Лікарський препарат імунокоригуючої дії на основі клітинної суспензії, спосіб лікування цукрового діабету з використанням цього препарату

1. Лекарственный препарат иммунокоррегирующего действия на основе клеточной суспензии, приготовленной из нативных или криоконсервированных гемопоэтических клеток эмбриональной печени и/или селезенки, о т л и ч а ю щийся тем, что количество ядросодержащих клеток в такой суспензии составляет от 5 до 90 • 106/мл, количество колониеобразующих единиц грануломоноцитарного ряда от 20 до 80 • 103/мл, количество колониеобразующих единиц блас3 тов - от 0,5 до 9 • 10 /мл, количество ранних предшественников гемопоэза - от \ 6 до 9«10 /мл. 2. Лекарственный препарат по п.1, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что при использовании упомянутых криоконсервированных клеток он дополнительно содержит диметилсульфоксид в количество от 3 до 10 мас.%. 3. Способ лечения сахарного диабета, заключающийся в парентеральном введении биологического материала иммунокоррегирующего действия, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве материала иммунокоррегирующего действия использован лекарственный препарат по любому из предшествующих пунк-' тов. 4. Способ по п.З, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что означенный препарат вводят в дозе от 0,5 до 5 мл. 5. Способ по п.4, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что означенный препарат вводят до или после терапии цитостатическими препаратами. 6. Способ по любому из пп.3-5, о тличающийся тем, что лекарственный препарат выбирают из сформированного в виде доз тканевого банка различных образцов с учетом индивидуальных показателей больного. 7. Способ по п.6, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что при повторном введении используют дозу препарата того же образца. Изобретение относится к области медицины, в частности - к клеточной терапии и может найти применение для лечения заболеваний, обусловленных нарушением иммунитета, например, сахарного диабета. За последние годы в области исследований применения трупных человеческих эмбриональных тканей произошел разительный прогресс. Разрабатывается целый новый раздел терапии - клеточная о 00 о 27048 терапия, которая позволяет с помощью лекарственных препаратов на основе клеточных суспензий, приготовленных из тканей эмбриона, восполнить недостаточную функциональную активность поврежденных, больных тканей. Клеточная трансплантация является привлекательной альтернативой для пересадки органов и тканей, так как преимущество эмбриональных клеток состоит в том, что они не сформировали жесткие индивидуальные признаки антигенной гистосовместимости, они легко приживляются и не вызывают реакции траснплантат против хозяина. Кроме того, клетки обладают мощным жизненным потенциалом. Они пролиферируют, дифференцируются, являются источником огромного количества биологически активных веществ, В настоящее время используют клеточные суспензии, приготовленные из эмбрионального мозга, костного мозга, печени, селезенки, тимуса, поджелудочной железы, кожномышечного лоскута. Первые наиболее успешные попытки использования клеточных суспензий в качестве лекарственных препаратов были связаны с эмбриональной печенью и селезенкой человека. Известно, что в печени или селезенке эмбриона человека в возрасте от 5 до 16 недель осуществляется кроветворение с высоким содержанием стволовых клеток. В данные сроки развития клетки эмбриональной печени и селезенки лишь в незначительной степени экспрессируют антигены первого и второго класса тканевой гистосовместимости. В 1973 г. впервые был создан лекарственный препарат на основе клеточной суспензии нативных клеток печени эмбриона 7 недельной гестации и за счет его введения был восстановлен гемопоэз больной апластической анемией (Kelemen Е. Second J.Gematol., 1973, v.10, № 4, рр.305-308). За последние годы, варьируя различными методами приготовления клеточных суспензий, а также различными методиками их применения, исследователям удалось достичь положительных результатов при лечении первичных и вторичных миелодепрессивных состояний. Эти препараты, в частности, описаны в Izzi Т., Potehi О. et al, Fetal liver transplantation, Alan R Liss, 1985, pp.237-249. Вторым направлением клинического примепненуїя означенных клеточных суспензий явились нарушения иммунитета, здесь наиболее значительный опыт при 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 надлежит Touraine J.I. (Transplantation Proceedings, 1993, vol.25, № 1, pp. 10121013). В прекрасной работе Baechelta R. etal. (I.CIin.lnvest, 1993, v.91, March, 10671078) показаны отдаленные результаты лечения больных с тяжелым комбинированным иммунным дефицитом, когда не только восстанавливались показатели иммунитета у этих больных, но показано наличиє расщепленного химеризма и появление толерантности к антигенам как хозяина, так и донора. У авторов также имеется свой опыт лечения иммунных нарушений при заболеваниях крови с использованием клеточных суспензий. Однако использование этих препаратов для лечения, в частности, сахарного диабета авторам не известно. Как известно, механизм развития инсулинзависимого сахарного диабета включает в себя аутоиммунное поражение островков Лангерганса клеточными и циркулирующими антителами. Поэтому в последующем при лечении инсулинзависимого сахарного диабета используются препараты, вещества, ткани, направленные на прерывание аутоиммунного поражения р-клеток поджелудочной железы по типу иммунокоррекции. С этой целью применялись изопринозин, азатиоприн, циклоспорин, а также препараты на основе биологических материалов, в частности, препараты вилочковой железы. Так, известен препарат, полученный из вилочковой железы, тималин, выделенный из тимуса телят, и его применение как иммунокорректора при лечении сахарного диабета (Курбанов Т.Г., Капьбиева Б.М., Закиева Г.Т. Проблемы эндокринологии, 1989, т. 35, № 6, с.7-9). Однако недостатком известного метода лечения является то, что суточная потребность инсулина уменьшается всего на 15-20%. Снижение уровня гликемии удерживается только в течение 5-6 мес. Кроме того, тималин часто не дает полного восстановления иммунологических показателей, а увеличивает их селективно на определенный процент без достижения нормального уровня. В основу изобретения поставлена задача создать такой лекарственный препарат иммунокоррегирующего действия на основе клеточной суспензии в котором, благодаря оптимальному подбору показателей клеточного состава удалось бы усилить механизм иммунокоррекции и достичь положительных результатов при лечении сахарного диабета. 27048 Поставленная задача решается тем, что в лекарственном препарате иммунокоррегирующего действия на основе клеточной суспензии, приготовленной из нативных или криоконсервированных 5 гемопоэтических клеток печени и/или селезенки эмбриона человека, согласно изобретению, количество ядросодержащих клеток в означенной суспензии составляет от 5 до 90 • 106/мл, количество коло- 10 ниеобразующих единиц грануяомоноцитарного ряда - от 20 до 80-10 3 /мл, количество колониеобразующих единиц бластов - от 0,5 до 9*10 3 /мл и количество ранних предшественников гемопоэза - от 15 1 до 9-10 6 /мл. Эмпирически было установлено, что выбор именно таких показателей клеточного состава и их количественные соотношения позволяют достичь положитель- 20 ных результатов лечения сахарного диабета, а именно: перехода основного заболевания в стадию ремиссии. Авторы полагают, что именно такой состав заявленного лекарственного пре- 25 парата позволяет наиболее эффективно влиять на механизм и ммуно коррекции, в частности, останавливать агрессию Т-лимфоцитов и иммуноглобулинов против {}клеток. Кроме того, лекарственный пре- 30 парат заявляемого состава, являясь источником биологически активных веществ, вызывает мощное трофическое действие, проявляющееся в увеличении количества функционирующих капилляров, нормали- 35 зации проницаемости, миграции клеток, их дифференцировки, что, в конечном итоге, определяет завершенность воспалительного процесса и уменьшение явления дистрофии. 40 Согласно изобретению, целесообразно чтобы при криоконсервировании лекарственный препарат дополнительно содержал диметилсульфоксид в количестве • от 3 до 10%. Выбор нижнего предела 45 обусловлен наибольшей сохранностью клеток, а верхнего - исходя из токсического действия препарата. Поставленная задача решается также и тем, что в способе лечения сахарного 50 диабета, заключающемся в введении биологического материала иммунокоррегирующего действия, согласно изобретению, в качестве биологического материала иммунокоррегирующего действия используют 55 патентуемый лекарственный препарат. Авторы считают, что лекарственные препараты на основе клеточной суспензии ранее никогда не использовались для лечения сахарного диабета. Однако дли тельная исследовательская работа по изучению механизмов воздействия препаратов на основе клеточных суспензий на процессы лечения различных заболеваний позволяет утверждать, что клеточные суспензии заявляемого состава весьма успешно могут быть использованы для лечения сахарного диабета. Об этом свидетельствуют всевозможные клинические испытания, проведенные авторами, некоторые из которых подробно описаны в нижеприведенных примерах. У больных наблюдали значительное улучшение показателей иммунного статуса, вплоть до восстановления на 3-11 сут (увеличение количества Т-лимфоцитов, изменение соотношения субпопуляций, нормализация показателей гуморального иммунитета). Была снижена исходная доза вводимого инсулина на 4 0 - 7 0 % . На протяжении 3-4 нед достигалась ремиссия заболевания. В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, целесообразно патентуемый лекарственный препарат вводить в дозе от 0,5 до 5 мл. Кроме того, желательно, чтобы этот препарат был введен до и/или после те-, pan и и цитостатическими препаратами. Лекарственный препарат целесообразно выбирать из сформированного тканевого банка различных образцов с учетом индивидуальных показателей больного, причем при повторном введении использовать препарат того же образца. Предлагаемый способ лечения сахарного диабета позволяет введением патентуемой клеточной суспензии коррегировать различные нарушения, определяющие течение сахарного диабета, в частности, инсулинрезистентности, развитии макро- и микроангиопатий, поражений почек, печени, развитии анемического синдрома, тромбоцитопении и т.