Виділена молекула днк, яка кодує протопорфіриногеноксидазу, її модифіковані варіанти та їх застосування

1. Выделенная молекула ДНК, которая кодирует протопорфириногеноксидазу, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 и 10. 2. Выделенная молекула ДНК, которая кодирует протопорфириногеноксидазу, аминокислотная последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, где: а) аланин в положении 220 заменен на аминокислоту, выбранную из группы, включающей валин, треонин, лейцин и цистеин; и/или б) глицин в положении 221 заменен на серин; и/или в) тирозин в положении 426 заменен на аминокислоту, выбранную из группы, включающей цистеин, изолейцин, лейцин, валин и треонин. 3. Выделенная молекула ДНК по пункту 2, где аланин в положении 220 SEQ ID NO: 2 заменен на валин. 4. Выделенная молекула ДНК по пункту 2, где тирозин в положении 426 SEQ ID NO: 2 заменен на цистеин. 5. Выделенная молекула ДНК, которая кодирует протопорфириногеноксидазу, аминокислотная последовательность которой представленная в SEQ ID NO: 6, где: а) аланин в положении 166 SEQ ID NO: 6 заменен на валин; и/или б) глицин в положении 167 SEQ ID NO: 6 заменен на серин; и/или в) тирозин в положении 372 SEQ ID NO: 6 заменен на цистеин. 6. Экспрессионная кассета, которая содержит промотор, функционально связанный с выделенной молекулой ДНК по любому из пунктов 1-5. 2 (19) 1 3 71536 Настоящее изобретение относится к манипулированию ферментативной активностью, ответственной за превращение протопорфириногена IX в протопорфирин IX в процессе биосинтеза, общего для всех эукариот. Один из предметов изобретения относится к развитию устойчивости к гербицидам у растений, тканей растений и семян. Другой предмет изобретения относится к разработке методов диагностики и лечения дефицита этой ферментативной активности у животных, в частности у людей. Процессы биосинтеза, приводящие к производству хлорофилла и гема, включают ряд общих стадий. Хлорофилл представляет собой поглощающий свет пигмент, присутствующий во всех зеленых фотосинтезирующих организмах. Гем представляет собой кофактор гемоглобина, цитохромов, Р450-оксигеназ со смешанной функцией, пероксидаз и каталаз (см., например, у Lehninger, Biochemistry, Worth Publishers, New York (1975)) и, следовательно, является необходимым компонентом всех аэробных организмов. Последней общей стадией биосинтеза хлорофилла и гема является окисление протопорфириногена IX в протопорфирин IX. Протопорфириноген-оксидаза (обозначенная в данном описании как "протоке") представляет собой фермент, который катализирует эту последнюю стадию окисления (Matringe и др., Biochem. J. 260: 231 (1989)). Фермент протоке был очищен полностью или частично из многочисленных организмов, включающи х дрожжи Saccharorayces cerevisiae (LabbeBois и Labbe, Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, Ε.Η.Dailey, ред. McGraw Hill: New York, стр.235-285 (1990)), этиопласты ячменя (Jacobs и Jacobs, Biochem.J. 244: 219 (1987)) и печень мыши (Dailey и Каrr, Biochem. 26: 2697 (1987)). Гены, кодирующие протоке, были выделены из двух прокариот: Escherichia coli (Sasarman и др., Can. J.Microbiol. 39: 1155 (1993)) и Bacillus subtilis (Dailey и др., J.Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Эти гены не обладают сходной последовательностью; кодируемые ими протеиновые продукты не имеют каких-либо идентичных аминокислотных последовательностей. Протеин Е.coli имеет массу приблизительно 21кДа и связан с клеточной мембраной. Протеин В.subtilis имеет массу 51кДА и является растворимым, активным в цитоплазме. В настоящее время слишком мало известно о ферменте протоксе, чтобы получить возможность выделить кодирующие протоке гены из высших эукариот (т.е. животных, растений и всех других многоклеточных, имеющих ядро организмов, отличных от низших эукариотических микроорганизмов, таких, как дрожжи, одноклеточные водоросли, простейшие и т.д.), используя известные подходы. В частности многие стандартные методы выделения новых протеинов и генов базируются на предположении, что они обладают значительным 4 сходством по первичной структуре (т.