується зниженим зв'язуванням з αβTCR порівняно з BMA031. У переліку послідовностей CDR вказані за допомогою анотації або підкреслювання. Каркаси являють собою всі послідовності за межами CDR, які визначені відповідно до системи нумерації "Kabat" та розширені, де необхідно, із застосуванням "IMGT" CDR. Якщо не вказано, що залишок каркаса необхідно змінити для відповідності донорській послідовності, зазвичай його сприйматимуть як акцепторний залишок. Гуманізовані антитіла можуть містити константу ділянку. В одному варіанті здійснення константа ділянка має людське походження. Гуманізовані антитіла за даним винаходом можуть бути додатково модифіковані шляхом Fc інженерії. Імуноглобуліни схильні до поперечного зшивання з рецепторами Fcγ, що може призводити до конститутивної активації Т-клітин щодо антитіл до Т-клітин. Для запобігання поперечного зшивання з Fcγ антитіла можуть бути модифіковані з видаленням Fc-ділянки, наприклад, шляхом утворення фрагментів Fab або Fv; однак, процесовані імуноглобуліни не характеризуються корисними ефекторними функціями та демонструють знижений період напіввиведення. Таким чином, Fc-ділянка гуманізованого антитіла може бути модифікована для запобігання поперечного зшивання з Fcγ. Ілюстративні методики включають утворення неглікозильованих імуноглобулінів, наприклад, шляхом модифікації Fc-ділянки мутацією N297Q. Імуноглобуліни, які нездатні зв'язуватись з Fcγ , також описані у Armour et al., (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613-2624. Модифікація, здійснена з IgG1, відома як модифікація Δab, та складається з комбінації мутації Δa, в якій залишки IgG замінені в положеннях 327, 330 та 331, а залишки IgG2 замінені в положеннях 233-236, та мутації Δb, в якій залишок 236 видалено. В іншому варіанті здійснення можна модифікувати профіль глікозилювання антитіл за даним винаходом. В одному варіанті здійснення це антитіло містило одну або декілька мутацій S298N, T299A та Y300S. В варіантах здійснення антитіло містить дві або більше мутацій N297Q, S298N, T299A та Y300S. Наприклад, пропонують гуманізоване антитіло, яке містить декілька мутацій N297Q/S298N/Y300S, S298N/T299A/Y300S або S298N/Y300S. В другому аспекті пропонують гуманізоване моноклональне антитіло, яке містить CDR з BMA031 та зберігає властивості BMA031 до супресії Т-клітин. Вказане гуманізоване антитіло переважно містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, викладену в SEQ ID NO: 12, 13, 15 або 16, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, викладену в SEQ ID NO:14. В третьому аспекті пропонують нуклеїнову кислоту, яка кодує, щонайменше, варіабельну ділянку важкого ланцюга гуманізованого моноклонального антитіла відповідно до попередніх аспектів описаних варіантів здійснення. Нуклеїнова кислота може кодувати варіабельну та константну ділянки гуманізованого антитіла. Важкий та легкий ланцюги можна кодувати на окремих нуклеїнових кислотах або на одній молекулі нуклеїнової кислоти. Відповідно до четвертого аспекту пропонують клітину, яка експресує нуклеїнову кислоту відповідно до попереднього аспекту. Ця клітина, наприклад, є клітиною, адаптованою для експресії молекул антитіла в культурі. Нуклеїнова кислота може включати сигнальні послідовності та/або інші послідовності або модифікації, які потрібні для або які модулюють експресію цієї молекули антитіла в клітині, та/або секрецію цього антитіла з клітини. У додатковому варіанті здійснення гуманізоване антитіло пропонують, як описано у вищенаведених аспектах, для застосування в супресії реакції, опосередкованої Т-клітинами, у пацієнта. Наприклад, реакція, опосередкована Т-клітинами, може бути залучена в стан, обраний з тканинної трансплантації, включаючи трансплантат цілих органів та трансплантат ділянки тканин тіла на судинній ніжці, трансплантацію тканини, розсіяний склероз та діабет 1 типу. Окрім цього, інший варіант здійснення передбачає спосіб лікування пацієнта, який страждає хворобою, до якої залучена аномальна реакція, опосередкована Т-клітинами, що включає уведення пацієнту, який потребує цього, фармацевтично ефективної дози антитіла відповідно до описаних варіантів здійснення. Таким чином, були створені гуманізовані неактивовані антитіла до αβTCR, які не індукують виділення цитокіну, мають здатність до селективної модуляції αβTCR та індукції апоптозу активованих αβTCR-позитивних Т-клітин. Ці антитіла були створені для застосування в якості імуносупресивних засобів при хворобах, опосередкованих Т-клітинами. Ці антитіла були створені гуманізацією антитіла миші BMA031 до αβTCR та Fc-інженерією гуманізованих антитіл 3 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 для запобігання залучення Fc гамма-рецепторів. Ці антитіла відповідно до описаних варіантів здійснення зберігають афінність зв'язування BMA031, на відміну від гуманізованих варіантів BMA031, доступних в цій області. Також, як вказано в in vitro методах навчання, імуносупресивні властивості антитіл відповідно до описаних варіантів здійснення перевершують такі з BMA031. Крім цього, на відміну від вже відомих гуманізованих антитіл BMA031 даної галузі техніки, антитіла відповідно до описаних варіантів здійснення не індукують виділення цитокіну в нормальних PBMC. Відповідно до п'ятого аспекту пропонують антитіло, яке містить модифікований Fc, в якому вказаний модифікований Fc містить модифікований профіль глікозиляції, який зменшує зв'язування з FcγR-рецептором, що містить одну або більше мутацій S298N, T299A та Y300S. В одному варіанта здійснення це антитіло містить дві або більше мутацій N297Q, S298N, T299A та Y300S. В варіантах здійснення це антитіло містить множинні мутації N297Q/S298N/Y300S, S298N/T299A/Y300S або S298N/Y300S. Наприклад, це антитіло може бути антитілом, як описано в попередніх аспектах винаходу. Відповідно до шостого аспекту пропонують поліспецифічне антитіло, яке містить, щонайменше, важкий ланцюг з першим доменом зв'язування, як описано в попередніх аспектах винаходу, та другий домен зв'язування, як описано для пухлино-специфічного антигену. В одному варіанті здійснення перший домен зв'язування містить важкий ланцюг відповідно до другого аспекту винаходу. Це поліспецифічне антитіло може містити багато різних конформацій; в одному варіанті здійснення воно включає scFv до TCR/CD3 та scFv до пухлини. В одному варіанті здійснення, поліспецифічне антитіло є біспецифічним. Короткий опис фігур Фіг. 1. BMA031 зв'язується міцніше з αβTCR порівняно з EuCIV3. Конкуренція зв'язування РЕ-міченого антитіла BMA031 з антитілами BMA031 MoIgG2b, BMA031 HuIgG1 та EuCIV3 HuIgG1. EuCIV3 має знижену активність порівняно з BMA031. Фіг. 2. EuCIV3 є менш сильним, ніж BMA031 в аналізі з in vitro навчанням (IVE). Графік вказує на втрату дії гуманізованого антитіла EuCIV3 в біологічному аналізі при порівнянні з батьківським антитілом BMA031. CD8+ Т-клітини обробляли антитілами до αβTCR при різних концентраціях (ось х) та сумісно культивували з аутологічними дендритними клітинами, які активували CMV-пептидом 495-503 (pp65) протягом семи днів. Фіг. 3. HEBE1 зв'язується з αβTCR порівняно з BMA031 в конкурентному аналізі. Конкуренція зв'язування РЕ-міченого антитіла BMA031 з антитілами BMA031 HuIgG1, HEBE1 HuIgG1 та EuCIV3 HuIgG1. EuCIV3 має знижену активність порівняно з BMA031 та HEBE1. Фіг. 4. HEBE1 має подібну до EuCIV3 активність в аналізі з in vitro навчанням (IVE). Аналіз з IVE було виконано, як описано відповідно до фіг.2. Фіг. 5. Схематичні зображення повторюваних циклів мутагенезу варіабельних доменів до αβTCR. Каркас в заштрихованому прямокутнику означає FR-область, де знаходяться певні залишки антитіла миші. Заштриховані залишки в першому рядку мутацій є амінокислотами антитіла миші, які придатні для підтримки швидкості дисоціації. Заштриховані залишки в другому рядку мутацій є залишками антитіла миші, які оточують області CDR, збережені під час кінцевого зародкового процесу. Фіг. 6. Оптимізоване гуманізоване антитіло поліпшило швидкість дисоціації порівняно з BMA031. Кінетику дисоціації антитіла з αβTCR на Т-клітинах було виміряно проточною цитометрією. У BMA031 була краща швидкість дисоціації порівняно з EuCIV3 та HEBE1. Оптимізуючи домен зв'язування HEBE1 автори змогли поліпшити швидкість дисоціації HEBE1.Н10 порівняно з BMA031. Фіг. 7. Оптимізоване гуманізоване антитіло поліпшило швидкість дисоціації порівняно з BMA031. Кінетику дисоціації антитіла з αβTCR на Т-клітинах було виміряно проточною цитометрією. Оптимізуючи домен зв'язування HEBE1 автори змогли поліпшити швидкість дисоціації HEBE1.Н66 порівняно з BMA031. Фіг. 8. Оптимізоване гуманізоване антитіло поліпшило швидкість дисоціації порівняно з BMA031 в обох Δab та неглікозильованому форматах. Кінетику дисоціації антитіла з αβTCR на Т-клітинах було виміряно проточною цитометрією. Фіг. 9. Оптимізація HEBE1 приводить до еквівалентної дієвості, як і у BMA031. 