д., восстанавливая утраченные функции кроветворения и иммунной системы, Далее сущность изобретения станет более понятной из приведенного ниже подробного описания его осуществления, изложенного в конкретных примерах его реализации. Лекарственный препарат заявляемого состава можно изготовить, используя следующую методику. Эмбрионы получают при искусственном прерывании беременности у здоровых, предварительно обследованных на наличие вирусных и гемических инфекций женщин. Используя эмбрионы сроком от 5-8 нед гестации. В целях сохранения 27048 целостности эмбриона аборт проводят вакуумэкстракцией. Эмбрион переносят в стерильный сосуд с раствором Хэнкса и антибиотика (группа аминогликозидов). Дальнейшая работа проводится в стерильных условиях бокса. Эмбрионы переносятся в стерильные чашки Петри, заполненные раствором Хэнкса с антибиотиком, где, осторожно вскрыв брюшную полость, извлекают печень, селезенку, из которых отдельно приготовляют клеточные суспензии. Кроветворные органы помещают в гомогенизаторы, разрезают на небольшие фрагменты и измельчают до получения однородной массы. Клетки смывают со стенок и пестика гомогенизатора раствором Хэнкса в мерные пробирки, пропуская через фильтр для переливания крови, а затем через иглы уменьшающегося диаметра. Часть приготовленной суспензии переносят в полиэтиленовый контейнер и герметично закрывают. Она будет использована для трансплантации нативной клеточной суспензии. Другая часть подлежит криоконсервации. В качестве криопротектора используют диметилсульфоксид (ДМСО, химически чистый). Перед использованием ДМСО пропускают через миллипоровый фильтр (с диаметром пор 0,22 мкм). При легком перемешивании клеточной суспензии добавляют по каплям равный объем рабочего раствора ДМСО, достигая концентрации в предпочтительном варианте 5%. Клеточные суспензии разливают в полиэтиленовые контейнеры в зависимости от дальнейших целей объемом от 0,5 до 2 мл. Контейнеры помещают в камеру программного замораживателя, работающего на жидком азоте и замораживают до 196°С. Криоконсервированные суспензии хранятся в банке эмбриональных тканей в жидком азоте при температуре -t96°C. После приготовления клеточной суспензии определяют следующие показатели: 1-й - количество ядросодержащих клеток в 1 мл; 2-й - количество колониеобразующих единиц грануломоноцитарного ряда (КОЕ ГМ) в 1 мл; 3-й - количество колониеобразующих единиц бластов (КОЕ бл.) в 1 мл; 4-й - количество ранних предшественников гемопоэза (CD^) в 1 мл. И далее используются и хранятся в тканевом банке клеточные суспензии, следующих параметров: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8 1-й - от 5 до 90-10 6 /мл 2-й - от 20 до 80- 103/мл 3-й - от 0,5 до 9-103/мл 4-й - от 1 до 9*106/мл Пренатальная диагностика включает в себя исследования на наличие сифилиса, ВИЧ-инфекции, вирусного геппатита В и С, токсоплазмоза, цитомегаловирусной инфекции. Проводятся исследования содержимого контейнеров на бактериальную стерильность. Фетальная диагностика включает исследования на наличие ВИЧ-инфекции, вирусного геппатита В и С, цитомегаловируса, вируса краснухи, герпесами токсоплазмоза. В зависимости от варианта клинического лечения лекарственный препарат вводят одним из следующих методов: - введение (трансплантация) части нативных гемопоэтических клеток, в дальнейшем введение криоконсервированных клеток, хранящихся в банке данного образца; - введение всего нативного образца; - введение части или всего криоконсервированного материала данного образца. До и в ряде случае после введения патентуемого лекарственного препарата проводят лечение одним или комбинацией цитостатических препаратов с целью уменьшения иммунологической реактивности реципиента, уменьшения аутоиммунной агрессии. Эффект лечения оценивают по: - уровню снижения гликемии, уменьшению дозы вводимого инсулина, возникновению гипогликемических состояний; - изменение показателей иммунного статуса (содержание в крови Т-В-лимфоцитов, иммуноглобулинов); - количеству эритроцитов периферической крови, содержащих фетальный гемоглобин; - наличию клеток, содержащих Y-xpoмосому, определяемых методом цепной реакции полимеризации с использованием олигонуклеотидных праймеров. Подробное описание использования патентуемого изобретения в имеющейся у авторов клинической практике представлено также в примерах 1-7. П р и м е р 1. Больная Д., 1946 г.р., поступила в диабетологическое отделение Украинского НИИ эндокринологии и обмена веществ 21.08.93 г. с жалобами на выраженную слабость, головокружение, одышку при незначительной физической нагрузке, сердцебиение, плохой ап 27048 петит, тошноты, кожный зуд, головную боль, отеки на ногах, снижение зрения. Из анамнеза известно, что 13 лет назад выявлен инсулинзависимыи сахарный диабет. Постоянно получала инсулинотерапию, наблюдалась эндокринологом, периодически лечилась в стационаре. В течение последних двух лет отмечает ухудшение состояния: появилась артериальная гипертензия, течение основного заболевания приобрело лабильный характер, в анализах мочи - постоянно протенурия. За последний год появилась слабость, периодически отечность нижних конечностей, диспептические явления, выявлено снижение уровня эритроцитов и гемоглобина периферической крови. В марте 1993 года лечилась в неврологическом отделении областной больницы, установлено наличие хронической почечной недостаточности, анемии средней степени тяжести. Произведено 4 трансфузии эритроцитарной массы. После временного улучшения состояние резко ухудшилось в сентябре 1993 года, что явилось поводом для госпитализации. При поступлении состояние больной тяжелое. Сознание ясное. Кожные покровы и видимые слизистые бледные. Периферические лимфатические узлы не увеличены. Пульс - 98 уд./мин, ритмичный, удовлетворительного наполнения и напряжения. Артериальное давление 190/120 мм рт.ст. Тоны сердца достаточной звучности, ритмичны, систолический шум на верхушке, акцент II тона на аорте. В легких прослушивается везикулярное дыхание. Живот мягкий, умеренно вздут, чувствителен на пальпации в области правого подреберья. Печень выступает из-под края правой реберной дуги по правой среднеключичной линии на 2 см. Селезенка не увеличена. Отрезки толстой кишки смазмированы. Стул - 4 раза в сутки, кашицеобразный. Суточный диурез до 1 л. Лицо, стопы, голени отечны. Установлен диагноз: сахарный диабет, тип I, тяжелая форма, в состоянии декомпенсации. Диабетическая универсальная ангиопатия (нефропатия III ст., ХПН I ст., сосудистая форма пролиферирующей ретинопатии* микро- и макроангиопатия сосудов нижних конечностей II ст.). Диабетическая полинейропатия нижних конечностей. Анемия тяжелой степени тяжести. Симптоматическая гипертензия. При поступлении гликемия - 12,4 ммоль/л, глюкозурия - 22 г/л, ацетонурия - (++), протеинурия - 3,3 г/л, эритро- и цилиндрурия (5 - в поле зрения), К+ - 5,2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 10 ммоль/л, мочевина - 14,42 ммоль/л, креатинин - 0,220 ммоль/л, эритроциты 2,1 • 1012/л, гемоглобин - 64 г/л. Назначено лечение: диетотерапия, инсулинотерапия - 22 ЕД/сут., дезинтоксикационная терапия (энтеросорбенты, гемодез, промывание кишечника), диуретики, гипотензивные, ангиагреганты, ангиопротекторы, коррекция электролитного баланса, препараты железа, витаминотерапия. Через три недели состояние больной несколько улучшилось: компенсирован углеводный обмен, сошли отеки, АД снизилось до 170/100 - 110 мм рт.ст. Однако сохранялся стойкий тяжелый анемический синдром. 15.09.93 г. произведена трансплантация нативных гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (образец 3038С-82Н): возраст эмбриона 5 недель, количество ядросодержащих клеток 25- 106/мл, объем введенной ткани. - 1 , 5 мл, КОЕ ГМ - 13,9-103/мл, КОЕ бл. 1,3-103/мл, CD34 - 2,4-106/мл. Способ введения - внутрикостный (внутригрудинный). Трансплантацию больная перенесла удовлетворительно. Через 8-10 ч наблюдался синдром раннего посттрансплантационного улучшения состояния: уменьшилась головная боль, слабость, тошнота, улучшился аппетит, больная впервые за последние несколько месяцев спокойно спала. На 3-й сут повысился уровень гемоглобина, эритроцитов и ретикулоцитов периферической крови с нормализацией к 10 дню (табл.1), постепенно в течение трех недель значительно улучшились анализы мочи (табл.2). Снизилось артериальное давление до 160/100-90 мм рт.