е. по аминокислотной последовательности и последовательности ДНК) с известными протеинами и генами, обладающими аналогичной функцией. Такие стандартные методы включают гибридизацию нуклеиновых кислот и амплификацию путем полимеразно-цепьевой реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров, соответствующих мотивам консервативной аминокислотной последовательности. Не следует ожидать, что эти методы будут пригодны для выделения генов протокса эукариот при использовании современной информации о структуре, которая ограничена данными о генах протокса прокариот, поскольку не существуе т значительного структурного сходства даже между известными генами и протеинами протокса прокариот. Другой подход, который был применен для выделения генов биосинтеза в других метаболических процессах из высших эукариот, представляет собой комплементацию в микробных мутантах дефицита представляющей интерес активности. Для этого подхода библиотеку кДНК из высших эукариот клонируют в векторе, который может управлять экспрессией кДНК в хозяинемикроорганизме. Затем вектор трансформируют или каким-либо иным образом вводят в мутантный микроорганизм и отбирают колонии, которые фенотипически больше не являются мутантами. Эту стратегию применяли для выделения генов из высших эукариот, вовлеченных в несколько метаболических процессов, включая биосинтез гистидина (см., например, патент США 5290926 и WO 94/026909 на имя Ward и др., полностью включенных в настоящее описание в качестве ссылки), биосинтез лизина (см., например, Frish и др., Моl. Gen. Genet. 228: 287 (1991)), биосинтез пурина (см., например, Aimi и др., J.Biol. Chem. 265: 9011 (1990)) и биосинтез триптофана (см., например, Niyogi и др., Plant Cell 5: 1011 (1993)). Однако, несмотря на доступность микробных мутантов, у которых, вероятно, недостаточна активность протокса (например, Е.coli (Sasarman и др., J.Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu и др., J.Bacteriol. 174: 3953 (1992)) и Saccharomyces cerevisiae (Camadro и др., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106: 724 (1982)), применение этого метода для выделения кДНК, кодирующи х ферментативную активность протокса у эукариот. на основе доступной информации в основном непредсказуема. Для этого есть несколько причин. Во-первых, последовательность кДНК протокса эукариот может не экспрессироваться с адекватными уровнями в мутантных микроорганизмах, например, вследствие применения кодона, несовместимого с обычно предпочтительными кодонами для хозяина-микроорганизма. Во-вторых, первичный продукт трансляции из клонированной кодирующей последовательности эукариот может не произво 5 71536 6 дить функциональный полипептид, например, есрастение. Развитие устойчивости может дать возли для пост-трансляционной модификации, такой, можность обрабатывать гербицидом культурное как гликозилирование, необходима активность, растение, где его применение ранее было исклюкоторой микроорганизм не обладает. В-третьих, чено или ограничено (например, применение для протеин эукариот может оказаться неспособным предвсходовой обработки) вследствие чувствипринимать свою активную конформацию в хозяительности полезных растений к гербициду. Нане-микроорганизме, например, если протеин в пример, патент США 4761373 на имя Anderson и норме ориентирован к мембранной системе кондр. относится к устойчивости растений к различкретной органеллы, которой микробный хозяин ным гербицидам из классов имидазолинона или лишен. Эта последняя возможность особенно весульфонамида. Устойчивость обусловлена измероятна для фермента протокса растений, который нением фермента синтазы ацетооксикислоты связан в клетке растения с органеллами, отсутст(AH AS). В патенте США 4975374 на имя Goodman вующим у микробных хозяев, применяемых в меи др. описаны растительные клетки и растения, тоде комплементации. В частности фермент просодержащие ген, кодирующий мутантную глутатоке растений связан как с оболочкой мин-синтетазу (GS), устойчивую к ингибированию хлоропласта, так и с тилакоидными мембранами гербицидами, для которых известна способность (Matringe и др., J.Biol. Chem. 267: 4646 (1992)) и, ингибировать GS, например, к фосфинотрицину и вероятно, достигает указанных мембранных сиск метионинсуль-фоксимину. В патенте США тем в результате пост-трансляционного механиз5013659 на имя Bedbrook и др. описаны растения, ма ориентации, включающего как N-концевую экспрессирующие мутантн ую