4 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Аналіз з IVE, який описаний у фіг. 4. BMA031 пригнічував навчання CD8+T-клітин, оскільки вони були неспроможні лізувати специфічні мішені дозо-залежним чином. Батьківське гуманізоване антитіло, HEBE1, було не таким сильним, як BMA031, та було спроможнім пригнічувати навчання лише при найвищий дозі (подібні результати спостерігали з другим не поліпшеним гуманізованим Ab, HEBE1 H13). Подальші поліпшення робили з цим гуманізованим антитілом, HEBE1 H10, яке має еквівалентну до BMA031 силу за цим аналізом. Фіг. 10. Дані IVE антитіл до αβTCR. Як HEBE1, так і GL1 BM серії антитіл показали поліпшення за результатами IVE порівняно з BMA031. Фіг. 11. Антиген-позитивні клітини з аналізу з IVE, як встановлено антиген-специфічним тетрамерним зв'язуванням. Клітини, які є антиген-позитивними (наприклад, навчені в межах аналізу з IVE), спроможні зв'язуватися з MHC-тетрамерною молекулою. При проведенні аналізу з IVE в присутності антитіла, здатного попередити навчання Т-клітин антигену, менше клітин були спроможними зв'язуватися з МНС-тетрамером наприкінці аналізу. Фіг. 12. Проліферація PBMC в присутності антитіл до αβTCR, OKT3 та стимулюючих гранул. Стимулююча активність OKT3 не була помічена в антитілах до αβTCR в цьому порівнянні. Фіг. 13. Вивільнення цитокінів з PBMC в присутності антитіл до αβTCR. Профіль вивільнення цитокінів антитіл до αβTCR був подібним до профілю, продемонстрованому BMA031. Фіг. 14. Вивільнення гамма-IFN з Т-клітин в аналізі з IVE CD8+T-клітини обробляли антитілами до αβTCR при різних концентраціях (див. фіг. 2, ось x) та культивували сумісно з аутологічними дендритними клітинами, які активували CMV-пептидом 495-503 (pp65) протягом семи днів в аналізі з in vitro навчанням (IVE). В цьому аналізі виміряли вивільнення гамма-IFN. Фіг. 15. Індукований активацією апоптоз антитілами до αβTCR. Антиген-стимульовані CD8+T-клітини індукували до апоптозу зв'язуванням антитіл до αβTCR BMA031 та HEBE1 H66. Здатність HEBE1 H66 індукувати апоптоз була вищою порівняно з BMA031. Фіг. 16. Виділення мутантів глікозиляції та неглікозильованих антитіл. Гель, забарвлений кумасі блакитним, показує експресію та очищення мутантів глікозиляції. Фіг. 17. Зв'язування мутантів за αβTCR антитілами з FcγRIIIa людини із застосуванням Biacore. Для визначення зв'язування з рекомбінантним FcγRIIIa людини (V158 & F158) використовували Biacore. Фіг. 18. Зв'язування мутантів за αβTCR антитілами з FcγRI людини із застосуванням Biacore. Для визначення зв'язування з рекомбінантним FcγRI людини використовували Biacore. Фіг. 19. Вивільнення цитокінів з PBMC в присутності антитіл до αβTCR мутанту глікозиляції (день 2). Профіль вивільнення цитокінів для TNFa, GM-CSF, IFNy та IL10 антитілами до αβTCR був подібним до профілю, продемонстрованому BMA031 та H66 delta AB. Фіг. 20. Вивільнення цитокінів з PBMC в присутності антитіл до αβTCR мутанту глікозиляції (день 2). Профіль вивільнення цитокінів для IL6, IL4 та IL2 антитілами до αβTCR був подібним до профілю, продемонстрованому BMA031 та H66 delta AB. Фіг. 21. Вивільнення цитокінів з PBMC в присутності антитіл до αβTCR мутанту глікозиляції (день 4). Профіль вивільнення цитокінів для TNFa, GM-CSF, IFNy та IL10 антитілами до αβTCR був подібним до профілю, продемонстрованому BMA031 та H66 delta AB. Фіг. 22. Вивільнення цитокінів з PBMC в присутності антитіл до αβTCR мутанту глікозиляції (день 4). Профіль вивільнення цитокінів для IL6, IL4 та IL2 антитілами до αβTCR був подібним до профілю, продемонстрованому BMA031 та H66 delta AB. Фіг. 23. Профілі зв'язування TRACER. Профілі зв'язування біспецифічних антитіл як з пухлинними клітинами-мішенями, так і з Тклітинами людини визначали шляхом проточної цитометрії. Фіг. 24. Цитоксична активність різних рекрутингових плечей Т-клітин. Було створено набір гуманізованих антитіл BMA031 та з цього набору було відібрано декілька антитіл, які виявляли цитотоксичну активність проти клітинних ліній з експресією антигенів пухлин. 5 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фіг. 25. Профіль вивільнення цитокінів різними рекрутинговими плечима Т-клітин. Набір TRACER з різними рекрутинговими плечей Т-клітин показує подібні профілі вивільнення цитокінів. Великі кількості цитокінів визначають після активації Т-клітини в присутності клітин-мішеней, в той час як в присутності лише нестимульованих PBMC людини рівні цитокіну, що спостерігали, значно нижчі. Фіг. 26. Зв'язування мутантів антитіла до CD52 з FcγRIIIa людини з застосуванням Biacore. Biacore використовували для визначення зв'язування модифікованого антитіла до CD52 з рекомбінантним FcγRIIIa (V158) людини. Антитіла до CD52, які містять мутації S298N/Y300S в домені Fc, використовували для визначення ефекторної функції модифікованої молекули. A: зв'язування з пептидом CD52. B: зв'язування з FcγRIIIa (V158). C: контрольне зв'язування з FcRn миші. Детальний опис винаходу Якщо не зазначено інше, всі технічні та наукові вирази, які використовують в даному документі, мають такі ж значення, які зазвичай розуміються фахівцем в галузі техніки, до якої належить винахід. Будь-які способи або матеріали, подібні або еквівалентні тим, що описані в даному документі, можна використовувати в способах та методиках даного винаходу. Усі публікації, які цитують в даному документі, включено за посиланням у повному обсязі з метою описання та розкриття методологій, реактивів та засобів, представлених в публікаціях, які можна використовувати у зв'язку з даним винаходом. Способи та методики даної заявки в цілому представлені відповідно до традиційних способів, добре відомих в даній галузі техніки, та як описано в різних загальних та більш спеціальних посиланнях, що цитують та обговорюють в даній специфікації, якщо не вказано інше. Див. наприклад, Gennaro, A.R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.; Hardman, J.G., Limbird, L.E., and Gilman, A.G., eds. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D.M. and Blackwell, C.C., eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C.R. and Graham, A., eds. (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed., Springer-Verlag. Гуманізоване моноклональне антитіло, яке викладено в даному документі, є антитілом, що складається з каркаса антитіла людини, в який вміщені гіперваріабельні ділянки (CDR) від антитіла нелюдського походження. Також можуть бути зроблені зміни в акцепторному каркасі людини. Процедури для розробки та отримання гуманізованих антитіл добре відомі в галузі техніки та були описані, наприклад, в Cabilly et al., патенті США № 4816567; Cabilly et aI., заявці на європейський патент 0125023; Boss et al., патенті США № 4816397; Boss et al., заявці на європейський патент 0120694; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., заявці на європейський патент 0194276 B1; Winter, патенті США № 5225539; Winter, заявці на європейський патент 0239400; Padlan, E.A. et al., заявці на європейський патент 0519596. Подальші деталі антитіл, гуманізованих антитіл, сконструйованих антитіл людини та способів їх отримання можна знайти в Kontermann, R. and Dübel, S. eds. (2001, 2010) Antibody Engineering, 2nd ed., Springer-Verlag, New York, NY. Вираз "антитіло", якщо не зазначено інше, використовують для позначення цілих антитіл, а також антиген-зв'язуючих фрагментів таких антитіл. Наприклад, вираз охоплює чотирьохланцюгові молекули IgG, а також фрагменти антитіл. Як використовують в даному документі, вираз "фрагменти антитіла" відноситься до частин інтактного антитіла повної довжини, наприклад, як додатково описано нижче. Антитіла можуть бути будь-якого класу, такими як IgG, IgA або IgM; та будь-якого підкласу, такими як IgG1 або IgG4. Різні класи та підкласи імуноглобуліну мають різні властивості, які можуть бути переважними в різних застосуваннях. Наприклад, антитіла IgG4 мають знижене зв'язування з рецепторами Fc. Специфічність, в контексті антитіл, описаних в даному документі, означає, що заявлене антитіло здатне до селективного зв'язування свого когнатного антигену, яким є комплекс αβTCR.CD3. Антитіла за даним винаходом зв'язують комплекс αβTCR.CD3, який експресується на клітинах. Комплекс αβTCR/CD3 людини є рецепторним комплексом Т-клітини, презентованим на поверхні Т-клітин. Див. Kuhns et al., (2006) Immunity 24:133–139. Цей комплекс є мішенню для 6 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 моноклонального антитіла BMA031 миші (див. заявку на європейський патент EP 0403156; SEQ ID NO: 1 та 2). Імуноглобуліни природного походження мають спільну ядерну структуру, в якій два ідентичних легких ланцюга (близько 24 кДа) та два ідентичних важких ланцюга (близько 55 або 70 кДа) утворюють тетрамер. Амінотермінальна частина кожного ланцюга відома як варіабельна (V) область та може відрізнятися від більш консервативних константних (С) областей залишку кожного ланцюга. У варіабельній області легкого ланцюга (також називаного VL доменом) є C-кінцева частина, відома, як J-область. У варіабельній області важкого ланцюга (також називаного VH доменом), є D-область в доповнення до J-області. Більшість варіації амінокислотної послідовності в імуноглобулінах обмежена трьома окремими положеннями в Vобластях, відомими як гіперваріабельні області або гіперваріабельні ділянки (CDR), які прямо залучені до зв'язування з антигеном. Починаючи з амінокінця, ці області відповідно позначають як CDR1, CDR2 та CDR3. CDR тримаються на місці більш консервативними областями каркаса (FR). Починаючи з амінокінця, ці області відповідно позначають як FR1, FR2, FR3 та FR4. Положення областей CDR та FR та система нумерації були визначені Kabat et al. (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991), та його обновлення, які можна знайти у сітці). В доповнення, межі області CDR в подальшому були визначені номенклатурою IMGT. Варіабельні ділянки антитіл відповідно до описаних варіантів здійснення можна знайти в SEQ ID NO: 5-7 та 12-16, та можна отримати гуманізацією BMA031, тобто перенесенням CDR BMA031 до каркаса людини. Описано дві серії гуманізованих антитіл; серії HEBE1, які містять SEQ ID NO: 5-7, 12 та 13, та серії GL1BM, які містять варіабельні області важкого ланцюга, як показано в SEQ ID NO: 8, 15 та 16. В обох випадках, застосовувана варіабельна область легкого ланцюга є, як показано в SEQ ID NO: 14 (GL1BM VK43). Застосовувані каркаси людини є IGH3-23 у випадку HEBE1 та IGHV1-3*01 та IGKV3-11*01 у випадку GL1BM. Константні області можуть походити з будь-яких константних областей антитіла людини. Гени варіабельної області можна клонувати у вектори експресії в рамці з генами константної області для експресії важкого та легкого ланцюгів імуноглобуліну. Такі вектори експресії можна трансфікувати в клітини хазяїна, які продукують антитіло, для синтезу антитіл. Варіабельні та константні області антитіла людини можна отримати з баз даних послідовностей. Наприклад, послідовності імуноглобуліну доступні в базі даних IMGT/LIGM (Giudicelli et al., (2006) Nucleic Acids Res. 34:(suppl. 