ст, что позволило уменьшить дозу гипотензивных препаратов. П р и м е р 2. Больной П., 1960 года рождения, поступил в диабетологическое отделение Киевского НИИ эндокринологии и обмена веществ 6.11.91 г. с жалобами на общую слабость, похудание, сухость во рту, жажду, обильное мочеиспускание. Считает себя больным с сентября 1991 г., когда впервые появились подобные жалобы. Не обследовался. Резкое ухудшение состояния в ноябре 1991 г. заставило обратиться за медицинской помощью. Установлен диагноз: сахарный диабет, тип I, впервые выявленный, тяжелой формы, в состоянии декомпенсации, диабетический кетоацидоз. При поступлении уровень гликемии составлял 15 ммоль/л, глюкозурия - 41,6 11 27048 г/л, ацетонурия - (+++). Назначено лечение; инсулинотерапия - 60 ЕД в сутки, витаминотерапия, препараты калия. После достижения компенсации состояния 2.12.1991 г. произведена первая трансплантация нативных гемопоэтических клеток эмбриональной печени и селезенки человека (образец 3038C-63HL): возраст эмбриона 7 недель, объем введенных клеток - 1 мл, количество ядросодержащих клеток - 36,2'10 6 /мл, КОЕ ГМ - 23,6- 103/мл, КОЕ бл. - 2,5- 103/мл, CD34 - 1,4«106/мл. Способ введения внутривенный. Объем трансплантированных клеток от общей массы ткани данного образца, находящейся в банке криоконсервированных тканей, составил 66%. Трансплантацию больной перенес удовлетворительно. В первые сутки наблюдали синдром раннего посттрансплантационного улучшения общего состояния: уменьшение слабости, улучшение аппетита, больной стал бодрее, активнее. Через три недели после трансплантации появились гипогликемические состояния, что явилось причиной постепенного снижения суточной дозы вводимого инсулина, с максимальным снижением через 2,5 месяца (табл.3). Наблюдали нормализацию показателей имунного статуса уже на 11-е сутки (табл.4). В течение шести месяцев после первой трансплантации больной находился в компенсированном состоянии со стабильной относительно низкой суточной дозой вводимого инсулина. В конце мая 1992 г. состояние больного ухудшилось: появились признаки декомпенсации углеводного обмена, ухудшились показатели имунного статуса (табл.4). Суточную дозу вводимого инсулина увеличили до 32 ЕД. 3.06.92 г. произведена повторная трансплантация криоконсервированных гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека того же образца: № 303SC-63HL - введено 0,5 мл клеточной суспензии. Трансфузию больной перенес удовлетворительно. Положительная динамика суточной дозы вводимого инсулина, показателей имун' ного статуса приведена в табл.3, 4. Динамика изменений количества эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин, свидетельствует о заместительном эффекте трансплантированных клеток. П р и м е р 3. Больная Р., 1961 года рождения, поступила в 1-е терапевтическое отделение ЦРБ Зализнычного района г. Киева 1.12.92 г. с жалобами на выра 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 12 женную слабость, похудание, сухость во рту, жажду, обильное мочеиспускание, головную боль, плохой аппетит. Считает себя больной с октября 1992 года, когда почувствовала ухудшение состояния. Не обследовалась. Резкое ухудшение состояния в конце ноября 1992 года явилось поводом обращения за медицинской помощью. Установлен диагноз: сахарный диабет, тип \, впервые выявленный, тяжелой формы, в состоянии компенсации, диабетический кетоацидоз. При поступлении уровень гликемии составлял - 20,0 ммоль/л, глюкозурия - 52,4 г/л, ацетонурия - (+++). Назначено лечение: инсулинотерапия - 64 ЕД в сутки, витаминотерапия, препараты калия, гемодез 200,0 через день № 6. Больной назначен азатиоприн в суточной дозе 2 мг на 1 кг массы тела в два приема, начиная с 25 мг в сутки, постепенно увеличивая дозу под ежедневным контролем периферической крови. По достижению указанной терапевтической дозы лечение проводилось при еженедельном контроле количества лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов в периферической крови. Через 32 дня от начала лечения азатиоприном при достижении субкомпенсации нарушений углеводного обмена 5.1.93 г. произведена трансплантация криоконсервированных гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (образец 3038С-44Н); возраст эмбриона 6 недель, объем введенных клеток - 1 мл, количество ядросодержащих клеток - 17,5 • 106/ мл, КОЕ ГМ - 24,8-103/мл, КОЕ бл. 1,7 • 103/мл, CD^ - 2 • 106/мл, способ введения - внутривенный. Объем трансплантированных клеток от общей массы ткани данного образца, находящейся в банке криоконсервированных тканей, составил 45%. Трансплантацию больная перенесла удовлетворительно. В первые сутки наблюдали синдром раннего посттрансплантационного улучшения общего состояния: уменьшение слабости, головной боли, улучшение аппетита. Лечение азатиоприном продолжали в течение 48 дней после трансплантации гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека. Через 2 недели после трансплантации появились гипогликемические состояния, что явилось причиной постепенного снижения суточной дозы вводимого инсулина, с максимальным снижением через 2 мес. (табл.5). 13 27048 К концу второй недели нормализовались показатели имунного статуса больной (табл.6). Динамика изменений количества эритроцитов периферической крови, содержащих фетальный гемоглобин, свидетельствует о заместительном эффекте трансплантированных клеток. Ремиссия заболевания длится более 9 мес. Наблюдение продолжается. П р и м е р 4. Больная Л., 1991 года рождения, находилась в эндокринологическом отделении Детской специализированной клинической больницы № 14 г. Киева с 15.09.93 г. по 26.09.93 г. Диагноз: Инсулинзависимый сахарный диабет, тяжелая форма, лабильное течение, состояние субкомпенсации. Заболевание выявлено в феврале 1993 г., когда в предкоматозном состоянии ребенок был доставлен в реанимационное отделение. Установлен диагноз: сахарный диабет, тип I. Начата инсулинотерапия - 8 ЕД/ сутки. В последующие месяцы суточная доза инсулина снижена до 6 ЕД. Характер течения основного процесса был лабильным: частые гипогликемические состояния в чередовании с кетоацидозом. Девочка госпитализирована в эндокринологическое отделение для проведения трансплантации гемопоэтических эмбриональных клеток. При поступлении гликемия в течение суток от 5,5 до 12,4 ммоль/л, глюкозурия - 3,2 г/л, аценотурия - отсутствует. 12.09.93 г. произведена трансплантация криоконсервированных гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (образец 3038С - 91Н): возраст эмбриона - 5 недель, количество ядросодержащих клеток - 25,0* 106/мл, объем введенной ткани - 1,5 мл, КОЕ ГМ - 23,9-103/ ./мл, КОН бл. - 1,8- 103/мл, CD34 - 4-Ю 6 / /мл. Способ введения - внутривенный. Больная перенесла трансплантацию удовлетворительно. Со слов мамы у ребенка улучшился аппетит уже к вечеру после трансплантации, сон стал спокойным, глубоким. На четвертые сутки после трансплантации снизили суточную дозу вводимого инсулина до 5 ЕД. В дальнейшем суточная доза вводимого инсулина осталась такой же. В течение месяца нормализовались иммунологические показатели больной (табл.7). На протяжении всего времени после трансплантации состояние ребенка остает 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 14 ся удовлетворительным; стабилизировалось течение заболевания - гликемия в течение дня на уровне 4,5-7,3 ммоль/л, гипогликемии и эпизодов кетоацидоза не наблюдалось. Уменьшились повышенная раздражительность, плаксивость. Психофизически девочка развивается согласно возрасту. Наблюдение продолжается. П р и м е р 5. Больной А., 1969 года рождения, находился в терапевтическом отделении Центральной клинической больницы Зализнычного района г. Киева с 21.07.93 г. по 12.08.93 г. Диагноз: инсулинзависимый сахарный диабет, тяжелая форма, лабильное течение, состояние компенсации, диабетическая универсальная ангиопатия II ст., диабетическая периферическая полинейропатия: Хронический холецистит, фаза ремиссии. Считает себя больным с 1986 года, когда после сильного психоэмоционального перенапряжения начало ухудшаться самочувствие: слабость, полидипсия, полиурия, потеря в весе тела. Через 2 месяца, когда обратился за медицинской помощью, диагностирован инсулинзависимый сахарный диабет. Компенсация состояния, достигнута при суточной дозе вводимого инсулина 64 ЕД. В течение последнего года отмечает появление болей в ногах, преимущественно по ночам, чувство жжения, покалывание, иногда онемения, судороги в икроножных мышцах. Основное заболевание приобрело лабильный характер: частая смена удовлетворительного состояния кетоацидозом или гипогликемией при незначительных изменениях в приеме пищи, физических и эмоциональных нагрузках. Больной госпитализирован в терапевтическое отделение для проведения трансплантации гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека. При поступлении гликемия в течение суток от 4,7 до 11,4 ммоль/л, глюкозурия - 22,4 г/л, ацетонурия отсутствует. Суточная доза инсулина - 58 ЕД. 28.07.93 г. произведена трансплантация нативных гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (образец 3038-101Н): возраст эмбриона - 6 недель, количество ядросодерожащих клеток 8,5* 106/мл, объем введенной ткани 2,5 мл, КОЕ ГМ - 23- 103/мл, КОЕ бл. 2,4-103/мл, CD34 - 3,8«106/мл. Способ введения - внутривенный. Больной трансплантацию перенес удовлетворительно. Через 8-10 ч наблюдали появление синдрома первичного 15 27048 посттрансплантационного улучшения общего состояния: уменьшение слабости, повышение работоспособности, улучшение сна. В течение двух недель снижена доза вводимого инсулина до 50 ЕД в сутки. В общеклинических исследованиях существенных изменений не произошло (в пределах нормы до и после трансплантации). Восстановились показатели иммунологического статуса через 1 месяц (табл.8). Возрос уровень эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин, до 15%. Наблюдение продолжается больше 12 мес. Больной чувствует себя удовлетворительно: достигнута стойкая компенсация состояния, не было эпизодов кетоацидоза. Суточная доза вводимого инсулина сохраняется на уровне 50-52 ЕД. Эритроциты, содержащие фетальный гемоглобин, определяются в пределах 8-10%. П р и м е р 6. Больной М., 1931 года рождения, находился в хирургическом отделении Центральной клинической больницы Зализнычного района г.