ацетолактат-синтазу, транзитную последовательность, так и внутренние что делает растения устойчивыми к ингибировасвойства зрелого полипептида (см., например, у нию гербицидами из класса сульфонилмочевины. Kohorn и Tobin, Plant Cell 1: 159 (1989); Li и др., В патенте США 5162602 на имя Somers и др. опиPlant Cell 3: 709 (1991); Li и др., J.Biol. Chem. 267: саны растения, толерантные к ингибированию 18999 (1992)). гербицидами циклогександионом и арилоксифеИзвестно, что фермент протоке играет опреноксипропановой кислотой. Эта толерантность деленную роль при некоторых болезненных сообусловлена изменением ацетил-СоАстояниях человека. Пациенты, страдающие от карбоксилазы (АККазы). смешанной порфирии, аутосомного доминантного Фермент протокс служит в качестве мишени расстройства, характеризующегося как нейропсидля различных гербицидных соединений. Гербихическими симптомами, так и повреждениями коциды, которые ингибируют протоке, включают жи, имеют пониженные уровни активности протокмногие различные по структуре классы молекул са (Brenner и Bloomer, New Engl. J.Med. 302: 765 (Duke и др., Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli и (1980)). Вследствие отсутствия данных о фермендр., Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193 (1992); те протоксе человека и соответствующем ему гене Matringe и др., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase и возможности для диагностики и лечения этого Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989)). расстройства в настоящее время весьма ограниЭти гербицидные соединения включают дифеничены. ловые эфиры [например, ацифлуорфен, 5-[2-хлорПрименение гербицидов для борьбы с неже4-(трифторметил)фенокси]-2-нитробензойная килательной растительностью, такой, как сорняки слота; ее метиловый эфир; или оксифлуорфен, 2или растения в сельскохозяйственных культурах, хлор-1-(3-этокси-4-нитрофенокси)-4стало почти повсеместной практикой. Соответст(трифторбензол)}, оксидиазолы (например, оксивующий рынок превышает миллиард долларов диазон, 3-[2,4-дихлор-5-(1-метилэтокси) фенил]-5ежегодно. Несмотря на такое широкое примене(1,1-диметилэтил)-1,3,4-оксадиазол-2-(3Н)-он), ние, борьба с сорняками остается для фермеров циклические имиды (например, S-23142, N-(4важной и дорогой проблемой. хлор-2-фтор-5-пропаргалоксифенил)-3,4,5,6Для эффективного применения гербицидов тетрагидрофталимид; хлорфталим, N-(4необходим достаточно жесткий контроль. Наприхлорфенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид), фенилмер, время и способ обработки и стадия развития пиразолы (например, ТНПП-этил, этил-2-[1-(2,3,4сорного растения являются важным фактором для трихлорфенил)-4-нитропиразолил-5получения хороших результатов при борьбе с окси]пропионат; М&В 39279), производные пирисорняками с помощью гербицидов. Поскольку раздина (например, LS 82-556) и фенопилат и его Оличные виды сорняков устойчивы к гербицидам, фенилпирролидино- и пиперидинкарбаматные важность получения эффективных гербицидов аналоги. Многие из этих соединений конкурентно существенно возрастает. ингибируют нормальную реакцию, катализируеК сожалению, гербициды, проявляющие более мую ферментом, вероятно, выступая в качестве высокую эффективность, предназначенные для аналогов субстрата. более широкого спектра сорняков и обладающие Вероятный механизм действия ингибирующи х ускоренным разложением в почве, могут также протоке гербицидов включает накопление в хлообладать большей фитотоксичностью для кульропласте протопорфириногена IX. Это накоплетурных растений. Одним из решений этой проние, вероятно, приводит к проникновению протоблемы была разработка культурных растений, порфириногена IX в цитозоль, где он окисляется с устойчивых или толерантных к гербицидам. Гибпомощью пероксидаздой активности в протопорриды или сорта культурных растений, устойчивые фирин IX. При экспозиции светом протопорфирин к гербицидам, позволяют применять гербициды IX может вызвать образование в цитозоле атобез сопутствующего риска повредить культурное марного кислорода. Этот атомарный кислород в 7 71536 8 свою очередь может привести к образованию друИспользуя информацию, предоставленную гих реактивных видов кислорода, которые могут настоящим изобретеним, кодирующая последовавызвать переокисление липидов и разрушение тельность ДНК для фермента протопорфириномембраны, что приводит к быстрой гибели клетки ген-оксидазы (протокса) из любого эукариота мо(Lee и др., Plant Physiol. 