1):D781-D784) або VBase (vbase.mrccpe.cam.ac.uk). Неглікозильовані антитіла можуть мати широко модифіковану функціональність; див. Boyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318. Модифікація "delta ab" або Δab, згадувана в даному документі, є модифікацією Fc, яка описана в Armour et al., (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613-2624. Методики для модифікації глікозиляцією областей Fc відомі в даній галузі техніки та включають хімічні, ферментативні та мутаційні засоби, наприклад, мутацію положення N297 в домені CH2. Методики для мутування генів антитіла з метою отримання неглікозильованих молекул IgG описані в Tao and Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595-2601. "Нуклеїнові кислоти", як викладено в даному документі, включають молекули ДНК, які кодують антитіла за даним винаходом. Перевага віддається векторам експресії, які придатні для експресії генів антитіла в клітині хазяїна. Вектори експресії та клітини хазяїна для експресії гену антитіла відомі в даній галузі техніки; див., наприклад, Morrow, K.J. Genetic Engineering & Biotechnology News (June. 15, 2008) 28(12), and Backliwal, G. et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36(15):e96-e96. 1. Антитіла Винахід охоплює антиген-зв'язуючі фрагменти гуманізованих антитіл до αβTCR. Фрагменти антитіл спроможні до зв'язування з комплексом αβTCR.CD3. Вони охоплюють фрагменти Fab, Fab', F(ab')2 та F(v) або індивідуальні варіабельні області легкого або важкого ланцюга або їх частину. Фрагменти включають, наприклад, Fab, Fab', F(ab') 2, Fv та scFv. Ці фрагменти не мають частину Fc інтактного антитіла, швидше виводяться з кровотоку та можуть мати менше неспецифічне тканинне зв'язування, ніж інтактне антитіло. Ці фрагменти можна отримувати з інтактних антитіл, використовуючи добре відомі способи, наприклад, шляхом протеолітичного розщеплення ферментами, такими як папаїн (для створення фрагментів Fab) або пепсин (для створення фрагментів F(ab')2). Антитіла та фрагменти також охоплюють одноланцюгові фрагменти антитіл (scFv), які зв'язуються з комплексом αβTCR.CD3. scFv містить варіабельну область важкого ланцюга антитіла (VH), ефективно з'єднуючись з варіабельною областю легкого ланцюга антитіла (V L), де 7 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіабельна область важкого ланцюга та варіабельна область легкого ланцюга, разом або окремо, формують сайт зв'язування, який зв'язує αβTCR. scFv може містити область VH на амінокінці та область VL на карбоксикінці. Альтернативно, scFv може містити область V L на амінокінці та область VH на карбоксікінці. Також, незважаючи на те, що два домени фрагменту Fv, VL та VH, кодуються окремими генами, їх можна об'єднувати, використовуючи рекомбінантні способи, синтетичним лінкером, що надає їм можливість бути отриманими як одиночний білковий ланцюг, в якому області VL та VH паруються для формування моновалентних молекул (відомих як одноланцюговий Fv (scFv)). В подальшому scFv може необов'язково містити поліпептидний лінкер між варіабельною областю важкого ланцюга та варіабельною областю легкого ланцюга. Антитіла та фрагменти також охоплюють фрагменти домену антитіла (dAb), як описано в Ward, E.S. et al. (1989) Nature 341:544-546, який містить домен VH. Антитіла та фрагменти також охоплюють антитіла важких ланцюгів (HCAb). Описано, що ці антитіла утворюють антиген-зв'язуючи області, використовуючи лише варіабельну область важкого ланцюга, в цьому ці функціональні антитіла є дімерами лише важких ланцюгів (називані як "антитіла важких ланцюгів" або "HCAb"). Відповідно, антитіла та фрагменти можуть бути антитілами важких ланцюгів (HCAb), які специфічно з'єднуються з комплексом αβTCR.CD3. Антитіла та фрагменти також охоплюють антитіла, які є SMIP або злитими білками з доменом зв'язування імуноглобуліну, специфічними до комплексу αβTCR.CD3. Ці конструкти є одноланцюговими поліпептидами, які містять антиген-зв'язуючі домени, злиті з імуноглобуліновими доменами, необхідними для здійснення ефекторних функцій антитіла (див. WO 2005/017148). Антитіла та фрагменти також охоплюють діатіла. Вони являють собою бівалентні антитіла, в яких домени VH та VL експресуються на одиночному поліпептидному ланцюзі, однак, використовуючи лінкер, який є занадто коротким, щоб дозволити спаровування між двома доменами того ж самого ланцюга. Це змушує ці домени спаровуватись з комплементарними доменами іншого ланцюга, і таким чином, утворювати два антиген-зв'язуючи сайти (див., наприклад, WO 93/11161). Діатіла можуть бути біспецифічними або моноспецифічними. Антитіло або фрагмент антитіла, таким чином, не реагує перехресно з будь-якою мішенню, відмінною від комплексу αβTCR.CD3. Антитіло або фрагмент, таким чином, може бути модифікованим для збільшення періоду напіввиведення з плазми, наприклад, додаванням молекул, таких як PEG або інші водорозчинні полімери, включаючи полісахаридні полімери для підвищення періоду напіввиведення. Антитіла або фрагменти, таким чином, можуть бути біспецифічними. Наприклад, біспецифічні антитіла можуть походити на одиночні антитіла (або фрагменти антитіл), однак мати два різних антиген-зв'язуючих сайти (варіабельні області). Біспецифічні антитіла можуть бути отримані різними способами, такими як хімічні методики, методики "полідоми" та методиками рекомбінантної ДНК. Біспецифічні антитіла можуть мати зв'язуючи специфічності щонайменше для двох різних епітопів, щонайменше один з яких є комплексом αβTCR.CD3. Специфічність може бути відібрана з будь-яких корисних або бажаних специфічностей, включаючи, наприклад, специфічність у відношенні сироваткового альбуміну людини для подовження періоду напіввиведення in vivo. Застосування біспецифічних антитіл в клініці для онкологічних застосувань в даний час стає реальністю з три-функціональним катумаксомабом (Removmab®), ухваленим для застосування у випадках злоякісних асцитів, та з біспецифічним антитілом блинатумомаб, яке в даний час у ІІ фазі клінічних випробувань при гемобластозах. Спільним у цих молекул є плече для зв'язування, яка зв'язується з Т-клітинами, та друге плече, яке зв'язується з пухлинною клітиною-мішенню, що приводить до опосередкованого Т-клітинами лізису мішені-пухлини. Також спільним є те, що ці молекули рекрутують Т-клітини за допомогою білка CD3, який розміщений на поверхні клітини. Альтернативою рекрутингу за допомогою CD3 є застосування αβ-рецептора Т-клітини (αβ TCR), який також експресується на поверхні клітини. Таким чином, антитіла, відповідні до даного винаходу, можуть бути застосуванні для розвитку протипухлинних антитіл комбінацією специфічності до пухлино-асоційованого антигену зі специфічністю до αβрецептора T-клітини (αβ TCR). 2. Отримання антитіла Амінокислотні послідовності варіабельних доменів антитіл, описаних в даному документі викладені в SEQ ID NO: 5-7 та 12-16. Отримання антитіла може бути здійснено за допомогою будь-якої методики, відомої в даній галузі техніки, включаючи трансгенні організми, такі як кози (див. Pollock et al. (1999) J. lmmunol. Methods 231:147-157), курчата (див. Morrow, K.J.J. (2000) Genet. Eng. News 20:1-55), миші (див. Pollock et al., supra) або рослини (див. Doran, P.M. (2000) 8 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Curr. Opinion Biotechnol. 11:199-204, Ma. J.K-C. (1998) Nat. Med. 4:601-606, Baez, J. et al. (2000) BioPharm. 13:50-54, Stoger, E. et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590). Антитіла також можуть бути отримані шляхом хімічного синтезу або експресії генів, які кодують антитіла в клітинах хазяїна. Полінуклеотид, який кодує антитіло, ізолюють та вставляють в конструкт, що реплікується, або вектор, такий як плазміду, для подальшого розмноження або експресії в клітині хазяїна. Конструкти або вектори (наприклад, вектори експресії), придатні для експресії гуманізованого імуноглобуліну, відповідно до описаних варіантів здійснення є доступними в даній галузі техніки. Ряд векторів є доступним, включаючи вектори, які підтримуються в одиночній копії або багатьох копіях в клітині хазяїна, або які стають інтегрованими в хромосому(и) клітини хазяїна. Конструкти або вектори можуть бути введені в придатну клітину хазяїна та клітини, які експресують гуманізований імуноглобулін, можуть бути отримані та підтримані в культурі. Одиночний вектор або багато векторів можна використовувати для експресії гуманізованого імуноглобуліну. Полінуклеотиди, які кодують антитіло, легко виділяють та секвенують за допомогою традиційних процедур (наприклад, олігонуклеотидних зондів). Вектори, які можна використовувати, включають плазміду, вірус, фаг, траспозони, мініхромосоми, з яких плазміди є типовим варіантом здійснення. В цілому такі вектори в подальшому включають сигнальну послідовність, точку початку реплікації, один або декілька маркерних генів, енхансерний елемент, промотор та послідовності термінації транскрипції, функціонально зв'язані з полінуклеотидами легкого та/або важкого ланцюга для полегшення експресії. Полінуклеотиди, які кодують легкий та важкий ланцюги, можуть бути вставлені в окремі вектори та введені (наприклад, шляхом трансформації, трансфекції, електропорації або трансдукції) в ту ж саму клітину хазяїна одночасно або послідовно або, за бажанням, як важкий ланцюг, так і легкий ланцюг можуть бути вставлені в той же самий вектор перед таким введенням. Для експресії в придатній клітині хазяїна може передбачатися промотор. Промотори можуть бути конститутивні та індуцибельні. Наприклад, промотор можна функціонально зв'язувати з нуклеїновою кислотою, яка кодує гуманізований імуноглобулін або ланцюг імуноглобуліну, такий, що спрямовує експресію закодованого поліпептиду. Для прокаріотичних та еукаріотичних хазяїв доступним є ряд придатних промоторів. Промотори прокаріотів включають промотори lac, tac, T3, T7 для E. coli; 3-фосфогліцераткіназу або інші гліколітичні ферменти, наприклад, енолазу, гліцеральдегід, 3-фосфатдегідрогеназу, гексокіназу, піруватдекарбоксилазу, фосфофруктокіназу, глюкозо-6-фосфатізомеразу, 3-фосфогліцератмутазу та глюкокіназу. Промотори еукаріотів включають індуцибільні промотори дріжджів, такі як алкогольдегідрогеназа 2, ізоцитохром С, кисла фосфатаза, металотіонеїн та ферменти, відповідні за метаболізм азоту або утилізацію мальтози/галактози; промотори РНК-полімерази ІІ, в тому числі промотори вірусів, таких як поліома, віспа курей та аденовіруси (наприклад, аденовірус 2), вірус папіломи великої рогатої