Киева с 12.04.93 г. по 26.05.93 г. Диагноз: Сахарный диабет, тип I, тяжелая форма состояние субкомпенсации, универсальная диабетическаая ангиопатия: микро- макроангиопатия сосудов нижних конечностей III ст., ретинопатия, нефропатия II ст., трофическая язва 1 пальца правой стопы, флегмона стопы. Диабетический полиневрит. При поступлении больной предъявлял жалобы на общую слабость, повышение температуры тела до 38,5°С, ознобы по утрам, отечность, ощущение распирания в правой стопе, изъязвление мягких тканей 1 пальца правой стопы, ощущение онемения, покалывания в ногах, боли в ногах, как в покое, так и при физической нагрузке. Страдает инсулинзависимым сахарным диабетом в течение 22 лет. В течение последних 5 лет появились жалобы на боли в ногах при ходьбе, успокаивающиеся в покое, а также чувство онемения, покалывания в ногах, преимущественно по ночам. Месяц назад в области 1 пальца правой стопы открылась язва мягких тканей. Больной лечился амбулаторно без результата. После очередной ванны резко отекла стопа, голень, усилилась боль, появилась выраженная гиперемия кожных покровов, повысилась температура тела до 38°С. Сразу после поступления вскрыта флегмона, произведена хирургическая обработка. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 16 Назначены антибиотикотерапия, противовоспалительные препараты, инсулинотерапия - 38 ЕД в сутки. Состояние больного не изменилось: продолжались подъемы температуры тела по вечерам до 38,6°С, сохранялась общая слабость, гнойные выделения из разреза и трофической язвы. Через трое суток у больного прослушивалась правосторонняя нижнедолевая пневмония. Произведены бактериологические посевы крови, мочи, кала. Из крови высеян Staphylococcus aureus. Больной получил 3 курса антибиотикотерапии в течение трех недель (ампиокс, гентамицин, рифампицин, клафорам). В анализе крови лейкоцитоз со сдвигом лейкоцитарной формулы влево, ускорение СОЭ, умеренная анемия (табл.9). В иммунограмме резко снижено количество Т-лимфоцитов, несколько повышено количество р-лимфоцитов (табл.10). f С целью усиления иммунной защиты 10.05.93 г. произведена трансплантация нативных гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (образец 3038С57Н): возраст эмбриона - 8 недель, количество ядросодержащих клеток - 37,5 • 106/ мл, объем введенной ткани - 2,5 мл, КОЕ ГМ - 42-10 3 /мл, КОЕ бл. - 1,3-103/мл, CD.^ - 1,4 • 107мл, способ введения - внутривенный. Через 8-10 ч после трансплантации наблюдали проявления синдрома первичного посттрансплантационного улучшения общего состояния: вечером снизилась температура тела до 37°С, уменьшилась слабость, появился аппетит, ночью спал спокойно. Постепенно в течение 7-10 дн. нормализовались показатели крови (табл.9). Началось очищение раны и язвы от гнойнонекротических масс. На седьмые сутки появились здоровые грануляции и началась эпителизация. Через две недели язва и рана зарубцевались. Наблюдали восстановление показателей иммунного статуса на 14-е сутки (табл.10). Из-за появления гипогликемии на пятые сутки суточную дозу инсулина снизили до 34 ЕД. Больной выписан домой в удовлетворительном состоянии. П р и м е р 7. Больная Б., 1957 года рождения, поступила в диабетологическое отделение.Киевского НИИ эндокринологии и обмена веществ 4.09.92 г. с жалобами на выраженную слабость, жажду, сухость во рту, обильное мочеиспускание, похудание, плохой аппетит, головные боли. ж 17 27048 Считает себя больной в течение последних трех месяцев, когда постепенно начало ухудшаться состояние. Не обследовалась и не лечилась. Резкое ухудшение состояния явилось поводом обращения за медицинской помощью. Установлен диагноз: сахарный диабет, тип I, впервые выявленный, тяжелая форма, состояние декомпенсации, диабетический кетоацидоз. При поступлении гликемия - 20,2 ммоль/л, глюкозурия - 51,2 г/л, ацетонурия - (++++). Назначено лечение: инсулинотерапил - 62 ЕД в сутки, витаминотерапия, препараты калия. После достижения субкомпенсации состояния произведена трансплантация нативных гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (образец 3038С20HL): возраст эмбриона - 7 недель, количество ядросодержащих клеток 25-10 6 /мл, объем введенной ткани - 1 3 мл, КОЕ ГМ - 19,3-10 /мл, КОЕ бл. 2,1-107мл, CD34 - 1,8'106/мл. Способ введения внутривенный. Объем трансплантированных клеток от общей массы ткани данного образца, находящейся в банке криоконсервированных культур, составил 50%. Трансплантацию больная перенесла удовлетворительно. В первые сутки наблюдали синдром раннего постртрансплантационного улучшения общего состояния; уменьшение слабости головных болей, улучшение аппетита, сна. С третьих суток после трансплантации в связи с появлением гипогликемии начали снижать дозу to 15 20 25 18 суточного инсулина с максимальным снижением через 2,5-3 месяца (табл.11). Положительная динамика иммунологических показателей больной Б. приведена в табл.12 Динамика изменений количества эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин, свидетельствует о заместительном эффекте трансплантированных клеток. Ремиссия заболевания длится больше двенадцати месяцев. Таким образом, предлагаемый лекарственный препарат и способ лечения сахарного диабета с целью использования препарата позволяют: - оборвать аутоиммунную агрессию против островков Лангерганса; - уменьшить дозу инсулина за счет снятия клеточной блокады с сохранившихся р-клеток; - уменьшить или снять лабильность течения; - уменьшить иммунорезистентность; - восстановить гемопоэз; - уменьшить такие осложнения сахарного диабета как инфекционные, микро- и макроангиопатии, нейропатии. Кроме того, клеточные суспензии 30 заявляемого состава могут храниться в аптеках-банках криоконсервированных тканей и, с учетом отсутствия необходимости определения антигенов гистосовместимости, предполагают при наличии показаний 35 более простое применение, чем, например, трансфузия крови. Т а б л и ц а 1 Динамика показателей периферической крови больной Д Дата Л» входя —ты, /шкфо п и ты. Моноцити, Тромво — акты \ \ % 1в*/л 1 67 25,5 6 186 35 0 2 1 04 29 4 254 42 11 — — _ __ — — 1 2 67 28 2 1 2 62 33 2 1 1 63 32 3 1в'/Л Ч \ 4,9 _ __ 0,5 7 5,7 _ _ .0,78 _ — 5,7 _ _ 120 0,9 14 5,0 4.0 120 0.9 14 7,5 4,1 124 0,9 15 5,3 Палочко ЭО1ИНО — Гсмогло — И12/л 13.00.03г. 2.11 75 і.ов 18.00.03г. 3.11 105 0,97 20.0O.O3r 3,14 82 25.00.03г. 4,0 28 00 03г. 10 10.03г. Ратюсулв Г/А вив, —ПИТЫ. ТЛЛ*. _ —. пнти.со — держащие фетальний гвкогло — вин.4 Свгмввго— ялврнио, Вазофялы, Цмтоіов поки* — Эритроциты фплы, ядерные. соэ % . 1 со _ — 13 Т а б л и ц а Динамика анализов мочи больной Д. до и после трансплантации Дат* 15 295 Относа— Коли Цвот чество, Прозрач Рвлкция тольная — ность СуточБалок. Сдхдр Лвйхо— Эритро Гиали акты плот— • циты новые Зернвс Васио — —ты* жндяые Ацетон РО ная протеи — агуркя BOCTV у.вд мл 2 г/л г/л В-пол* зрения О соло0.00.03г. 100,0 менно— 00 ггрозр. кнсл. 1014 0.0 0.0 в - 8 4 — 0 2 - 4 5 - 10 един. нот желтый 8.00 03г. J 10,5 г/л 18 00 ОЗг 100,0 с/ж прозр. 10.10.03r кисл. 1011 0,0 5 - 7 0 - 8 нот 2 - 4 Пот ПОТ • 170,0 с/ж прозр. f0 N3 кисл. 1018 1.05 8,3 2 - 3 ПОТ ПОТ ж 23 27048 24 Т а б л и ц а 3 Анализируемые показатели больного П. до и после трансплантации гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (состояние компенсации) 2.12.91 г. - 1-я трансплантация 3.06.92 г. - 2-я трансплантация Даті 1.12. Olr. 23.12. 01г. 23.01 02г. 7.05. 02г. 3.00. 02г. 0.07. 02г 17.07. 02г. 21.01. 03г. через ДО 17.01. 92г. через 2,5 * ч*рез 5 через 0 мее. мее. через 1 мее. через 1.5 мес через 7.5 мес. Суточная доза инсулина, НА трене— 21-е плоят. ПОХАЭЛПЛХ еуг. мее. 4В Зв 20 20 20 32 24 22 24 25 40 50 50 34 50 55 50 18 12 14 8 2 12 18 14 % снижения еуг. дозы инсулина к. исходному уровню Эритроциты» содержащие фетальний гемоглобин, % 0 27048 25 26 Т а б л и ц а Динамика иммунологических показателей больного П. 4 14.11.01г. 17.1201г. 7.04.02г. 28.05.02r. 14.00.02r. до трансп. И — е сут. чероз 4 мое. чороз 0 мое. 11 —о сут. поело 2— й транспл. Т—лимфоциты, 40 53 50 50 53 абс.*10в/л 0,7050 0.8004 1,0808 0,7050 0,8480 Т—хелперы. 37 20 41 37 33 абс/10в/л 0.5328 0,4872 0,7013 0,5883 0,5280 Т— супрессоры, 12 24 15 13 20 абс.*10в/л 0,1728 0,4032 . 0,2805 0.2007 0,3200 3,1 1.2 2,7 2.85 1.7 В—лимфоциты, 37 31 18 30 27 4бсЧ0 в /л 0,5328 0,5208 0.3474 0.4770 0.4320 IgG. г/л 8.75 0,70 17.8 10.7 ХдА. Г/л 7,0 2.1 1.75 1.0 4.25 IgM, г/л 0.43 1.3 0,80 0.80 1.01 Дата Показатели Т—хелперы/ супрессоры, л ' 11.8 . 27 27048 28 Т а б л и ц а 5 Анализируемые показатели больной Р. до и после трансплантации гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (состояние декомпенсации) Дата 4.01. 1003г. 0.01. 1003г. 10.01. 1003г. 4.02. 1003г. 5.03 1003г. Показатели трене — плаит. . 3-е сут. 14-е сут. через 1 мое. через 2 мес. Суточная доза инсулина, ЕД 52 44 •з* 26 10 _-. 15.4 42 50 70 0 14 17 АО % снижения сут. дозы инсулина к. исходному уровню Эритроциты, содержащие фатальный гемоглобин, % • 23 25 Т а б л и ц а 6 Динамика иммунологических показателей больного Р. Дата Показатели 4.01.03г. до трансплантации 10.01.03г. 14-е , сут. 5.03.03г, через 2 мое. Т—лимфоциты, % 12 50 42 абс.*10°/л 0,081» 1.0035 0.8004 Т—эселперы, % 10 38 28 абс.*10 в /л 0.0130 0,3220 0.2352 Т—супрессоры, % 2 18 14 абс.*10°/л 0.013* 0.3226 0,2352 Т-хелперы / т _ 5.0 2.1 2.0 В—лимфоциты. % 10 24 22 лбс.*10в/л 0,1088 0,4301 0.3000 IgG, г/л. 8.1 8.75 0,70 1дА,г/л • 2.4 1,75 1.0 IgM, г/л 0.38 0,80 0,80 супрессоры, м • 27048 29 ЗО Т а б л и ц а 7 Динамика иммунологических показателей больной Л. ЦНИИ 8.10.03г. через 1 месяц Т—лимфоциты, % 37 51 абс.'10°/л 0.3007 0,7020 Т—хелпвры, % 20 28 абс.*10в/л 0.3002 0.3780 Т—супрвссоры, % 8 23 абс.Ч0в/л 0,0845 0,3240 3.0 1.22 В—лимфоциты, % 35 27 абс.*10°/л 0,3000 0,3045 IgG, г/л 8.4 8,2 1дА.г/л 2.25 2,40 0,05 1.30 Дата Показатели Т—хелпвры/ 0.00.03г. до транспланта— супрвссоры, ' IgM. Г/А 27048 31 32 Т а б л и ц а 8 Динамика иммунологических показателей больного А Дата 23.07.03r. Показатели трансплантации 20.03 03г. чсроз 1 мосяц Т —лимфоциты, % 38 54 абс.