102: 881 (1993)). жет быть получена с использованием стандартных Не все ферменты протоксы чувствительны к методов. Таким образом, еще один предмет нагербицидам, которые ингибируют ферменты простоящего изобретения относится к зондам, спотоксы растений. Ферменты протоксы, кодируемые собным к специфичной гибридизации с эукариотигенами, выделенными как из Escherichia coli ческой последовательностью ДНК, кодирующей (Sasarman и др., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)), протопорфириноген-оксидазную активность, или с так и из Bacillus subtilis (Dailey и др., J.Biol. Chem. соответствующей мРНК, и способам обнаружения 269: 813 (1994), устойчивы к этим гербицидным указанных последовательностей ДНК в эукариотах ингибиторам. Кроме того, были описаны мутанты с использованием зондов по изобретению. одноклеточной водоросли Chlamydomonas Настоящее изобретение, кроме того, включает reinhardtii, устойчивые к фенилимидному гербициполигенные экспрессирующие кластеры и рекомду S-23142 (Kataoka и др., J.Pesticide Sci. 15: 449 бинантные векторы, содержащие эти полигенные (1990); Shibata и др., Research in Photosynthesis, экспрессирующие кластеры, которые главным том III, N. Murata, ред. Kluwer: Netherlands, стр.567образом содержат промотор, а именно, промотор, 570 (1992)). По крайней мере, один из этих мутанактивный в растении, действенным образом сцептов, как полагают, имеет измененную активность ленный с молекулой ДНК, кодирующей фермент протокса, который устойчив не только к гербицидпротопорфириноген-оксидазу (протоке) из эуканому ингибитору, по которому проходил отбор риота по изобретению. Полигенный экспрессиэтого мутанта, но также и к другим классам ингирующий кластер по изобретению может в дополбиторов протокса (Oshio и др., Z. Naturforsch. 48с: нение к этому также включать сигнальную 339 (1993); Sato и др., ACS Symposium on последовательность, действенным образом сцепPorphyric Pesticides, S. Duke, ред. ACS Press: ленную с молекулой ДНК, причем эта сигнальная Washington, D.C. (1994)). Также есть данные о том, последовательность способна направлять протечто мутантная линия клеток табака обладает усин, кодируемый молекулой ДНК, в хлоропласт или тойчивостью к ингибитору S-21432 (Che и др., Z. в митохондрию. Naturforsch. 48с: 350 (1993)). Кроме того, настоящее изобретение относится Настоящее изобретение относится к выдек растениям, клеткам растений, тканям растений и ленной молекуле ДНК, кодирующей фермент просеменам растений с измененной активностью протопорфириноген-оксидазу (протоке) из эукариота, токса, которые устойчивы или, по крайней мере, который предпочтительно представляет собой толерантны к ингибированию концентрациями высший эукариот. В частности настоящее изобрегербицида, которые в норме ингибируют естесттение относится к выделенным молекулам ДНК, венную активность протокса в растении. В частнокодирующим фермент протопорфириногенсти одними из вариантов осуществления изобреоксидазу (протоке), источником которого явлется тения являются растения, у которых измененная растение или человек. активность протокса обусловлена сверхэкспресВ соответствии с изобретением предпочтисией фермента протокса дикого типа или экспрестельными являются выделенные молекулы ДНК, сией молекулы ДНК, кодирующей толерантный к кодирующие фермент протопорфириногенгербициду фермент протоке. Этот толерантный к оксидазу (протоке) из двудольных растений, однагербициду фермент протоке может представлять ко особенно предпочтительны таковые из растесобой модифицированную форму фермента проний p.Arabidopsis, такие, как представленные в токса, которая в естественных условиях встречапоследовательностях SEQ ID NO: 1, 3 и 9. ется в эукариоте или прокариоте; или модифициТакже предпочтительными являются выдерованную форму фермента протокса, которая в ленные молекулы ДНК, кодирующие фермент естественных усло виях встречается в растении; протопорфириноген-оксидазу (протоке) из одноили толерантный к гербициду фермент протоке дольных растений, и наиболее предпочтительно может в естественных условия х встречаться в из растений