худоби, вірус саркоми птахів, цитомегаловірус (зокрема, промотор передраннього гену), ретровірус, вірус гепатиту В, актин, промотор вірусу саркоми Рауса (RSV) та ранній та пізній промотори вірусу мавп 40 та не вірусні промотори, такі як EF-1 альфа (Mizushima та Nagata (1990) Nucleic Acids Res. 18(17):5322). Фахівці в даній галузі техніки спроможні підібрати відповідний промотор для експресії гуманізованого антитіла або його частини. У відповідних випадках, наприклад, для експресії в клітинах вищих еукаріот, можна включати додаткові енхансерні елементи замість тих або такі ж, як знайдені розміщеними в промоторах, описаних вище. Відповідні енхансерні послідовності ссавців включають енхансерні елементи з глобіну, еластази, альбуміну, фетопротеїну, металотіоніну та інсуліну. З іншого боку, можна використовувати енхансерний елемент з вірусу еукаріотичної клітини, такий як енхансер SV40, енхансер передраннього гену цитомегаловірусу, енхансер поліоми, бакуловірусний енхансер або локус lgG2a миші (див. WO 04/009823). Хоча ці енхансери часто розміщуються на векторі в сайті, який знаходиться вище промотора, їх також можна розміщувати в іншому місці, наприклад, в нетрансльованій області або нижче сигналу поліаденілування. Вибір та розміщення енхансера можуть бути засновані на сумісності з клітиною хазяїна, що використовується для експресії. Крім цього, вектори (наприклад, вектори експресії) можуть містити вибираний маркер для вибору клітин хазяїна, які несуть цей вектор, та, у випадку вектору, який реплікують, точку початку реплікації. Гени, які кодують продукти, що надають резистентність до антибіотику або лікарського засобу, являють собою поширені вибирані маркери, та можуть бути застосовувані в прокаріотичних (наприклад, ген f3-лактамази (резистентність до ампіциліну), ген Tet (резистентність до тетрацикліну)) та еукаріотичних клітинах (наприклад, гени резистентності до 9 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 неоміцину (G418 або генетицину), gpt (мікофенольної кислоти), ампіциліну або гідроміцину). Маркерні гени дигідрофолатредуктази дозволяють проводити відбір по метотрексату у різноманітних хазяїв. Гени, які кодують генетичний продукт ауксотрофних маркерів хазяїна (наприклад, LEU2, URA3, HIS3) часто використовують в якості вибираних маркерів у дріжджів. Також розглядають застосування вірусних (наприклад, бакуловірусних) або фагових векторів та векторів, які спроможні до інтегрування до геному клітини хазяїну, такі як ретровірусні вектори. В еукаріотичних системах сигнали поліаденілювання та термінації функціонально зв'язуються з полінуклеотидом, що кодує антитіло за даним винаходом. Такі сигнали зазвичай розміщуються на 3'-кінці відкритої рамки зчитування. В системах ссавців необмежені приклади сигналів поліаденілювання/термінації включають такі, що походять від генів гормонів росту, фактору елонгації 1 альфа та вірусів (наприклад, SV40) або ретровірусних довгих термінальних повторів. В системах дріжджів необмежені приклади сигналів поліаденілювання/термінації включають такі, що походять від генів фософгліцераткінази (PGK) та алкогольдегідрогенази 1 (ADH). В прокаріотичних системах сигнали поліаденілювання зазвичай не потребуються, а замість цього зазвичай використовують більш визначені послідовності термінатора. Вибір послідовностей поліаденілування/термінації може бути заснований на сумісності з клітиною хазяїна, що використовується для експресії. На додаток до вищезазначеного, можна використовувати інші характеристики для підсилення виходу, що включають модифікацію елементів реконструкції хроматину, інтронів та специфічного кодону клітини хазяїна. Застосування кодону антитіл за даним винаходом може бути модифіковано для пристосування зсуву кодону клітини хазяїна з метою підвищення виходу транскрипту та/або продукту (наприклад, Hoekema, A. et al. (1987) Mol. Cell Biol. 7(8):2914-24). Вибір кодонів може бути заснований на сумісності з клітиною хазяїна, що використовується для експресії. Таким чином, даний винахід відносять до молекул виділених нуклеїнових кислот, які кодують гуманізовані імуноглобуліни, або їх важкий або легкий ланцюги. Даний винахід також відносять до молекул виділених нуклеїнових кислот, які кодують антиген-зв'язуючу частину імуноглобулінів та їх ланцюги. Антитіла можна отримувати, наприклад, шляхом експресії однієї або більше рекомбінантних нуклеїнових кислот, які кодують антитіло, у придатній клітині хазяїна. Клітину хазяїна можна отримувати, використовуючи будь-який зручний спосіб. Наприклад, конструкти експресії (наприклад, один або більше векторів, наприклад, вектор експресії клітини ссавця), описані в даному документі, можна вводити до придатної клітини хазяїна, а клітину, отриману в результаті цього, можна підтримувати (наприклад, в культурі, в тварині, в рослині) за умов, зручних для експресії конструкту(ів) або вектору(ів). Клітини хазяїна можуть бути прокаріотичними, включаючи бактеріальні клітини, наприклад, E. coli (наприклад, штам DH5a™) (Invitrogen, Carlsbad, CA), PerC6 (Crucell, Leiden, NL), B. subtilis та/або інші придатні бактерії; еукаріотичними клітинами, такими як клітини грибів та дріжджів (наприклад, Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa), або іншими клітинами нижчих еукаріот, та клітинами вищих еукаріот, наприклад, таких як з комах (наприклад, клітини S2 Drosophila Schnieder, клітини комах Sf9) (WO 94/126087 (O'Connor)), клітин BTI-TN-5B1-4 комах (High Five™) (Invitrogen), ссавців (наприклад, клітин COS, включаючи COS-1 (номер доступу до ATCC, CRL-1650) та COS-7 (номер доступу до ATCC, CRL-1651), CHO (наприрклад, номер доступу до ATCC, CRL-9096), CHO DG44 (Urlaub, G. and Chasin, L.A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7):4216-4220), 293 (номер доступу до ATCC, CRL-1573), HeLa (номер доступу до ATCC, CCL-2), CVl (номер доступу до ATCC, CCL-70), WOP (Dailey, L., et al. (1985) J. Virol., 54:739-749), 3T3, 293T (Pear, W.S., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396), клітини NSO, клітини SP2/0, клітини HuT 78 та інші, та рослин (наприклад, тютюну, лемни (ряски) та водоростей). Див., наприклад, Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993). В деяких варіантах здійснення, клітина хазяїна не є частиною багатоклітинного організму (наприклад, рослини або тварини), наприклад, вона є виділеною клітиною хазяїна або частиною клітинної культури. Клітини хазяїна можна культивувати в колбах з перемішуванням, колбах, що струшуються, ролерних флаконах, хвильових реакторах (наприклад, System 1000 з wavebiotech.com) або системах з порожніми волокнами, однак, переважно для великомасштабного виробництва, використовують реакційні апарати з мішалкою або мішкові реактори (наприклад, Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA), особливо, для суспензійних культур. Реакційні апарати з мішалкою можна адаптувати для аерації, використовуючи, наприклад, розподілювачі, перегородки або імпелери з низькими обертами. Для барботажних колонок та аероліфтних реакторів може бути застосована пряма аерація бульбашками повітря або кисню. В тих випадках, коли клітини 10 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хазяїна культивують в безсироватному середовищі, до середовища можна додавати клітиннопротекторний засіб, наприклад, плюроновий F-68, щоб допомогти запобігти руйнуванню клітин внаслідок процесу аерації. В залежності від характеристик клітини хазяїна, можуть бути застосуванні мікропереносники в якості підкладок для вирощування якірно-залежних клітинних ліній, або клітини можуть бути адаптовані для суспензійної культури. Культивування клітин хазяїна, особливо, клітин хребетного хазяїна, може застосовувати ряд операційних режимів, наприклад, оброблення серії, культури з підживленням, повторної періодичної обробки (див., Drapeau et al. (1994) Cytotechnology 15:103-109), подовжений періодичний процес або перфузійну культуру. Незважаючи на те, що рекомбінантно трансформовані клітини хазяїна ссавців можна культивувати в середовищі, що містить, сироватку, такому середовищі, що містить фетальну телячу сироватку (FCS), переважно такі клітини хазяїна культивують в безсироватному середовищі, як розкрито в Keen et al. (1995) Cytotechnology 17:153-163, або комерційно доступних середовищах, наприклад, ProCHO-CDM або UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA), з додаванням при необхідності джерела енергії, такого як глюкоза, або синтетичних факторів росту, таких як рекомбінантний інсулін. Безсироватне культивування клітин хазяїна може потребувати, щоб клітини були адаптовані до росту в безсироватних умовах. Одним адаптаційним підходом є культивування таких клітин хазяїна в середовищі, яке містить сироватку, та повторний обмін 80 % середовища культури на безсироватну культуру для того, щоб клітини хазяїна навчились адаптуватись до безсироватних умов (див., наприклад, Scharfenberg, K. et al. (1995) Animal Cell Technology: Developments Towards the 21st Century (Beuvery, E.C. et al., eds), pp.619-623, Kluwer Academic publishers). Антитіла відповідно до описаних варіантів здійснення можуть бути секретовані в середовище, та відновлені та очищені звідти, за допомогою низки методик з метою забезпечення ступеню очистки, який підходить для запланованого застосування. Наприклад, застосування терапевтичних антитіл для лікування людей зазвичай потребує щонайменше 95 % чистоти, як визначено зниженням SDS-PAGE, більш типово 98 % або 99 % чистоти, порівняно із середовищем культури, що містить терапевтичні антитіла. В першому випадку, клітинні залишки з середовища культури можуть бути видалені за допомогою центрифугування з подальшим етапом очищення супернатанта, наприклад, мікрофільтрації, ультрафільтрації та/або глибинної фільтрації. З іншого боку, антитіло можна збирати мікрофільтрацією, ультрафільтрацією або глибинною фільтрацією без попереднього центрифугування. Доступною є низка інших методик, такі як діаліз, гель-електрофорез та хроматографічні методики, такі як гідроксіапатитова (HA), афінна хроматографія (вибірково включає афінну тегову систему, таку як полігістидин) та/або хроматографію з гідрофобною взаємодією (HIC) (див., US 5429746). В одному варіанті здійснення антитіла, які послідовно рухаються різними етапами очищення, захоплюються за допомогою афінної хроматографії білку А або G з подальшими етапами хроматографії, такими як іон-обмінна хроматографія та/або НА хроматографія, аніон- або катіон-обмінна, ексклюзійною хроматографією та осадженням сульфатом амонію. Також можуть бути застосовані різні етапи по видаленню вірусів (наприклад, нанофільтрація, із застосуванням, наприклад, фільтру DV-20). Слідом за цими різними етапами, передбачають отримання з очищенням, яке містить щонайменше 10 мг/мл або більше, наприклад, 100 мг/мл або більше антитіла за даним винаходом, та, таким чином, формується інший варіант здійснення винаходу. Концентрація до 100 мг/мл або більше може бути утворена ультрацентрифугуванням. Такі препарати в значному ступені вільні від агрегованих форм антитіл за даним винаходом. Бактеріальні системи особливо придатні для експресії фрагментів антитіл. Такі фрагменти розміщуються внутрішньоклітинно або в періплазмі. Нерозчинні періплазматичні білки можуть бути екстраговані та розгорнуті для формування активних білків відповідно до відомих фахівцям даної галузі способів, див., Sanchez et al. (1999) J. Biotechnol. 