*10 /л 0,4545 1.0200 Т—хелпвры, % 20 32 абс/10 /л 0.3468 0,0048 Т—супрессоры, % 0 22 абс.*10°/л 0.1077 0,4158 3.2 1.5 В— лимфоциты. % 32 20 абс.'10 в /л 0,3827 0,5481 IgG, г/л 8,00 8,00 IgA. j / л 1.5 2,00 IgM. г/л 1,23 1.20 АО 0 9 Т — халперЫ/ супроссоры, % Т а б л и ц а 9 Динамика показателей периферической крови больного М. Эрктро Дат» Эритро Г«могло— циты, бия, Цмтояой *»тюсуло— Лвйкоцн — Биофклы. М*т*ло — филы. ЦНГЫ, Эознно— мяллоци— С*ГИ«ЙТО— Лимфоци Моноциты. питы. циты.со — Тромво — ты, Подечхо— соэ. фвтдлъ — ты. Т«АЬ д*рждшив г/л % 1#'/А • мм/tu со со ньй гамогло — вив. % 3 г 10 53 18 • 0 140 43 10 2 3 10 51 27 7 180 37 0 8 2 8 54 31 5 180 15 0,9 7 6,4 1 5 50 32 б 254 8 14 0,85 7 6,5 1 0 58 29 0 251 8 14 10-05.вЗг. 3.2 105 0,9 11.05. вЗг. 3.3 107 0.9 16.05.03г 3,8 115 • 0,9 23.05.»Зг. 4,2 120 28.05.93г. 4,2 134 2 10 1 12 го о 00 1 36 27048 35 Т а б л и ц а 10 Динамика иммунологических показателей больного М Дата L0.05.O3r. 24.05.03г. АО трансплантации через 2 недели ЗІ 53 абс.-109/л 0.5580 1.0100 Т—хелперы, 24 31 • 0 16 12 21 25 23 18 14 Т а б л и ц а Динамика иммунологических показателей больной Б. Дата Показатели Т —лимфоциты 9 абс*10 /л Т—хелперы % 9 абс # 10 9 /л Т—супрессоры % абс*109/л Т" 'Тсупрессор ы В—лимфоциты %о э абс*10 /л IgG , г/л IgA, г/л IgM, г/л 12 15.09.92 2409.92 6.10.9Z до трансп. 3 - е суток 15—е сутки 1.1Z9Z через 2,5 месяца 44 0,5605 48 0,9768 28 0,5958 37 0,6327 38 0,4841 32 0,6512 21 0,4469 25 0,4275 6 0,0764 16 0,3256 7 0,1490 12 0,2052 6,2 2 3 2,1 32 0,4077 8,10 2,40 0.80 29 0,5902 11,45 2,55 1,40 26 0,5533 11,45 2,55 1,75 34 0,5834 8,10 2,40 1,75 27048 •х. Упорядник Техред М. Келемеш Коректор М. Куль Замовлення 549 Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 УКРАЇНА (19) > (51)6 А 61 К 35/28, А 61 К 35/407, А 61 К 35/48, А 61 К 35/54, А 61 К 35/14 ОПИС ДО ПАТЕНТУ ДЕРЖАВНЕ ПАТЕНТНЕ ВІДОМСТВО НА ВИНАХІД (54) ЛІКАРСЬКИЙ ПРЕПАРАТ ІМУНОКОРИГУЮЧОЇ Дії НА ОСНОВІ КЛІТИННОЇ СУСПЕНЗІЇ, СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ З ВИКОРИСТАННЯМ ЦЬОГО ПРЕПАРАТУ 1 2 (21) 94020324 (22) 18.10.93 (24) 28.02.2000 (46) 28.02.2000. Бюл. № 1 (56) 1. Izzi Т., Polehi О. et al. Fetal liver transplantation, Alan R Liss, 1985, pp.237249. 2 Transplantation Proceedings, 1993, vol.25, № 1, pp.1012-1013. (72) Смикодуб Олександр Іванович, Єфімов Андрій Семенович, Новицька Алла Володимирівна (73) Центр ембріональних тканин "Емселл" (57) 1. Лекарственный препарат иммунокоррегирующего действия на основе клеточной суспензии, приготовленной из нативных или криоконсервированных гемопоэтических клеток эмбриональной печени и/или селезенки, о т л и ч а ю щ и й с я * тем, что количество ядросодержащих клеток в такой суспензии составляет от 5 до 90 • 106/мл, количество колониеобразующих единиц грануломоноцитарного ряда от 20 до 80 • 103/мл, количество колониеобразующих единиц бластов - от 0,5 до 9 • 10э/мл, количество ранних предшественников гемопоэза - от 1и до 9-10 6 /мл. 2. Лекарственный препарат по п.1, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что при использовании упомянутых криоконсервированных клеток он дополнительно содержит диметилсульфоксид в количество от 3 до 10 мас.%. 3. Способ лечения сахарного диабета, заключающийся в парентеральном введении биологического материала иммунокоррегирующего действия, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве материала иммунокоррегирующего действия использован лекарственный препарат по любому из предшествующих пунк-' тов. 4. Способ по п.З, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что означенный препарат вводят в дозе от 0,5 до 5 мл. 5. Способ по п.4, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что означенный препарат вводят до или после терапии цитостатическими препаратами. 6. Способ по любому из пп.3-5, о тличающийся тем, что лекарственный препарат выбирают из сформированного в виде доз тканевого банка различных образцов с учетом индивидуальных показателей больного. 7. Способ по п.6, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что при повторном введении используют дозу препарата того же образца. Изобретение относится к области медицины, в частности - к клеточной терапии и может найти применение для лечения заболеваний, обусловленных нарушением иммунитета, например, сахарного диабета. За последние годы в области исследований применения трупных человеческих эмбриональных тканей произошел разительный прогресс. Разрабатывается целый новый раздел терапии - клеточная С > о 00 о 27048 терапия, которая позволяет с помощью лекарственных препаратов на основе клеточных суспензий, приготовленных из тканей эмбриона, восполнить недостаточную функциональную активность поврежденных, больных тканей. Клеточная трансплантация является привлекательной альтернативой для пересадки органов и тканей, так как преимущество эмбриональных клеток состоит в том, что они не сформировали жесткие индивидуальные признаки антигенной гистосовместимости, они легко приживляются и не вызывают реакции траснплантат против хозяина. Кроме того, клетки обладают мощным жизненным потенциалом. Они пролиферируют, дифференцируются, являются источником огромного количества биологически активных веществ. В настоящее время используют клеточные суспензии, приготовленные из эмбрионального мозга, костного мозга, печени, селезенки, тимуса, поджелудочной железы, кожномышечного лоскута. Первые наиболее успешные попытки использования клеточных суспензий в качестве лекарственных препаратов были связаны с эмбриональной печенью и селезенкой человека. Известно, что в печени или селезенке эмбриона человека в возрасте от 5 до 16 недель осуществляется кроветворение с высоким содержанием стволовых клеток. В данные сроки развития клетки эмбриональной печени и селезенки лишь в незначительной степени экспрессируют антигены первого и второго класса тканевой гистосовместимости. В 1973 г. впервые был создан лекарственный препарат на основе клеточной суспензии нативных клеток печени эмбриона 7 недельной гестации и за счет его введения был восстановлен гемопоэз больной апластической анемией (Kelemen Е. Second J.Gematol., 1973, v.10, № 4, рр.305-308). За последние годы, варьируя различными методами приготовления клеточных суспензий, а также различными методиками их применения, исследователям удалось достичь положительных результатов при лечении первичных и вторичных миелодепрессивных состояний. Эти препараты, в частности, описаны в Izzi Т., Polehi О. et al, Fetal liver transplantation, Alan R Liss, 1985, pp.237-249. Вторым направлением клинического примепнен^ія означенных клеточных суспензий явились нарушения иммунитета, здесь наиболее значительный опыт при 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 надлежит Touraine J.I. (Transplantation Proceedings, 1993, vol.25, № 1, pp. 10121013). В прекрасной работе Baechelta R. etal. (I.CIin.Invest, 1993, v.91, March, 10671078) показаны отдаленные результаты лечения больных с тяжелым комбинированным иммунным дефицитом, когда не только восстанавливались показатели иммунитета у этих больных, но показано наличиє расщепленного химеризма и появление толерантности к антигенам как хозяина, так и донора. У авторов также имеется свой опыт лечения иммунных нарушений при заболеваниях крови с использованием клеточных суспензий. Однако использование этих препаратов для лечения, в частности, сахарного диабета авторам не известно. Как известно, механизм развития инсулинзависимого сахарного диабета включает в себя аутоиммунное поражение островков Лангерганса клеточными и циркулирующими антителами. Поэтому в последующем при лечении инсулинзависимого сахарного диабета используются препараты, вещества, ткани, направленные на прерывание аутоиммунного поражения р-клеток поджелудочной железы по типу иммунокоррекции. С этой целью применялись изопринозин, азатиоприн, циклоспорин, а также препараты на основе биологических материалов, в частности, препараты вилочковой железы. Так, известен препарат, полученный из вилочковой железы, тималин, выделенный из тимуса телят, и его применение как иммунокорректора при лечении сахарного диабета (Курбанов Т.Г., Кальбиева Б.М., Закиева Г.Т. Проблемы эндокринологии, 1989, т. 35, № 6, с.7-9). Однако недостатком известного метода лечения является то, что суточная потребность инсулина уменьшается всего на 15-20%. Снижение уровня гликемии удерживается только в течение 5-6 мес. Кроме того, тималин часто не дает полного восстановления иммунологических показателей, а увеличивает их селективно на определенный процент без достижения нормального уровня. В основу изобретения поставлена задача создать такой лекарственный препарат иммунокоррегирующего действия на основе клеточной суспензии в котором, благодаря оптимальному подбору показателей клеточного состава удалось бы усилить механизм иммунокоррекции и достичь положительных результатов при лечении сахарного диабета. 27048 Поставленная задача решается тем, что в лекарственном препарате иммунокоррегирующего действия на основе клеточной суспензии, приготовленной из нативных или криоконсервированных 5 гемопоэтических клеток печени и/или селезенки эмбриона человека, согласно изобретению, количество ядросодержащих клеток в означенной суспензии составляет от 5 до 90 • 106/мл, количество коло- 10 ниеобразующих единиц грануломоноцитарного ряда - от 20 до 80*10 3 /мл, количество колониеобразующих единиц бластов - от 0,5 до 9*10 3 /мл и количество ранних предшественников гемопоэза - от 15 1 до 9 - 10 6 /мл. Эмпирически было установлено, что выбор именно таких показателей клеточного состава и их количественные соотношения позволяют достичь положитель- 20 ных результатов лечения сахарного диабета, а именно: перехода основного заболевания в стадию ремиссии. Авторы полагают, что именно такой состав заявленного лекарственного пре- 25 парата позволяет наиболее эффективно влиять на механизм иммунокоррекции, в частности, останавливать агрессию Т-лимфоцитов и иммуноглобулинов против рклеток. Кроме того, лекарственный пре- 30 парат заявляемого состава, являясь источником биологически активных веществ, вызывает мощное трофическое действие, проявляющееся в увеличении количества функционирующих капилляров, нормали- 35 зации проницаемости, миграции клеток, их дифференцировки, что, в конечном итоге, определяет завершенность воспалительного процесса и уменьшение явления дистрофии. 