кукурузы, такие, как представленные прокариоте. Растения, подпадающие под объем в последовательностях SEQ ID NO: 5 и 7. Особеннастоящего изобретения, включают однодольные но предпочтительной согласно изобретению яви двудольные растения, но, прежде всего гибридляется выделенная молекула ДНК, кодирующая ные растения. Предпочтительными являются тапротеин фермента протопорфириноген-оксидазы кие растения, которые могут представлять собой (протокса) из двудольных растений, где указанный потенциальные мишени для ингибирующих протопротеин имеет аминокислотную последовательке гербицидов, в частности такие важные сельсконость, выбранную из группы, состоящей из послехозяйственные культуры, как кукуруза и другие довательностей SEQ ID NO: 2, 4 и 10. Также предзерновые культуры, такие, как пшеница, овес, почтительной является выделенная молекула рожь, сорго, рис, ячнень, просо, густой травяной ДНК, кодирующая протеин фермента протопорпокров (дерн или газонные травы), кормовые трафириноген-оксидазы (протокса) из однодольных вы и т.п., а также хлопчатник, табак, сахарный растений, где указанный протеин имеет аминотростник, сахарная свекла, масличный рапс и соя. кислотную последовательность, выбранную из Кроме того, настоящее изобретение включает группы, состоящей из последовательностей SEQ материал для размножения растений в соответстID NO: 6 и 8. вии с изобретением, предпочтительно семена 9 71536 10 растений, обработанные защитным покрытием и, центрациях, которые обычно ингибируют встрепрежде всего защитным покрытием, содержащим чающуюся в естественных условиях активность препарат, выбранный из группы, состоящей из протокса в этом растении, эффективным количегербицидов, инсектицидов, фунгицидов, бактериством ингибирующего протоке гербицида. Растецидов, нематоцидов, моллюскицидов или их смения, подлежащие защите описанным способом, сей. прежде всего представляют собой таковые, котоНастоящее изобретение, кроме того, относитрые могут быть потенциальными мишенями для ся к способам получения растений, клеток растеингибирующих протоке гербицидов, в частности ний, тканей растений и семян растений и их транстакие важные сельскохозяйственные культуры, генного потомства, которые содержат фермент как, например, кукуруза и другие зерновые культупротоке, устойчивый или толерантный к ингибироры, такие, как пшеница, овес, рожь, сорго, рис, ванию гербицидом в концентрации, которая ингиячмень, просо, густой травяной покров (дерн или бируют естественную активность протокса. Эта газонные травы), кормовые травы и т.п., а также устойчивость или толерантность может быть похлопчатник, сахарный тростник, сахарная свекла, лучена путем экспрессии в трансгенных растениях масличный рапс и соя. Гербициды, которые отнолюбой молекулы ДНК, которая кодирует модифисятся к ингибиторам протокса, представляют соцированную форму фермента протокса, которая в бой таковые, выбранные из группы, состоящей из естественных условия х встречается в эукариоте, арилурацила, дифенилового эфира, оксидиазола, или модифицированную форму фермента протокимида, фенилпиразола, производного пиридина, са, которая в естественных условиях встречается фенопилата и О-фенилпирролидин- и пиперидинв растении, или фермент протоке, который может карбаматных аналогов этого фенопилата. в естественных условия х встречаться в прокариоНастоящее изобретение также относится к те, или фермент протоке, который представляет получению фермента протокса рекомбинантным собой модифицированную форму протеина, котопутем и способам применения полученного рерый в естественных условия х встречается в прокомбинантным путем протокса. Таким образом, кариоте. изобретение дополнительно включает клеткиКонкретный вариант осуществления изобрехозяева и прежде всего клетки, выбранные из тения относится к получению трансгенных растегруппы, состоящей из клеток растений, клеток жиний кукурузы, ткани кукурузы или семени кукурузы вотных, бактериальных клеток, дрожжевых клеток и их трансгенного потомства, которые стабильно и клеток насекомых, стабильно трансформиротрансформированы рекомбинантной молекулой ванных рекомбинантной молекулой ДНК, содерДНК, включающей пригодный промотор, функциожащей пригодный промотор, функционирующий в нирующий в растениях, действенным образом соответствующей