72:13-20; Cupit, P.M. et al. (1999) Lett. Appl. Microbiol. 29:273-277. Даний винахід також відносять до клітин, які містять нуклеїнову кислоту, наприклад, вектор, за даним винаходом (наприклад, вектор експресії). Наприклад, нуклеїнова кислота (тобто, одна або декілька нуклеїнових кислот), яка кодує важкий та легкий ланцюги гуманізованого імуноглобуліну відповідно до описаних варіантів здійснення, або конструкт (тобто, один або більше конструктів, наприклад, один або більше векторів), який містить таку нуклеїнову(і) кислоту(и), можуть бути введені до придатної клітини хазяїна способом, відповідним для відібраної клітини хазяїна (наприклад, трансформацією, трансфекцією, електропорацією, інфекцією), з нуклеїновою(ими) кислотою(ами), які є або стануть функціонально з'єднаними з одним або декількома елементами контролю експресії (наприклад, в векторі, в конструкті, який створено процесами в цій клітині, інтегрованому в геном клітини хазяїна). Клітини хазяїна можна підтримувати за умов, зручних для експресії (наприклад, в присутності індуктора, зручного 11 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 середовища, в який додано відповідні солі, фактори росту, антибіотичні, харчові домішки тощо), в той час, як продукуються закодований(і) поліпептид(и). При бажанні закодоване гуманізоване антитіло може бути виділеним, наприклад, з клітин хазяїна, середовища культивування або молока. Цей процес охоплює експресію в клітині хазяїна (наприклад, залозистій клітині ссавця) трансгенної тварини або рослини (наприклад, тютюну) (див., наприклад, WO 92/03918). 3. Терапевтичні застосування Супресія активності Т-клітин є бажаною в низці ситуацій, в яких імуносупресія виправдана та/або виникає аутоімунне захворювання. Відповідно, потребується націлювання на комплекс αβTCR.CD3 при лікуванні хвороб, що включають недоречну або небажану імунну відповідь, наприклад, запалення, аутоімунну реакцію та інші стани, що включають такі механізми. В одному варіанті здійснення, такою хворобою або порушенням є аутоімунне та/або запальне захворювання. Прикладами таких аутоімунних та/або запальних захворювань є системний червоний вовчак (SLE), ревматоїдний артрит (RA) та запальне захворювання кишечнику (IBD) (включаючи виразковий коліт (UC) та хворобу Крона (CD)), розсіяний склероз (MS), склеродерму та діабет 1 типу (T1D) та інші захворювання та порушення, такі як PV (вульгарна пухирчатка), псоріаз, атопічний дерматит, целіакія, хронічна обструктивна хвороба легень, тиреоїдит Хашимото, базедова хвороба (щитоподібна залоза), синдром Шегрена, синдром Гійєна-Барре, синдром Гудпасчера, хвороба Адісона, грануломатоз Вегенера, первинний склероз жовчних шляхів, склерозуючий холангіт, аутоімунний гепатит, ревматична поліміалгія, синдром Рейно, темпоральний артеріїт, гігантоклітинний артеріїт, аутоімунна гемолітична анемія, перніціозна анемія, вузликовий поліартеріїт, хвороба Бехчета, первинний біліарний цироз печінки, увеїт, міокардит, ревматичний поліартрит, анкілозуючий спондиліт, гломерулонефрит, саркоїдоз, дерматоміозит, міастенія гравіс, поліміозит, гніздова алопеція та вітіліго. В одному варіанті здійснення такою хворобою або порушенням є SLE, RA або IBD. В одному варіанті здійснення такою хворобою або порушенням є MS. В іншому варіанті здійснення антитіла відповідно до описаних варіантів здійснення використовують для сприяння трансплантації шляхом імуносупресії пацієнта. Таке застосування полегшує реакцію трансплантат проти хазяїна. Для опису існуючих способів лікування реакції трансплантат проти хазяїна див., наприклад, Svennilson, Bone Marrow Transplantation (2005) 35:S65–S67, та посилання, які цитують, в даному документі. Переважно, антитіла за даним винаходом можна використовувати в комбінації з іншими доступними видами терапії. Приймаючи до уваги лікування аутоімунних захворювань, комбінована терапія може включати застосування антитіла за даним винаходом разом з медикаментом, який сумісно з цим антитілом містить ефективну кількість для попередження або лікування таких аутоімунних захворювань. Якщо вказане аутоімунне захворюванням є діабетом 1 типу, комбінована терапія може охоплювати один або декілька засобів, які сприяють росту бета-клітин підшлункової залози або зміцнювати трансплантацію бета-клітин, таких як фактори росту та виживання бетаклітин або імуномодулюючі антитіла. Якщо вказана аутоімунна хвороба є ревматоїдним артритом, вказана комбінована терапія може охоплювати один або декілька з метотрексату, антитіла до TNF-β, злитого білку TNF-β рецептора-lg, антитіла до IL-15 або IL-21, нестероїдного протизапального лікарського засобу (NSAID) або хворобо-модифікуючого протиревматичного лікарського засобу (DMARD). Наприклад, додатковий засіб може бути біологічним засобом, таким як засіб проти TNF (наприклад, Enbrel®, інфліксімаб (Remicade®) та адалімумаб (Humira®) або ритуксімаб (Rituxan®). Якщо вказана аутоімунна хвороба є відторгненням гематопоетичного трансплантата, можна застосовувати гематопоетичний(і) фактор(и) росту (такий як еритропоетин, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-11, тромбопоетин тощо) або антимікробний(і) засіб(оби) (такий як антибіотичні, противірусні, протигрибкові лікарські засоби). Якщо вказане аутоімунне захворюванням є псоріаз, додатковим засобом може бути один або декілька дьогтей або його похідних, фототерапія, кортикостероїди, циклоспорин А, аналоги вітаміну D, метотрексат, p38 мітоген-активовані інгібітори протеїнкінази (MAPK), а також біологічні засоби, такі як засоби проти TNF та Rituxan®. Якщо вказане аутоімунне захворюванням є запальне захворювання кишечнику (IBD), таке як, наприклад, хвороба Крона або виразковий коліт, додатковий засіб може бути одним або декількома з аміносаліцилатів, кортикостероїдів, імуномодуляторів, антибіотиків або біологічних засобів, таких як Remicade® та Humira®. Комбіноване лікування може бути проведене будь-яким чином, як вважається за потрібне або вважається придатним фахівцем в даній галузі техніки та для мети цієї специфікації, не передбачається обмежень по відношенню до порядку, кількості, повтору або відносної кількості сполук, які треба застосовувати в комбінації. Таким чином, антитіла відповідно до описаних 12 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіантів здійснення можуть бути складені у фармацевтичні композиції для застосування в терапії. 4. Фармацевтичні композиції У переважному варіанті здійснення передбачається фармацевтична композиція, котра містить антитіло відповідно до даного винаходу, або ліганд або ліганди, які ідентифікують способом аналізу, який визначений в попередньому аспекті винаходу. Ліганди можуть бути імуноглобулінами, пептидами, нуклеїновими кислотами або малими молекулами, як обговорюється в даному документі. Їх називають, в подальшому обговоренні, як "сполуки". Фармацевтичною композицією відповідно до даного винаходу є композиція речовини, яка містить сполуку або сполуки, здатні до модуляції активності Т-клітин в якості активного інгредієнта. Сполука знаходиться у формі будь-якої фармацевтично прийнятної солі, або, наприклад, при необхідності, аналогу, форми вільної основи, таутомера, енантіомера, рацемічної суміші або їх комбінації. Припускають, що активні інгредієнти фармацевтичної композиції, які містять активний інгредієнт відповідно до даного винаходу, проявляють терапевтичну активність, наприклад, при лікуванні реакції трансплантат проти хазяїна, при застосуванні у кількості, яка залежить від конкретного випадку. В іншому варіанті здійснення одну або декілька сполук за даним винаходом можна використовувати у комбінації з будь-якою визнаною в галузі сполукою, яка підходить для лікування визначеного симптому при лікуванні будь-якого із зазначених вище станів. Таким чином, одну або декілька сполук за даним винаходом можна об'єднувати з однією або декількома загальновизнаними в галузі сполуками, котрі, як відомо, придатні для лікування вищенаведених симптомів, так, що зручну однократну композицію можна вводити суб'єкту. Режими дозування можуть бути пристосовані для забезпечення оптимальної терапевтичної відповіді. Наприклад, декілька розділених доз можна вводити щоденно або доза може бути пропорційно зменшена, як вказано потребами терапевтичної ситуації. Активний інгредієнт може бути застосовуваний в зручній спосіб, таким як оральний, внутрішньовенний (якщо водорозчинний), внутрішньом'язовий, підшкірний, інтраназальний, інтрадермальний або супозіторним шляхом або імплантацією (наприклад, використовуючи молекули з повільним вивільненням). В залежності від шляху застосування, може бути необхідним покрити активний інгредієнт матеріалом для захисту вказаних інгредієнтів від дії ферментів, кислот та інших природних умов, які можуть інактивувати вказаний інгредієнт. Для того, щоб увести активний інгредієнт шляхом, відмінним від