40 Согласно изобретению, целесообразно чтобы при криоконсервировании лекарственный препарат дополнительно содержал диметилсульфоксид в количестве от 3 до 10%. Выбор нижнего предела 45 обусловлен наибольшей сохранностью клеток, а верхнего - исходя из токсического действия препарата. Поставленная задача решается также и тем, что в способе лечения сахарного 50 диабета, заключающемся в введении биологического материала иммунокоррегирующего действия, согласно изобретению, в качестве биологического материала иммунокоррегирующего действия используют 55 патентуемый лекарственный препарат. Авторы считают, что лекарственные препараты на основе клеточной суспензии ранее никогда не использовались для лечения сахарного диабета. Однако дли тельная исследовательская работа по изучению механизмов воздействия препаратов на основе клеточных суспензий на процессы лечения различных заболеваний позволяет утверждать, что клеточные суспензии заявляемого состава весьма успешно могут быть использованы для лечения сахарного диабета. Об этом свидетельствуют всевозможные клинические испытания, проведенные авторами, некоторые из которых подробно описаны в нижеприведенных примерах. У больных наблюдали значительное улучшение показателей иммунного статуса, вплоть до восстановления на 3-11 сут (увеличение количества Т-лимфоцитов, изменение соотношения субпопуляций, нормализация показателей гуморального иммунитета). Была снижена исходная доза вводимого инсулина на 4 0 - 7 0 % . На протяжении 3 - 4 нед достигалась ремиссия заболевания. В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, целесообразно патентуемый лекарственный препарат вводить в дозе от 0,5 до 5 мл. Кроме того, желательно, чтобы этот препарат был введен до и/или после те-, рапии цитостатическими препаратами. Лекарственный препарат целесообразно выбирать из сформированного тканевого банка различных образцов с учетом индивидуальных показателей больного, причем при повторном введении использовать препарат того же образца. Предлагаемый способ лечения сахарного диабета позволяет введением патентуемой клеточной суспензии коррегировать различные нарушения, определяющие течение сахарного диабета, в частности, инсулинрезистентности, развитии макро- и микроангиопатий, поражений почек, печени, развитии анемического синдрома, тромбоцитопении и т.д., восстанавливая утраченные функции кроветворения и иммунной системы. Далее сущность изобретения станет более понятной из приведенного ниже подробного описания его осуществления, изложенного в конкретных примерах его реализации. Лекарственный препарат заявляемого состава можно изготовить, используя следующую методику. Эмбрионы получают при искусственном прерывании беременности у здоровых, предварительно обследованных на наличие вирусных и гемических инфекций женщин. Используя эмбрионы сроком от 5-8 нед гестации. В целях сохранения 27048 целостности эмбриона аборт проводят вакуумэкстракцией. Эмбрион переносят в стерильный сосуд с раствором Хэнкса и антибиотика (группа аминогликозидов). Дальнейшая работа проводится в стерильных условиях бокса. Эмбрионы переносятся в стерильные чашки Петри, заполненные раствором Хэнкса с антибиотиком, где, осторожно вскрыв брюшную полость, извлекают печень, селезенку, из которых отдельно приготовляют клеточные суспензии. Кроветворные органы помещают в гомогенизаторы, разрезают на небольшие фрагменты и измельчают до получения однородной массы. Клетки смывают со стенок и пестика гомогенизатора раствором Хэнкса в мерные пробирки, пропуская через фильтр для переливания крови, а затем через иглы уменьшающегося диаметра. Часть приготовленной суспензии переносят в полиэтиленовый контейнер и герметично закрывают. Она будет использована для трансплантации нативной клеточной суспензии. Другая часть подлежит криоконсервации. В качестве криопротектора используют диметилсульфоксид (ДМСО, химически чистый). Перед использованием ДМСО пропускают через миллипоровый фильтр (с диаметром пор 0,22 мкм). При легком перемешивании клеточной суспензии добавляют по каплям равный объем рабочего раствора ДМСО, достигая концентрации в предпочтительном варианте 5%. Клеточные суспензии разливают в полиэтиленовые контейнеры в зависимости от дальнейших целей объемом от 0,5 до 2 мл. Контейнеры помещают в камеру программного замораживателя, работающего на жидком азоте и замораживают до 196°С. Криоконсервированные суспензии хранятся в банке эмбриональных тканей в жидком азоте при температуре -196°С. После приготовления клеточной суспензии определяют следующие показатели: 1-й - количество ядросодержащих клеток в 1 мл; 2-й - количество колониеобразующих единиц грануломоноцитарного ряда (КОЕ ГМ) в 1 мл; 3-й - количество колониеобразующих единиц бластов (КОЕ бл.) в 1 мл; 4-й - количество ранних предшественников гемопоэза (CD^) в 1 мл. И далее используются и хранятся в тканевом банке клеточные суспензии, следующих параметров: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8 1-й - от 5 до 90*10 б /мл 2-й - от 20 до 80-10 3 /мл 3-й - от 0,5 до 9- 103/мл 4-й - от 1 до 9- 106/мл Пренатальная диагностика включает в себя исследования на наличие сифилиса, ВИЧ-инфекции, вирусного геппатита В и С, токсоплазмоза, цитомегаповирусной инфекции. Проводятся исследования содержимого контейнеров на бактериальную стерильность. Фетальная диагностика включает исследования на наличие ВИЧ-инфекции, вирусного геппатита В и С, цитомегаловируса, вируса краснухи, герпеса, и токсоплазмоза. В зависимости от варианта клинического лечения лекарственный препарат вводят одним из следующих методов: - введение (трансплантация) части нативных гемопоэтических клеток, в дальнейшем введение криоконсервированных клеток, хранящихся в банке данного образца; - введение всего нативного образца; - введение части или всего криоконсервированного материала данного образца. До и в ряде случае после введения патентуемого лекарственного препарата проводят лечение одним или комбинацией цитостатических препаратов с целью уменьшения иммунологической реактивности реципиента, уменьшения аутоиммунной агрессии. Эффект лечения оценивают по: - уровню снижения гликемии, уменьшению дозы вводимого инсулина, возникновению гипогликемических состояний; - изменение показателей иммунного статуса (содержание в крови Т-В-лимфоцитов, иммуноглобулинов); - количеству эритроцитов периферической крови, содержащих фетальный гемоглобин; - наличию клеток, содержащих Y-xpoмосому, определяемых методом цепной реакции полимеризации с использованием олигонуклеотидных праймеров. Подробное описание использования патентуемого изобретений в имеющейся у авторов клинической практике представлено также в примерах 1-7. П р и м е р 1. Больная Д., 1946 г.р., поступила в диабетологическое отделение Украинского НИИ эндокринологии и обмена веществ 21.08.93 г. с жалобами на выраженную слабость, головокружение, одышку при незначительной физической нагрузке, сердцебиение, плохой ап 27048 петит, тошноть», кожный зуд, головную боль, отеки на ногах, снижение зрения. Из анамнеза известно, что 13 лет назад выявлен инсулинзависимыи сахарный диабет. Постоянно получала инсулинотерапию, наблюдалась эндокринологом, периодически лечилась в стационаре. В течение последних двух лет отмечает ухудшение состояния: появилась артериальная гипертензия, течение основного заболевания приобрело лабильный характер, в анализах мочи - постоянно лротенурия. За последний год появилась слабость, периодически отечность нижних конечностей, диспептические явления, выявлено снижение уровня эритроцитов и гемоглобина периферической крови. В марте 1993 года лечилась в неврологическом отделении областной больницы, установлено наличие хронической почечной недостаточности, анемии средней степени тяжести. Произведено 4 трансфузии эритроцитарной массы. После временного улучшения состояние резко ухудшилось в сентябре 1993 года, что явилось поводом для госпитализации. При поступлении состояние больной тяжелое. Сознание ясное. Кожные покровы и видимые слизистые бледные. Периферические лимфатические узлы не увеличены. Пульс - 98 уд./мин, ритмичный, удовлетворительного наполнения и напряжения. Артериальное давление 190/120 мм рт.ст. Тоны сердца достаточной звучности, ритмичны, систолический шум на верхушке, акцент ІІ тона на аорте. В легких прослушивается везикулярное дыхание. Живот мягкий, умеренно вздут, чувствителен на пальпации в области правого подреберья. Печень выступает из-под края правой реберной дуги по правой ереднеключичной линии на 2 см. Селезенка не увеличена. Отрезки толстой кишки смазмированы. Стул - 4 раза в сутки, кашицеобразный. Суточный диурез до 1 л. Лицо, стопы, голени отечны. Установлен диагноз: сахарный диабет, тип I, тяжелая форма, в состоянии декомпенсации. Диабетическая универсальная ангиопатия (нефропатия Ш ст., ХПН ( ст., сосудистая форма пролиферирующей ретинопатии" микро- и макроангиопатия сосудов нижних конечностей II ст.). Диабетическая полинейропатия нижних конечностей. Анемия тяжелой степени тяжести. Симптоматическая гипертензия. При поступлении гликемия - 12,4 ммоль/л, глюкозурия - 22 г/л, ацетонурия - (++), протеинурия - 3,3 г/л, эритро- и цилиндрурия (5 - в поле зрения), К+ - 5,2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 10 ммоль/л, мочевина - 14,42 ммоль/л, креатинин - 0,220 ммоль/л, эритроциты 2,1 • 1012/л, гемоглобин - 64 г/л Назначено лечение, диетотерапия, инсулинотерапия - 22 ЕД/сут., дезинтоксикационная терапия (энтеросорбенты, гемодез, промывание кишечника), диуретики, гипотензивные, ангиагреганты, ангиопротекторы, коррекция электролитного баланса, препараты железа, витаминотерапия. Через три недели состояние больной несколько улучшилось: компенсирован углеводный обмен, сошли отеки, АД снизилось до 170/100 - 110 мм рт.