клетке-хозяине, действенным сцепленный со структурным геном, кодирующим образом сцепленный со структурным геном, кодинемодифицированный фермент протоке прокарующим ^модифицированный или модифицирориота, который устойчив к гербициду. ванный фермент протоке эукариота, причем клетКроме того, изобретение относится к получека-хозяин обладает способностью нию трансгенных растений, клеток растений, ткаэкспрессировать эту молекулу ДНК. ней растений и семян растений и их трансгенного Настоящее изобретение, кроме того, относитпотомства, которые были стабильно трансформися к способам применения очищенного протокса рованы рекомбинантной молекулой ДНК, вклюдля скрининга новых гербицидов, которые воздейчающей пригодный промотор, функционирующий ствуют на активность протокса, и для идентифив растениях, действенным образом сцепленный со кации мутантов протокса, устойчивых к гербициду. структурным геном, кодирующим немодифицироВ частности изобретение относится к способу ванный фермент протоке эукариота. Это приводит тестирования химического соединения на его спок сверхэкспрессии немодифицированного протоксобность ингибировать активность фермента проса в растении в количестве, достаточном для претокса из растения, включающему одоления ингибирования фермента гербицидом. (а) объединение фермента протокса и протоНастоящее изобретение также включает попорфириногена IX в первой реакционной смеси в лучение растений, которые экспрессируют измеусловиях, при которых фермент протоке обладает ненный фермент протоке, толерантный к ингибиспособностью катализировать превращение пророванию гербицидом в концентрации, которая в топорфириногена IX в протопорфирин IX; нормальных условиях ингибирует активность не(б) объединение химического соединения, измененного протокса дикого типа. В этом варианфермента протокса и протопорфириногена IX во те осуществления растение может быть стабильвторой реакционной смеси в тех же условиях, что но трансформировано рекомбинантной молекулой и для первой реакционной смеси; ДНК, содержащей структурный ген, кодирующий (в) возбуждение первой и второй реакционных устойчивость протокса, или получено методами смесей волнами длиной от приблизительно 395 до направленной селекции, с помощью которых усприблизительно 410нм; тойчивые к гербициду линии выделяют, характе(г) сравнение флуоресценции первой и второй ризуют и совершенствуют. реакционных смесей при длинах волн от приблиКроме того, настоящее изобретение относится зительно 622 до приблизительно 635нм; к способу борьбы с ростом нежелательной растипричем химическое соединение обладает способтельности, включающему обработку популяции ностью ингибировать активность фермента прорастения с измененной активностью протокса, токса, если флуоресценция второй реакционной устойчивой к ингибированию гербицидом в кон 11 71536 12 смеси существенно меньше, чем флуоресценция фермент протоке, определяют из библиотеки клопервой реакционной смеси. нов кДНК, имеющей происхождение из представКроме того, в изобретении предложен способ ляющего интерес эукариота, основываясь на их идентификации модифицированного фермента способности придавать ферментативную активпротокса, устойчивого к ингибитору протокса, приность протокса мутантному организму-хозяину, сутствующего в популяции клеток, включающий имеющего дефицит этой активности. Пригодными следующие стадии организмами-хозяевами для применения в этом (а) культивирование популяции в присутствии способе являются таковые, которые могут быть ингибитора протокса в количествах, которые ингииспользованы для скрининга библиотек экспресбируют ^модифицированную форму фермента сии кДНК и для которых мутанты с дефицитом протокса; активности протокса либо доступны, либо могут (б) отбор клеток, полученных на стадии (а), быть получены традиционными способами. Такие рост которых не был ингибирован; и организмы-хозяева включают, но не ограничены (в) выделение и идентификацию фермента ими, E.coli (Sasarman и др., J.Gen. Microbiol. 113: протокса, присутствующего в клетках, о тобранных 297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu и др., на стадии (б). J.Bacteriol. 