парентерального введення, він повинен бути вкритим, або вводитися з матеріалом для запобігання його інактивації. Наприклад, активний інгредієнт може бути застосованим в ад'юванті, сумісно вводитися з інгібітором ферментів або в ліпосомах. Ад'ювант використовують в його найширшому розумінні, та він включає імуностимулюючу сполуку, наприклад, інтерферон. Ад'юванти, які припускають в даному документі, включають резорциноли, неіонні сурфактанти, такі як поліоксиетиленовий олеїловий етер та n-гексадециловий поліетиленовий етер. Інгібітори ферментів включають трипсин підшлункової залози. Ліпосоми включають вода-в-маслі-у-воді емульсії CGF, а також звичайні ліпосоми. Активний інгредієнт також може бути застосовуваним парентерально або інтраперітонеально. Дисперсії також можна отримати в гліцерині, рідких поліетиленгліколях та їх сумішах та в маслах. За звичайних умов зберігання та застосування, ці препарати містять консервант для запобігання росту мікроорганізмів. Фармацевтичні форми, придатні для ін'єкційного застосування, включають стерильні водневі розчини (якщо водорозчинні) або дисперсії та стерильні порошки для екстемпорального приготування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій. В усіх випадках форма має бути стерильною і має бути рідкою до ступеня, який повинен бути для легкого ведення через шприц. Вона має бути стабільною за умов виробництва та зберігання та має бути збереженою від забруднюючої дії мікроорганізмів, таких як бактерії та гриби. Носій може бути розчинником або диспергентом, що містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь та рідкий поліетиленгліколь та тому подібне), їх прийнятні суміші та рослинні олії. Належну плинність можна підтримувати, наприклад, застосуванням покриття, такого як лецитин, підтримкою необхідного розміру частинки у випадку дисперсії та застосуванням сурфактантів. Запобігання дії мікроорганізмів може досягатися різними антибактеріальними та протигрибковими засобами, наприклад, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбіновою 13 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислотою, тірмеросалом та тому подібними. У деяких випадках переважним може бути включення ізотонічних засобів, наприклад, цукрів та хлориду натрію. Подовжене всмоктування ін'єкційних композицій може досягатися застосуванням в композиціях засобів, які уповільнюють всмоктування, наприклад, алюмінію моностеарату та желатину. Стерильні ін'єкційні розчини отримують шляхом включення активного інгредієнта в потрібну кількість відповідного розчинника з низкою інших інгредієнтів, перелічених вище, при необхідності, з подальшою стерилізацією фільтруванням. Зазвичай, дисперсії отримують шляхом включення стерилізованого активного інгредієнта в стерильний носій, який містить основний диспергент та потрібні інші інгредієнти з перелічених вище. У випадку стерильних порошків для отримання стерильних ін'єкційних розчинів, переважними методами приготування є вакуумна сушка та методика заморозки-сушки, результатом якої є порошок з активним інгредієнтом з будь-яким додатковим бажаним інгредієнтом з його попередньо стерилізованого фільтрацією розчину. Різноманітні інші матеріали можуть бути присутніми у якості покриття або для модифікації іншим чином фізичної форми одиниці дозування. Звичайно, будь-який матеріал, який використовують в отриманні будь-якої форми одиниці дозування повинен бути фармацевтично чистим та по суті нетоксичним в кількостях, що застосовуються. Також активний інгредієнт може бути включений в препарати та склади повільного вивільнення. Як використовується в даному документі "фармацевтично прийнятний носій та/або розчинник" включає будь-які та всі розчинники, диспергенти, покриття, антибактеріальні та протигрибкові засобі, ізотонічні засоби та засоби, що уповільнюють всмоктування, та тому подібне. Застосування таких середовищ та засобів для фармацевтично активних речовин добре відомо в даній галузі техніки. За виключенням випадків, коли традиційне середовище або засіб є несумісним з активним інгредієнтом, пропонується застосування цих терапевтичних композицій. Додаткові активні інгредієнти також можуть бути включені в композиції. Особливо переважним є складання парентеральних композицій в формі одиниці дозування для легкого введення та однорідності дози. Форма одиниці дозування, що використовують в даному документі, відноситься до фізично дискретних одиниць, які придатні у якості однократної дози для суб'єктів-ссавців, які потребують лікування; кожна одиниця містить попередньо визначену кількість активного матеріалу, розраховану викликати бажаний терапевтичний ефект разом з необхідним фармацевтичним носієм. Специфікація нових форм одиниць дозування за даним винаходом зумовлена та прямо залежить від а) унікальних характеристик активного матеріалу та конкретного терапевтичного ефекту, що треба досягти, та б) обмежень, притаманних в галузі отримання складу, таких як активний матеріал для лікування хвороби у живих суб'єктів із хворобою, при якому стан фізичного здоров'я погіршується. Основні активні інгредієнти складають для зручного та ефективного введення в ефективних кількостях з відповідним фармацевтично прийнятним носієм у формі одиниці дозування. У випадку композицій, які містять додаткові активні інгредієнти, дози встановлюють виходячи із звичайної дози та способу введення вказаних інгредієнтів. Для полегшення доставки пептидних сполук, включаючи антитіла, до клітин, пептиди можна модифікувати для поліпшення їх здатності перетинати клітинну мембрану. Наприклад, US 5149782 розкриває застосування фузогенних пептидів, пептидів, які утворюють іонний канал, мембранних пептидів, довго ланцюгових жирних кислот та інших мембранних комбінованих засобів для збільшення швидкості білкового транспорту крізь клітинну мембрану. Ці та інші способи також описані у WO 97/37016 та US 5108921, що включені в даному документі за посиланням. В додатковому аспекті пропонується активний інгредієнт за даним винаходом, який описаний вище в даному документі, визначений для застосування при лікуванні хвороби або самостійно, або в комбінації з визнаними в галузі сполуками, які відомі, як придатні для лікування конкретного симптому. Внаслідок цього, пропонується застосування активного інгредієнта за даним винаходом для виробництва медикаменту для лікування хвороби, асоційованої з аномальною імунною відповіддю. Також пропонується спосіб лікування стану, асоційованого з аномальною імунною відповіддю, який включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості ліганду, розпізнаваного за допомогою способу аналізу, який описаний вище. Далі даний винахід описаний в наступних прикладах лише з метою ілюстрації. Порівняльний приклад 1 Зв'язування та біологічна активність EuCIV3 зменшена порівняно з BMA031 За допомогою проточної цитометрії було показано, що EuCIV3 поступається BMA031 за зв'язуванням з Т-клітиною (фіг.1). В цьому конкурентному методі Т-клітини інкубували на льоді в 14 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 присутності фіксованої концентрації безпосередньо міченого фікоеритрином MoIgG2b-BMA031 (мишаче конкурентне антитіло) та при збільшенні концентрації антитіл до αβTCR. Після 20 хвилин інкубації клітини відмивали та зв'язане з поверхнею мічений фікоеритрином MoIgG2bBMA031 визначали проточної цитометрією. Хімерне антитіло BMA031 HuIgG1 конкурувало значно більш ефективно, ніж EuCIV3. Для того, щоб оцінити здатність інгібувати активність Т-клітин in vivo, CD8+ Т-клітини обробляли антитілами до αβTCR при різних концентраціях (див., фіг.2, ось x) та сумісно культивували з аутологічними дендритними клітинами (DC), активованими CMV пептидом 495503 (pp65) протягом семи днів в in vitro методі навчання (IVE). + Продукти аферезу нормальних донорів від HLA-A2 осіб отримували від HemaCare Corp., Van Nuys, Каліфорнія. PBMC виділяли центрифугуванням через фікол (GE Healthcare, Piscataway, Нью-Джерсі). CD8+T-клітини виділяли із застосуванням магнітних мікроносіїв (Invitrogen, Карсбад, Каліфорнія) відповідно до інструкцій виробника. Для утворення аутологічних незрілих дендритних клітин PBMC повторно суспензували в RPMI 1640/5 % сироватці AB людини (Sigma), висіювали в потрійні колби (Corning) та інкубували більше 2 годин при 37 °C/5 %CO2. Приклеєні моноцити потім промивали з PBS та культивували протягом 6 днів в RPMI 1640/5 % сироватці АВ людини з додаванням GM-CSF (Immunex, Сіетл, Вашингтон) та IL-4 (PeproTech, Рокі-Хіл, Нью-Джерсі). Перед утворенням сумісних культур Т-клітина/DC протягом 4 годин DC активували пептидами (10 мкг/мл) та потім дозволяли їм дозріти. Зрілі дендритні клітини отримували додаванням 50 нг/мл TNF-альфа, 25 нг/мл IL-1β, 10 нг/мл IL-6, 500 нг/мл PGE-2 (PeproTech, Рокі-Хіл, Нью-Джерсі) та культивуванням дендритних клітин протягом додаткових 24 годин. Пептид-активовані DC потім додавали до попередньо виділених CD8+T-клітин у співвідношенні T:DC 10:1. Культури негайно живили IL-2 (100 МО/мл), який додавали до культур. На 4 день культури доповнювали з IL-2 (100 МО/мл). На 7 день змішані культури аналізували щодо пептидної реактивності в аналізі вивільнення хрому. Діаграма на фіг. 2 показує дані лізису, отримані за результатами аналіза вивільнення хрому, де необроблені Т-клітини успішно навчалися проти пептиду pp65 та були здатні лізувати специфічні мішені у >50 % випадків. BMA031 пригнічувало навчання цих T-клітин, оскільки вони були нездатні лізувати специфічні мішені дозозалежним чином. Гуманізоване антитіло EuCIV3 було менш сильним, ніж BMA031, та було здатне пригнічувати навчання лише в найвищий дозі. Приклад 2 Fc-інженерія хімерних антитіл BMA031 In vitro профіль Оцінювали in vitro профіль BMA031 в панелі тестів. В таблиці 1 показан in vitro профіль BMA031. В цих тестах BMA031 порівнювали з OKT3. В тесті проліферації PBMC PBMC людини культивували при зростаючих концентраціях 3 терапевтичного антитіла протягом 72 годин, додавали H-тимідин та через 18 годин клітини збирали. В тесті виснаження Т-клітин/вивільнення цитокінів PBMC людини культивували при зростаючих концентраціях терапевтичного антитіла та аналізували щоденно на кількості та життєздатність клітин (Vi-Cell, Beckman Coulter) до 7 доби. Також збирали клітинні супернатанти, зберігали при -20 °C та аналізували на 8-секційній цитокіновій панелі (Bio-Rad). BMA031 не індукує: (i) проліферацію PBMC; (ii) виснаження T-клітин; (iii) експресію CD25 або (iv) вивільнення цитокінів. Навпаки, OKT3 індукує всі вищезазначені ефекти. BMA031 та OKT3 здатні до блокування навчання CD8+ клітин до пептиду в in vitro тесті навчання (IVE) та також здатні до блокування реакції змішаної культури лімфоцитів (MLR). BMA031 також індукує апоптоз активованих T-клітин (індукована активацією клітинна загибель; AICD). На відміну від BMA031, хімерний варіант BMA031 (HuIgG1), з константною областю людського IgG1 дикого типу, має in vitro профіль порівняний до OKT3 (таблиця 1). Була висунута гіпотеза, що включення FcγR є ключовим для цієї зміни in vitro профілю для BMA031 HuIgG1 порівняно з BMA031 MoIgG2b. Таким чином, отримували фрагменти F(ab") 2 BMA031 HuIgG1 та знайшли, що вони відновлюють профіль BMA031 MoIgG2b. За допомогою Fcінженерії включили модифікації, які усували зв'язування FcγR в мутаціях, відомих як "дельта ab" (Armour et al. (1999) Eur. J. Immunol., 29:2613-2624), а також з отриманням неглікозильованої форми HuIgG4 (N297Q). Антитіла до αβTCR HuIgG1 дельта ab та HuIgG4 agly мали такий самий in vitro профіль, що і MoIgG2b BMA031 (таблиця 1). 