ст. Однако сохранялся стойкий тяжелый анемический синдром. 15.09 93 г. произведена трансплантация нативных гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (образец 3038С-82Н): возраст эмбриона 5 недель, количество ядросодержащих клеток 25- 106/мл, объем введенной ткани - 1,5 мл, КОЕ ГМ - 13,9-103/мл, КОЕ бл. 1,3-103/мл, CD34 - 2,4-106/мл. Способ введения - внутрикостный (внутригрудинный). Трансплантацию больная перенесла удовлетворительно. Через 8-10 ч наблюдался синдром раннего посттрансплантационного улучшения состояния: уменьшилась головная боль, слабость, тошнота, улучшился аппетит, больная впервые за последние несколько месяцев спокойно спала. На 3-й сут повысился уровень гемоглобина, эритроцитов и ретикулоцитов периферической крови с нормализацией к 10 дню (табл.1), постепенно в течение трех недель значительно улучшились анализы мочи (табл.2). Снизилось артериальное давление до 160/100-90 мм рт.ст, что позволило уменьшить дозу гипотензивных препаратов. П р и м е р 2. Больной П., 1960 года рождения, поступил в диабетологическое отделение Киевского НИИ эндокринологии и обмена веществ 6.11.91 г. с жалобами на общую слабость, похудание, сухость во рту, жажду, обильное мочеиспускание. Считает себя больным с сентября 1991 г., когда впервые появились подобные жалобы. Не обследовался. Резкое ухудшение состояния в ноябре 1991 г. заставило обратиться за медицинской помощью Установлен диагноз: сахарный диабет, тип I, впервые выявленный, тяжелой формы, в состоянии декомпенсации, диабетический кетоацидоз. При поступлении уровень гликемии составлял 15 ммоль/л, глюкозурия -- 41,6 11 27048 г/л, ацетонурия - (+++). Назначено лечение; инсулинотерапия - 60 ЕД в сутки, витаминотерапия, препаратыкалия. После достижения компенсации состояния 2.12.1991 г. произведена первая трансплантация нативных гемопоэтических клеток эмбриональной печени и селезенки человека (образец 3038C-63HL): возраст эмбриона 7 недель, объем введенных клеток - 1 мл, количество ядросодержащих клеток - 36,2* 107мл, КОЕ ГМ - 23,6- 103/мл, КОЕ бл. - 2,5- 103/мл, CD34 - 1,4«106/мл. Способ введения внутривенный. Объем трансплантированных клеток от общей массы ткани данного образца, находящейся в банке криоконсервированных тканей, составил 66%. Трансплантацию больной перенес удовлетворительно. В первые сутки наблюдали синдром раннего посттрансплантационного улучшения общего состояния: уменьшение слабости, улучшение аппетита, больной стал бодрее, активнее. Через три недели после трансплантации появились гипогликемические состояния, что явилось причиной постепенного снижения суточной дозы вводимого инсулина, с максимальным снижением через 2,5 месяца (табл.3). Наблюдали нормализацию показателей имунного статуса уже на 11-е сутки (табл.4). В течение шести месяцев после первой трансплантации больной находился в компенсированном состоянии со стабильной относительно низкой суточной дозой вводимого инсулина. В конце мая 1992 г. состояние больного ухудшилось: появились признаки декомпенсации углеводного обмена, ухудшились показатели имунного статуса (табл.4). Суточную дозу вводимого инсулина увеличили до 32 ЕД. 3.06.92 г. произведена повторная трансплантация криоконсервированных гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека того же образца: № 3038C-63HL - введено 0,5 мл клеточной суспензии. Трансфузию больной перенес удовлетворительно. Положительная динамика суточной дозы вводимого инсулина, показателей имун- ного статуса приведена в табл.3, 4. Динамика изменений количества эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин, свидетельствует о заместительном эффекте трансплантированных клеток. П р и м е р 3. Больная Р., 1961 года рождения, поступила в 1-е терапевтическое отделение ЦРБ Зализнычного района г. Киева 1.12.92 г. с жалобами на выра 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 12 женную слабость, похудание, сухость во рту, жажду, обильное мочеиспускание, головную боль, плохой аппетит. Считает себя больной с октября 1992 года, когда почувствовала ухудшение состояния. Не обследовалась. Резкое ухудшение состояния в конце ноября 1992 года явилось поводом обращения за медицинской помощью. Установлен диагноз: сахарный диабет, тип I, впервые выявленный, тяжелой формы, в состоянии компенсации, диабетический кетоацидоз. При поступлении уровень гликемии составлял - 20,0 ммоль/л, глюкозурия - 52,4 г/л, ацетонурия - (+++). Назначено лечение: инсулинотерапия - 64 ЕД в сутки, витаминотерапия, препараты калия, гемодез 200,0 через день № 6. Больной назначен азатиоприн в суточной дозе 2 мг на 1 кг массы тела в два приема, начиная с 25 мг в сутки, постепенно увеличивая дозу под ежедневным контролем периферической крови. По достижению указанной терапевтической дозы лечение проводилось при еженедельном контроле количества лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов в периферической крови. Через 32 дня от начала лечения азатиоприном при достижении субкомпенсации нарушений углеводного обмена 5.1.93 г. произведена трансплантация криоконсервированных гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (образец 3038С-44Н); возраст эмбриона 6 недель, объем введенных клеток - 1 мл, количество ядросодержащих клеток - t7,5 • 106/ мл, КОЕ ГМ - 24,8-10 3 /мл, КОЕ бл. 1,7* 103/мл, CD^ - 2* 106/мл, способ введения - внутривенный. Объем трансплантированных клеток от общей массы ткани данного образца, находящейся в банке криоконсервированных тканей, составил 45%. Трансплантацию больная перенесла удовлетворительно. В первые сутки наблюдали синдром раннего посттрансплантационного улучшения общего состояния: уменьшение слабости, головной боли, улучшение аппетита. Лечение азатиоприном продолжали в течение 48 дней после трансплантации гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека. Через 2 недели после трансплантации появились гипогликемические состояния, что явилось причиной постепенного снижения суточной дозы вводимого инсулина, с максимальным снижением через 2 мес. (табл.5). 13 27048 К концу второй недели нормализовались показатели имунного статуса больной (табл.6). Динамика изменений количества эритроцитов периферической крови, содержащих фетальный гемоглобин, свидетельствует о заместительном эффекте трансплантированных клеток. Ремиссия заболевания длится более 9 мес. Наблюдение продолжается. П р и м е р 4. Больная Л., 1991 года рождения, находилась в эндокринологическом отделении Детской специализированной клинической больницы № 14 г. Киева с 15.09.93 г. по 26.09.93 г. Диагноз: Инсулинзависимый сахарный диабет, тяжелая форма, лабильное течение, состояние субкомпенсации. Заболевание выявлено в феврале 1993 г., когда в предкоматозном состоянии ребенок был доставлен в реанимационное отделение. Установлен диагноз: сахарный диабет, тип I. Начата инсулинотерапия - 8 ЕД/ сутки. В последующие месяцы суточная доза инсулина снижена до 6 ЕД. Характер течения основного процесса был лабильным: частые гипогликемические состояния в чередовании с кетоацидозом. Девочка госпитализирована в эндокринологическое отделение для проведения трансплантации гемопоэтических эмбриональных клеток. При поступлении гликемия в течение суток от 5,5 до 12,4 ммоль/л, глюкозурия - 3,2 г/л, аценотурия - отсутствует. 12.09.93 г. произведена трансплантация криоконсервированных гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (образец 3038С - 91Н): возраст эмбриона - 5 недель, количество ядросодержащих клеток - 25,0* 106/мл, объем введенной ткани - 1,5 мл, КОЕ ГМ - 23,9-103/ ./мл, КОН бл. - 1,8- 103/мл, CD34 - 4-Ю 6 / /мл. Способ введения - внутривенный. Больная перенесла трансплантацию удовлетворительно. Со слов мамы у ребенка улучшился аппетит уже к вечеру после трансплантации, сон стал спокойным, глубоким. На четвертые сутки после трансплантации снизили суточную дозу вводимого инсулина до 5 ЕД. В дальнейшем суточная доза вводимого инсулина осталась такой же. В течение месяца нормализовались иммунологические показатели больной (табл.7). На протяжении всего времени после трансплантации состояние ребенка остает 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 14 ся удовлетворительным; стабилизировалось течение заболевания - гликемия в течение дня на уровне 4,5-7,3 ммопь/л, гипогликемии и эпизодов кетоацидоза не наблюдалось. Уменьшились повышенная раздражительность, плаксивость. Психофизически девочка развивается согласно возрасту. Наблюдение продолжается. П р и м е р 5. Больной А., 1969 года рождения, находился в терапевтическом отделении Центральной клинической больницы Зализнычного района г. Киева с 21.07.93 г. по 12.08.93 г. Диагноз: инсулинзависимый сахарный диабет, тяжелая форма, лабильное течение, состояние компенсации, диабетическая универсальная ангиопатия II ст., диабетическая периферическая полинейропатия-. Хронический холецистит, фаза ремиссии. Считает себя больным с 1986 года, когда после сильного психоэмоционального перенапряжения начало ухудшаться самочувствие: слабость, полидипсия, полиурия, потеря в весе тела. Через 2 месяца, когда обратился за медицинской помощью, диагностирован инсулинзависимый сахарный диабет. Компенсация состояния, достигнута при суточной дозе вводимого инсулина 64 ЕД. В течение