174: 3953 (1992)) и Saccharomyces cerГены, кодирующие измененный протоке, могут evisiae (Camadro и др., Biochem. Biophys. Res. применяться в качестве селектируемых маркеров Comm. 106: 724 (1982)). в методах трансформации растительной клетки. В другом варианте последовательности, кодиТаким образом, настоящее изобретение также рующие протоке эукариота, могут быть выделены включает способ селекции растений, тканей расв соответствии с хорошо известными способами, тения или клеток растения, трансформированных основанными на гомологии их последовательнопредставляющим интерес трансгеном из нести с кодирующими протоке последовательностятрансформированных растений, включающий стами по настоящему изобретению из Arabidopsis дии: thaliana (SEQ ID NO: 1, 3 и 9) и из Zea mays (SEQ (а) трансформацию растения, ткани растения ID NO: 5 и 7). В этих способах всю или часть изили клетки растения представляющим интерес вестной кодирующей протоке последовательности трансгеном, способным экспрессироваться растеприменяют в качестве зонда, который селективно нием, и геном, кодирующим измененный протоке, гибридизируется с другими кодирующими протоке устойчивый к ингибитору протокса; последовательностями, присутствующими в попу(б) перенос трансформированных таким обраляции клонированных фрагментов геномной ДНК зом растений или растительных клеток в питаили фрагментов кДНК (т.е. библиотек геномной тельную среду, содержащую ингибитор протокса; или кДНК) из выбранного организма. Такие спосои бы включают скрининг на основе гибридизации (в) отбор растений или растительных клеток, посеянных на пластинке библиотек ДНК (либо выживших в питательной среде. бляшек, либо колоний; см., например, у Sambrook Кроме того, настоящее изобретение относится и др., ред., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor к зондам и способам обнаружения присутствия и Laboratory Press, (1989)) и ПЦР-амплификацию с выявления формы гена протокса и количествениспользованием олигонуклеотидных праймеров, ной оценки уровней транскриптов протокса в оргасоответствующи х доменам последовательности, низме. Эти способы могут применяться для диагсохранившимся среди известных аминокислотных ностики болезненных состояний, связанных с последовательностей протокса (см., например, у измененной формой фермента протокса или с Innis и др., ред., PCR Protocols, A Guide to Methods измененными уровнями экспрессии фермента and Applications, Academic Press (1990)). Эти спопротокса. собы наиболее пригодны для выделения кодиОдин из предметов настоящего изобретения рующих протоке последовательностей из оргаотносится к выделеной молекуле ДНК, которая низмов, родственных организму, из которого кодирует эукариотическую форму протопорфириимеет происхождение последовательность зонда. ноген-оксидазы (обозначенную в настоящем опиНапример, следует ожидать, что применение этих сании как "протоке"), т.е. фермента, который катаспособов с использованием в качестве зонда колизирует окисление протопорфириногена IX в дирующей последовательности из Arabidopsis протопорфирин IX. Кодирующие последовательthaliana или из Zea mays будет особенно пригодно ности ДНК и соответствующие аминокислотные для выделения кодирующих протоке последовапоследовательности для ферментов протокса из тельностей из других видов растений. Arabidopsis thaliana представлены в виде послеВыделенные последовательности протокса довательностей SEQ ID NO: 1-4 и 9-10. Кодируюэукариота по настоящему изобретению могут подщие последовательности ДНК и соответствующие вергаться манипуляциям в соответствии со станаминокислотные последовательности для фердартными методами генной инженерии для досментов протокса кукурузы представлены в виде тижения любой поставленной цели. Например, последовательностей SEQ ID NO: 5-8. полная последовательность протокса или ее часЛюбая требуемая эукариотическая ДНК, кодити могут применяться в качестве зондов, способрующая фермент протоке, может быть выделена в ных к специфической гибридизации с последовасоответствии с изобретением. Один способ, кательностями, кодирующими протоке, и с сающийся выделения последовательности, кодиматричными РНК. Для достижения специфической рующей протоке эукариота, представлен в примегибридизации в различных условиях такие зонды ре 1. В этом способе клоны кДНК, кодирующей включают последовательности, которые являются 13 71536 14 уникальными среди кодирующих протоке послеСпецифичные