15 UA 115533 C2 Таблиця 1 ОКТ3 BMA031 MoIgG2b BMA031 HuIgG1 BMA031 F(ab)2 BMA031 Δab HuIgG1 HEBE1 Δab HuIgG1 HEBE1 IgG4 agly 5 10 15 20 25 30 35 40 Зв'язування з γδTCR + Нормальні PBMC Зв'язуЗв'язуПровання вання ліфераз з FcγR ція αβTCR PBMC + + + + Виснаження Експресія CD25 + + Антиген-активовані Т-клітини ВиІнгіАпоптоз/AICD вільнен- бування ня цитокіну MLR + + Н.в. + + Інгібування IVE + + + + + + + + Н.в. Н.в. + + Н.в. Н.в. + + + + + + + + + + + + + Приклад 3 Конструювання гуманізованих антитіл з поліпшеним зв'язуванням Отримували дві серії гуманізованих варіантів BMA031 під назвами HEBE1 серія (IGH3-23) та GL1BM серія (IGHV1-3*01 і IGKV3-11*01; див., VBase, vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk). Початкове пересадження CDR областей важкого ланцюга BMA031 на каркасні області IGH3-23 (див., SEQ ID NO: 5 та 6) поліпшило зв'язування антитіла з αβTCR, як показано за допомогою конкурентного тесту (фіг. 3); див., приклад 2. Однак, це поліпшення не перетворювалося у функціональне поліпшення антитіла, як показано в тесті IVE (фіг. 4). Приклад 4 Оптимізація гуманізованих антитіл Стратегія оптимізації гуманізованих антитіл була заснована на мутагенезі та функціональному скринінгі. Оптимізацію розпочинали зі змін блоків амінокислотних залишків в одній з кожних чотирьох каркасних областей варіабельних доменів з миші до людини. Ключові каркасні області ідентифікували в кожній з GL1BM HC, GL1BM LC та HEBE1 HC серій. Після цієї ідентифікації індивідуальні залишки в цих каркасних областях піддавали мутації у залишки зародкової лінії людини з вихідної послідовності миші. Каркасні залишки, для яких ідентичність з послідовністю миші була виявлена важливою для збереження зв'язуючих властивостей антитіла, були збережені, як мишачі залишки. В інших випадках каркасні залишки змінювали для відповідності амінокислотній послідовності зародковій лінії людини. Продовжували впродовж послідовності, доки не ідентифікували мінімальну кількість мишачих залишків для збереження вихідних зв'язуючих властивостей антитіла. Див. фіг. 5. Будо продемонстровано, що декілька антитіл з цих серій мають поліпшене зв'язування порівняно з BMA031, як визначено за швидкістю дисоціації антитіла з T-клітинами (фіг. 6, 7 та 8). 5 Для тестів швидкості дисоціації інкубували 10 T-клітин людини протягом 30-60 хвилин при кімнатній температурі в 100 мкл повного ростового середовища, яке містило 2 мкг/мл антитіл, експресованих як HuIgG1-Δab. Ці клітини потім промивали, повторно суспендували в 50 мкл повного ростового середовища та додавали 20 мкг/мл HEBE1 F(ab')2 для попередження повторного зв'язування дисоційованих кандидатних антитіл. В кінці періоду проведення цього тесту клітини фіксували та вимірювали рівень зилишившихся антитіл HuIgG1-Δab, зв'язаних з клітинною поверхнею, методом проточної цитометрії за допомогою міченого PE вторинного антитіла кози до HuIgG. Також було продемонстровано, що антитіла були активні у попередженні імунної відповіді в IVE (фіг. 9, 10 та 11) та MLR-тесті. В IVE-тесті використовували зв'язування з тетраметром у якості кількісної міри для IVE. Відсоток клітин, які були антиген-специфічними, визначали за забарвленням Т-клітин безпосередньо міченим тетраметром, який був специфічним до навчального пептида. Коротко, CD8+T-клітини 7 доби з IVE красили тетраметром за стандартними протоколами викрашування при проточній цитометрії та аналізували на FACSCalibur, BD. Окрім того, гуманізовані антитіла демонстрували порівняні рівні 16 UA 115533 C2 5 10 15 20 проліферативного потенціалу на PBMC та вивільнення цитокінів у порівнянні з BMA031 (фіг. 12 та 13). Антитіла також демонстрували здатність інгібувати вивільнення IFNγ з T-клітин у IVE-тесті (фіг. 14). До того ж, було показано, що низка цих антитіл має поліпшену здатність викликати індуковану активацією клітинну загибель (AICD) активованих αβTCR-позитивних T-клітин порівняно з BMA031 (фіг. 15). В тесті AICD антиген-специфічні CD8+T-клітини культивували з терапевтичним антитілом. Через 24 години, 48 годин та 72 години клітини красили щодо маркерів апоптозу анексін-V та 7-AAD. Клітини також красили тетраметром, щоб простежити апоптоз з ефектами на антиген-специфічні Т-клітини. Таким чином, було досягнуто значне поліпшення у порівнянні з попередніми спробами гуманізувати BMA031. Розробка антитіл з поліпшеною швидкістю дисоціації порівняно з BMA031 є несподіваним результатом в цьому способі. Поліпшення в зв'язуванні корелює з поліпшенням в ефективності супресії імунної відповіді, як показано в IVE-тесті (фіг. 10 та 11). Специфічність антитіл до αβTCR, знижена внаслідок гуманізації імуногенність, специфічний апоптоз активованих T-клітин і відсутність активації T-клітин при зв'язуванні з антитілом робить ці антитіла відмінними кандидатами для терапевтичних цілей. Приклад 5 Отримання Fc мутантів зі зниженою ефекторною функцією. Було розроблені та отримані сконструйовані Fc варіанти, у яких сайт глікозилювання введено в положенні Ser 298 амінокислотної послідовності після сайту Asn297, що зустрічається в природі. Глікозилювання в Asn297 або підтримували, або нокатували мутаціями. Мутації та результати глікозилювання викладені в таблиці 2. Таблиця 2 Мутація # 1 N297Q 2 T299A 3 4 5 25 30 35 40 N297Q/S298N/Y300S (NSY) S298N/T299A/Y300S (STY) S298N/Y300S (SY) Результат, що прогнозується Перевага, що очікується Немає глікозилювання Контроль agly Немає глікозилювання Контроль agly, невідома ефекторна функція Знижена ефекторна функція Немає глікозилювання в положенні 297, однак, сконструйований сайт глікозилювання в положенні 298 Немає глікозилювання в положенні 297, однак, сконструйований сайт глікозилювання в положенні 298 Два потенційних сайта глікозилювання в положенні 297 та 298; Подвійне глікозилювання. Змішане глікозилювання. Знижена ефекторна функція Позитивний контроль за зниженою ефекторною функцією Мутації отримували на важкому ланцюзі клону № 66 антитіла до αβ рецептора Т-клітини із застосуванням матриці Quikchange pENTR_LIC_IgG1. Домен VH HEBE1 Δab IgG1 № 66 ампліфікували з праймерами LIC та клонували в pENTR_LIC_IgG1 мутантного або дикого типу за допомогою LIC з утворенням мутантів або дикого типу Ab повної довжини. Субклонування перевіряли за допомогою подвійного розщеплення DraIII/XhoI, внаслідок чого в успішних клонах утворюється вставка ~1250 по. Потім такі мутанти повної довжини клонували у вектор експресії, pCEP4(-E+I)Dest, за допомогою системи клонування Gateway. Потім мутації підтверджували секвенуванням ДНК. Два конструкти, HEBE1 Agly IgG4 та HEBE1 Δab IgG1 в pCEP4, використовували як контролі при трансфекції HEK293. Мутанти, wt та контролі (Agly та Δab) трансфекували в клітини HEK293-EBNA в потрійній колбі для експресії. Білки очищували з 160 мл кондиціонованого середовища (CM) в 1 мл колонках HiTrap з білком А (GE) на багатоканальному перистальтичному насосі. П'ять мікрограмів кожного супернатанта аналізували у 4-20 % Tris-гліцин SDS-PAGE у відновлювальних та невідновлювальних умовах (дивись фіг. 16). Важкий ланцюг неглікозованих мутантів (N297Q, T299A та Agly контроль) нижче (чорна стрілка), у відповідності з втратою 17 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гліканів цього антитіла. Незважаючи на це, важкі ланцюги сконструйованих глікозильованих антитіл (NSY, STY, SY, Δab та wt контроль, червоні стрілки) мігрують так само, як і контроль дикого типу. Цей результат знаходиться узгоджується з очікуваним виходом сконструйованого сайта глікозилювання в 298 положеннях. Аналіз SEC-HPLC показав, що всі мутанти експресувалися як мономери. Аналіз глікозилювання за допомогою LC-MS. Сконструйовані Fc варіанти H66 IgG1 частково були відновлювали за допомогою 20 мМ DTT при 37 °C протягом 30 хв. Зразки аналізували капілярним LC/MS в системі капілярної HPLC Agilent 1100, поєднаною з гібридною системою qq TOF QSTAR (Applied Biosystem). Для аналізу даних використовували білкову реконструкцію Байєса з поправкою базової лінії та комп'ютерним моделюванням в Analyst QS 1.1 (Applied Biosystem). Для основного антитіла мутанта S298N/T299A/Y300S H66 спостерігали один сайт глікозилювання в положенні 298 амінокислоти з біантенарними та триантенарними гліканами комплексного типу, виявленими як основні види, а також з G0F, G1F та G2F. Зв'язування мутантів антитіл до αβTCR з FcγRIIIa та FcγRI людини з застосуванням Biacore Biacore використовували для оцінювання зв'язування з рекомбінантним FcγRIIIa (V158 & F158) та FcγRI людини. Всі 4 проточні комірки CM5 чипу іммобілізували з антитілом до HPC4 шляхом стандартної процедури зв'язування аміну, викладеної Biacore. Антитіло до HPC4 розводили до 50 мкг/мл в 10 мМ ацетаті натрію з pH 5,0 для реакції зв'язування та вводили протягом 25 хв