последнего года отмечает появление болей в ногах, преимущественно по ночам, чувство жжения, покалывание, иногда онемения, судороги в икроножных мышцах. Основное заболевание приобрело лабильный характер: частая смена удовлетворительного состояния кетоацидозом или гипогликемией при незначительных изменениях в приеме пищи, физических и эмоциональных нагрузках. Больной госпитализирован в терапевтическое отделение для проведения трансплантации гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека. При поступлении гликемия в течение суток от 4,7 до 11,4 ммоль/л, глюкозурия - 22,4 г/л, ацетонурия отсутствует. Суточная доза инсулина - 58 ЕД. 28.07.93 г. произведена трансплантация нативных гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (образец 3038-101Н): возраст эмбриона - 6 недель, количество ядросодерожащих клеток 8,5* 106/мл, объем введенной ткани 2,5 мл, КОЕ ГМ - 23- 103/мл, КОЕ бл. 2,4-107мл, CD34 - 3,8*106/мл. Способ введения - внутривенный. Больной трансплантацию перенес удовлетворительно. Через 8-10 ч наблюдали появление синдрома первичного 15 27048 посттрансплантационного улучшения общего состояния: уменьшение слабости, повышение работоспособности, улучшение сна. В течение двух недель снижена доза вводимого инсулина до 50 ЕД в сутки. В общеклинических исследованиях существенных изменений не произошло (в пределах нормы до и после трансплантации). Восстановились показатели иммунологического статуса через 1 месяц (табл.8). Возрос уровень эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин, до 15%. Наблюдение продолжается больше 12 мес. Больной чувствует себя удовлетворительно: достигнута стойкая компенсация состояния, не было эпизодов кетоацидоза. Суточная доза вводимого инсулина сохраняется на уровне 50-52 ЕД. Эритроциты, содержащие фетальный гемоглобин, определяются в пределах 8-10%. П ри м е р 6. Больной М., 1931 года рождения, находился в хирургическом отделении Центральной клинической больницы Зализнычного района г.Киева с 12.04.93 г. по 26.05.93 г. Диагноз: Сахарный диабет, тип I, тяжелая форма состояние субкомпенсации, универсальная диабетическаая ангиопатия: микро- макроангиопатия сосудов нижних конечностей Ш ст., ретинопатия, нефропатия II ст., трофическая язва 1 пальца правой стопы, флегмона стопы. Диабетический полиневрит. При поступлении больной предъявлял жалобы на общую слабость, повышение температуры тела до 38,5°С, ознобы по утрам, отечность, ощущение распирания в правой стопе, изъязвление мягких тканей 1 пальца правой стопы, ощущение онемения, покалывания в ногах, боли в ногах, как в покое, так и при физической нагрузке. Страдает инсулинзависимым сахарным диабетом в течение 22 лет. В течение последних 5 лет появились жалобы на боли в ногах при ходьбе, успокаивающиеся в покое, а также чувство онемения, покалывания в ногах, преимущественно по ночам. Месяц назад в области 1 пальца правой стопы открылась язва мягких тканей. Больной лечился амбулаторно без результата. После очередной ванны резко отекла стопа, голень, усилилась боль, появилась выраженная гиперемия кожных покровов, повысилась температура тела до 38°С. Сразу после поступления вскрыта флегмона, произведена хирургическая обработка. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 16 Назначены антибиотикотерапия, противовоспалительные препараты, инсулинотерапия - 38 ЕД в сутки. Состояние больного не изменилось: продолжались подъемы температуры тела по вечерам до 38,6°С, сохранялась общая слабость, гнойные выделения из разреза и трофической язвы. Через трое суток у больного прослушивалась правосторонняя нижнедолевая пневмония. Произведены бактериологические посевы крови, мочи, кала. Из крови высеян Staphylococcus aureus. Больной получил 3 курса антибиотикотерапии в течение трех недель (ампиокс, гентамицин, рифампицин, клафорам). 8 анализе крови лейкоцитоз со сдвигом лейкоцитарной формулы влево, ускорение СОЭ, умеренная анемия (табл.9). В иммунограмме резко снижено количество Т-лимфоцитов, несколько повышено количество р-лимфоцитов (табл.10). г С целью усиления иммунной защиты 10.05.93 г. произведена трансплантация нативных гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (образец 3038С57Н): возраст эмбриона - 8 недель, количество ядросодержащих клеток - 37,5 • 106/ мл, объем введенной ткани - 2,5 мл, КОЕ ГМ - 42-107мл, КОЕ бл. - 1,3-107мл, CD.^ - 1,4 • 107мл, способ введения - внутривенный. Через 8—10 ч после трансплантации наблюдали проявления синдрома первичного посттрансплантационного улучшения общего состояния: вечером снизилась температура тела до 37°С, уменьшилась слабость, появился аппетит, ночью спал спокойно. Постепенно в течение 7-10 дн. нормализовались показатели крови (табл.9). Началось очищение раны и язвы от гнойнонекротических масс. На седьмые сутки появились здоровые грануляции и началась эпителизация. Через две недели язва и рана зарубцевались. Наблюдали восстановление показателей иммунного статуса на 14-е сутки (табл.10). Из-за появления гипогликемии на пятые сутки суточную дозу инсулина снизили до 34 ЕД. Больной выписан домой в удовлетворительном состоянии. П р и м е р 7. Больная Б., 1957 года рождения, поступила в диабетологическое отделение.Киевского НИИ эндокринологии и обмена веществ 4.09.92 г. с жалобами на выраженную слабость, жажду, сухость во рту, обильное мочеиспускание, похудание, плохой аппетит, головные боли. 17 27048 Считает себя больной в течение последних трех месяцев, когда постепенно начало ухудшаться состояние. Не обследовалась и не лечилась. Резкое ухудшение состояния явилось поводом обращения за медицинской помощью. Установлен диагноз: сахарный диабет, тип I, впервые выявленный, тяжелая форма, состояние декомпенсации, диабетический кетоацидоз. При поступлении гликемия - 20,2 ммоль/л, глюкозурия - 51,2 г/л, ацетонурия - (++++). Назначено лечение: инсулинотерапил - 62 ЕД в сутки, витаминотерапия, препараты калия. После достижения субкомпенсации состояния произведена трансплантация нативных гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (образец 3038С20HL): возраст эмбриона - 7 недель, количество ядросодержащих клеток 25-10 6 /мл, объем введенной ткани - 1 3 мл, КОЕ ГМ - 19,3-10 /мл, КОЕ бл. 3 2,1-10 /мл, CD34 - 1,8-106/мл. Способ введения внутривенный. Объем трансплантированных клеток от общей массы ткани данного образца, находящейся в банке криоконсервированных культур, составил 50%. Трансплантацию больная перенесла удовлетворительно. В первые сутки наблюдали синдром раннего постртрансплантационного улучшения общего состояния; уменьшение слабости головных болей, улучшение аппетита, сна. С третьих суток после трансплантации в связи с появлением гипогликемии начали снижать дозу 5 10 15 20 25 18 суточного инсулина с максимальным снижением через 2,5-3 месяца (табл.11). Положительная динамика иммунологических показателей больной Б. приведена в табл.12 Динамика изменений количества эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин, свидетельствует о заместительном эффекте трансплантированных клеток. Ремиссия заболевания длится больше двенадцати месяцев. Таким образом, предлагаемый лекарственный препарат и способ лечения сахарного диабета с целью использования препарата позволяют: - оборвать аутоиммунную агрессию против островков Лангерганса; - уменьшить дозу инсулина за счет снятия клеточной блокады с сохранившихся р-клеток; - уменьшить или снять лабильность течения; - уменьшить иммунорезистентность; - восстановить гемопоэз; - уменьшить такие осложнения сахарного диабета как инфекционные, микро- и макроангиопатии, нейропатии. Кроме того, клеточные суспензии 30 заявляемого состава могут храниться в аптеках-банках криоконсервированных тканей и, с учетом отсутствия необходимости определения антигенов гистосовместимости, предполагают при наличии показаний 35 более простое применение, чем, например, трансфузия крови. Т а б л и ц а 1 Динамика показателей периферической крови больной Д Дата Р«титул» —анты. Палочко Моввцн— ты, Тромбе — циты. СХ)Э. S % 1в'/л м^члс в? 25,5 е 180 35 0 04 29 4 254 42 11 ЭО1ИИ0 — 1**/Л % % — — 4,9 — __ 0,5 1 7 5,7 — —. 2 1 5,7 — _ __ _ 14 5,0 _ _ 1 2 67 28 2 0,9 14 7,5 _ — 1 2 02 33 2 0,9 15 5,3 1 1 ез 32 3 Гвмог/л — бив. Ів /д 12 Г/Л 13.00.03г. 2.11 75 1.00 18.00.03r. 3,11 105 0,97 20.00.03r 3,14 82 .0,78 25.00.03г. 4,0 120 0,9 28. 00.03г. 4,0 120 10.10.03г. 4,1 124 __ _ Л»йхоая —ты. филы. ядерные. % _ — _ « _ 00 13 Дат» 15 295 Т а б л и ц а Динамика анализов мочи больной Д. до и после трансплантации чество, Прозрвч РвЛКДИЛ Суточ тольвад Боло к. Сахар, Ал&ко— Эритро Гиали пяти плот —HOCTW 2 ГО Относи — Цвет деты.со — дврж»щив ф*Т4Лі — ный гемогло — Лимфоциты. Свгмвнто— цдеркио. Быофялы, Цівтоюй показатель Эркгро — акты. Коли со циты новы* Зернис Васио — — ты* • видны* Ацетон ная протеи — ность. у.*А вгурнл. мл г/л г/л В-пол* зрения го о соло6.00.03г. 100.0 менно— 00 тхсл. ирозр. 0,6 1014 желтый 0.6 6 - а 4 — 6 2 - 4 5 - Ю един. нот 4 8.00.03г. 16,5 г/л 18.OO.O3r 100,0 с/ж прозр. 10.10.03г квел. 1011 0,6 _ _ 5 - 7 0 —8 нет 2 - 4 пот • 170,0 с/ж прозр. го кнел. 1018 1,05 8,3 2 - 3 пот пот пот го 23 24 27048 Т а б л и ц а 3 Анализируемые показатели больного П. до и после трансплантации гемопоэтических клеток эмбриональной печени человека (состояние компенсации) 2.12.91 г. - 1-я трансплантация 3.06.92 г. - 2-я трансплантация Дата 1.1Z 01г. Показателя Суточная доза инсулина, НД 23.12. 01г. 17.01. 02г. 23.01 02г. 7.05. 02г. 3.06. 02г. 0.07. 02г 17.07. 02г. 21.01. 03г. через ч*рез 5 мес через нее. через 1 мее. через 1.5 нес. через 7,5 мес. до транс— плаят. 21-* суг. мес через *5 нее. 48 30 20 20 20 32 24 22 24 25 40 50 50 34 50 55 50 18 12 14 8 2 12 18 14 % снижения сут. дозы инсулина % исходному уровню U 0 Эритроциты, содержащею фетальний гемоглобин, % 0