при 5 мкл/хв. Близько 12000 RU антитіла іммобілізували на поверхні чипу. Рекомбінантні FcγRIIIa-V158 та FcγRIIIa-F158 людини розводили до 0,6 мкг/мл в зв'язуючому буфері, HBS-P з 1 мМ CaCl2, та вводили в проточні комірки 2 та 4, відповідно, на 3 хв при 5 мкл/хв для захоплення 300–400 RU рецептора на чип до HPC4. Для відмеження слабких зв'язуючих елементів захоплювали втричі більше rhFcγRIIIa поверхнею до HPC4, ніж зазвичай в цьому тесті. Проточні комірки 1 та 3 використовували як референс-контролі. Кожне антитіло розводили до 200 нМ в зв'язуючому буфері та вводили у всі 4 проточні комірки на 4 хв з наступною 5 хв дисоціацією в буфері. Поверхні регенерували з 10 мМ EDTA в HBS-EP буфері протягом 3 хв при 20 мкл/хв. Результати представлені на фігурі 17. Biacore також використовували для порівняння зв'язування з FcγRI. Антитіло до тетра-His піддавали буферному обміну в 10 мМ ацетаті натрію з pH 4,0 з застосуванням колонки Zeba Desalting та розводили до 25 мкг/мл в ацетатному буфері для зв'язування аміну. Дві проточні комірки CM5 чипу імобілізували з ~9000 RU антитіла до тетра-His після 20 хв введення при 5 мкл/хв. Подібно до попереднього експерименту для порівняння слабких зв'язуючих елементів захоплювали в десять разів більше FcγRI поверхнею до тетра-His. Рекомбінантний FcγRI людини розводили до 10 мкг/мл в HBS-EP зв'язуючому буфері та вводили в проточну комірку 2 на 1 хв при 5 мкл/хв для захоплення ~1000 RU рецептора чипом до тетра-His. Одноразову концентрацію антитіла, 100 нМ, вводили на 3 хв при 30 мкл/хв на захоплений рецептор та контрольну поверхню. Дисоціацію відстежували протягом 3 хв. Поверхню регенерували 30 сек. ін'єкціями 10 мМ гліцину при pH 2,5 при 20 мкл/хв. Результати представлені на фігурі 18. Результат дозволяє зробити висновок про дуже мале зв'язування глікосконструйованих мутантів з FcγRIIIa або FcγRI. Зокрема, H66 S298N/T299A/Y300S майже повністю не мав зв'язування з обома рецепторами. Цей мутант вибирали як основний для детального характеризування. Характеризування стабільності за допомогою циркулярного дихроїзму (CD). Стабільність мутанта антитіла S298N/T299A/Y300S відстежували шляхом Far-UV експерименту термоплавління з CD, в якому CD-сигнал при 216 нм та 222 нм відстежували при збільшенні температури, що в результаті призводить до розгортання антитіла. Спектри CD отримували на спектрофотометрі Jasco 815 при концентрації білка приблизно 0,5 мг/мл в PBS буфері в кварцевій кюветі (Hellma, Inc) з шириною шару 10 мм. Температуру контролювали термоелектричною приладом з елементом Пельтьє (модель Jasco AWC100) та змінювали зі швидкістю 1°C/хв з 25 до 89°C. Отримували показники CD сигналу та HT напруження. Дані отримували з 210-260 нм з інтервалами між даними 0,5 нм та з температурними інтервалами 1°C. Швидкість сканування складала 50 нм/хв. з шагом даних 0,5 нм. Використовували діапазон 2,5 нм з середніми параметрами чутливості. Для кожного зразка виконували сканування у 4 повторах. Результат дозволяє зробити висновок, що як дельта AB H66 так і S298N/T299A/Y300S H66 мутанти демонструють подібну температурну поведінку та мають однакову температуру початку деструкції, яка складає близько 63˚C. Іншими словами, мутант є таким же стабільним, як і формат дельта AB. 18 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Дивись фігуру 18. Приклад 6 Функціональний аналіз Fc-сконструйованих мутантів Тести проліферації PBMC та вивільнення цитокінів виконували, як викладено в прикладі 2. PBMC нормального донора розморожували та обробляли при наступних умовах (все в середовищі, яке містило комплемент): - Необроблені, - BMA031, moIgG2b 10 мкг/мл, - OKT3, moIgG2a 10 мкг/мл, - H66, huIgG1 дельта AB 10 мкг/мл, 1 мкг/мл та 0,1 мкг/мл, - H66, huIgG1 S298N/T299A/Y300S 10 мкг/мл, 1 мкг/мл та 0,1 мкг/мл. Цитокіни збирали на день 2 (D2) та день 4 (D4) для аналізу Bioplex (IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, GM-CSF, IFNg, TNFa). Клітини красили на D4 щодо експресії CD4, CD8, CD25 та abTCR. Результати, представлені на фігурах 19-22, показують, що H66 S298N/T299A/Y300S поводився подібно до H66 дельта AB в усіх тестах на клітинах, демонструючи мінімальну активацію Т-клітин експресією CD25; зв'язування з abTCR, хоча і з трохи відмінною кінетикою до дельта AB; мінімальне вивільнення цитокіну як в D2 так і в D4; фактично мутант перевершував дельта AB на D4 у відношенні декількох цитокінів. Таким чином, у мутанта S298N/T299A/Y300S була відсутня ефекторна функція так само ефективно, як і при мутації дельта AB. Приклад 7 Біспецифічні антитіла Сконструювали біспецифічні молекули, які складалися з двох одноланцюгових антитіл (scFv), поєднаних разом за допомогою короткого амінокислотного лінкера, де одне плече було здатне до зв'язування з мішенню-пухлиною, а інше здатна до зв'язування з Т-клітинами за допомогою αβ TCR. В цьому документі біспецифічну молекулу називають TRACER (T cell Receptor Activated Cytotoxic EnableR). Отримували наступні гуманізовані scFv конструкти до αβTCR: GL1BMΔSxVK1, GL1BMΔSxVK27, GL1BMΔSVH11xVK1, GL1BMΔSVH15xVK1, GL1BMΔSVH28xVK43, GL1BMΔSVH31xVK43. Послідовності важкого та легкого ланцюгів викладені в SEQ ID no 14-16 та 20-24. Характеризування цих молекул включало оцінку зв'язування до мішені-пухлини та T-клітин, цитотоксичну активність in vitro та профіль вивільнення цитокінів в присутності та відсутності клітин-мішеней пухлини. З профілю зв'язування, отриманого за допомогою проточної цитометрії, видно, що біспецифічні антитіла до αβ TCR здатні зв'язуватися як з лінією пухлинних клітин-мішеней, так і з Т-клітинами. Дивись фігуру 23. З цитотоксичної активності іn vitro, виміряної за допомогою проточної цитометрії, видно, що Т-клітини, рекрутовані за допомогою біспецифічного антитіла до αβ TCR, здатні індукувати опосередкований Т-клітинами лізис. Дивись фігуру 24. Аналіз профілю вивільнення цитокінів показав, що при зв'язуванні обох плечей біспецифічного антитіла має місце високий рівень вивільнення цитокінів TH1/TH2 з T-клітин, що не помічено у відсутності клітин-мішеней. У сукупності цей механізм дії характеризується подібним профілем з біспецифічними конструктами до CD3, описаними в літературі. Приклад 8: Отримання та характеризування сконструйованого Fc варіанта антитіла до CD52. Для тестування універсальності застосування мутацій Fc, описаних в цьому документі, також отримували мутант за глікозилюванням S298N/Y300S в антитілі до CD52 (клон 2C3), щоб продемонструвати чи поширюється модуляція ефекторної функції з втратою зв'язування з FcγRIII на інший остов антитіла. ДНК варіанта S298N/Y300S 2C3 отримували шляхом швидкозмінного мутагенезу. Білок очищували з кондиціонованого середовища після тимчасової трансфекції HEK293. Паралельно в якості контролю отримували 2C3 антитіло дикого типу до CD52. Biacore застосовували для характеризування антиген-зв'язуючих, FcγRIII, та зв'язуючих властивостей очищених антитіл (дивись фігуру 26). 19 UA 115533 C2 5 10 Варіант S298N/Y300S 2C3 міцно зв'язується з пептидом CD52, а сенсограма зв'язування не відрізняється від контролю дикого типу, що дозволяє зробити висновок, що домен Fc не впливає на його зв'язування з антигеном (фігура 26A). Для тестування ефекторної функції Fc в дослідженнях щодо зв'язування використовували рецептор FcγRIII (Val158). Мутантне антитіло та контрольне антитіло дикого типу розводили до 200 нМ та вводили до FcγRIIIa, захопленого HPC4-міткою. Зв'язування FcγRIII є майже таким, що не виявляється, для мутанта S298N/Y300S, що вказує на втрату ефекторної функції цим варіантом (фігура 26B). Мутант також зв'язується з рецептором FcRn з такою ж самою афінністю, як контрольне антитіло дикого типу, таким чином, не очікується зміна в його періоді напіввиведення з кровотоку або інших фармакокінетичних властивостях (дивись фігуру 26C). Можна зробити висновок, що мутація S298N/Y300S можна поширити для антитіла в цілому для зменшення або усунення небажаної ефекторної функції Fc, наприклад, шляхом залучення рецепторів Fcγ людини. 15 20 UA 115533 C2 21 UA 115533 C2 22 UA 115533 C2 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 1. Гуманізоване моноклональне антитіло, специфічне до комплексу TCR/CD3 людини, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей, представлених в SEQ ID NO: 7, 12, 13, 15 і 16, та 23 UA 115533 C2 5 10 15 20 25 30 варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 14. 2. Гуманізоване моноклональне антитіло за п. 1, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12 і SEQ ID NO: 13. 3. Гуманізоване моноклональне антитіло за п. 1, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 15 і SEQ ID NO: 16. 4. Гуманізоване моноклональне антитіло за п. 1, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 15. 5. Гуманізоване моноклональне антитіло за п. 1, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 16. 6. Гуманізоване антитіло за будь-яким одним з попередніх пунктів, яке додатково містить константну ділянку людського походження. 7. Гуманізоване антитіло за п. 6, яке додатково містить модифікацію Fc, що знижує зв’язування з Fcγ-рецептором. 8. Гуманізоване антитіло за п. 7, яке містить неглікозиловану область Fc або модифікацію дельта ab. 9. Гуманізоване антитіло за п. 7, яке містить модифікований профіль глікозилування. 10. Нуклеїнова кислота, яка кодує щонайменше варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга гуманізованого моноклонального антитіла за будь-яким із пп. 1-9. 11. Клітина, яка експресує нуклеїнову кислоту за п. 10. 12. Гуманізоване антитіло за будь-яким із пп. 1-9 для застосування при супресії опосередкованої Т-клітинами відповіді у пацієнта. 13. Гуманізоване антитіло для застосування за п. 12, де опосередкована Т-клітинами відповідь залучена до стану, вибраного з групи, що складається з трансплантації тканини, розсіяного склерозу та діабету 1 типу. 14. Гуманізоване антитіло для застосування за п. 13, в якому трансплантацію тканини вибирають з групи, яка складається з трансплантації цілого органа, трансплантації складної тканини та трансплантації тканинного клаптя. 24 UA 115533 C2 25 UA 115533 C2 26 UA 115533 C2 27 UA 115533 C2 28