для протокса зонды гибридизадовательностей, и предпочтительно имеют длину, ции также могут применяться для количественной по крайней мере, 10 нуклеотидов и наиболее оценки уровней мРНК протокса в организме с испредпочтительно, по крайней мере, 20 нуклеотипользованием стандартных методов, таких, как дов. Такие зонды могут применяться для амплиназерн-блоттинг. Этот метод может быть пригоден фикации и анализа, кодирующи х протоке послев качестве способа диагностики для обнаружения довательностей из выбранного организма путем измененных уровней экспрессии протокса, что хорошо известного процесса полимеразноможет быть связано с определенными вредными цепьевой реакции (ПЦР). Этот метод может быть условиями, такими, как аутосомное доминантное пригоден для выделения дополнительных кодинарушение у людей, характеризующееся как нейрующих протоке последовательностей из требуеропсихическими симптомами, так и повреждениямого организма или в качестве диагностического ми кожи, имеющих пониженные уровни активности метода для определения присутствия в организме протокса (Brenner и Bloomer, New Engl. J.Med. 302: кодирующи х протоке последовательностей и для 765 (1980)). выявления взаимосвязи измененных кодирующих Для рекомбинантного получения фермента в последовательностей с определенными вредными организме хозяина кодирующая протоке последоусловиями, такими, как аутосомное доминантное вательность может быть встроена в полигенный нарушение у имеющи х пониженные уровни активэкспрессирующий кластер, сконструированный ности протокса людей, что характеризуется как для выбранного хозяина и интродуцированный в нейропсихическими симптомами, так и повреждехозяина, где его получают рекомбинантным обраниями кожи (Brenner и Bloomer, New Engl. J.Med. зом. Выбор специфических регуляторных после302: 765 (1980)). довательностей, таких, как промотор, сигнальная Специфичные для протокса зонды гибридизапоследовательность, 5'- и 3'-нетранслируемые ции также могут быть использованы для картиропоследовательности и энхансер, может быть осувания положения нативного(ных) гена(ов) протокществлен специалистом в данной области техниса эукариота в геноме выбранного организма с ки. Полученная молекула, содержащая отдельные использованием стандартных методов, основанэлементы, сцепленные в соответствующей рамке ных на селективной гибридизации зонда с геномсчитывания, может быть встроена в вектор, споными последовательностями протокса. Эти метособный к трансформации в клетке-хозяине. Приды включают, но не ограничены ими, годные для этой цели вектры экспрессии и спосоидентификацию полиморфизмов ДНК, выявленбы рекомбинантного получения протеина хорошо ных или содержащихся внутри последовательноизвестны для организмов-хозяев, таких, как E.coli сти зонда для протокса, и применение таких по(см., например, у Studier и Moffatt, J.Моl. Biol. 189: лиморфизмов для последующего отщепления 113 (1986); Brosius, DNA, 8: 759 (989)), дрожжи гена протокса от други х маркеров с известным (см., например, у Schneider и Guarente, Meth. положением на карте в картируемой популяции, Enzymol. 194: 373 (1991)) и клетки насекомых (см., полученной в результате самооплодотворения например, у Luckow и Summers, Bio/Technol. 6: 47 гибрида двух полиморфных родительских линий (1988)). Конкретные примеры включают такие (см., например, у Helentjaris и др., Plant. Моl. Biol. плазмиды, как Bluescript (фирма Stratagene, La 5: 109 (1985); Sommer и др., Biotechniques 12: 82 Jolla, CA), pFLAG (фирма International (1992); D'Ovidio и др., Plant. Моl. Biol. 15: 169 Biotechnolosies, Inc., New Haven, CT), pTrcHis (1990)). Хотя можно ожидать, что любая последо(фирма Invitrogen, La Jolla, CA) и бакуловирусные вательность протокса эукариота будет пригодна в векторы экспрессии, например, имеющие проискачестве зонда для картирования генов протокса хождение из генома вируса ядерного полиэдроза из любого эукариота, предпочтительными зондаAutographica californica (AcMNPV). Предпочтими являются такие последовательности протокса тельной системой бакулови-рус/насекомое являиз организмов, которые наиболее близкородстются клетки pVI11392/Sf21 (фирма Invitrogen, La венны к выбранному организму, и наиболее предJolla, CA). почтительными зондами являются таковые послеПолученный рекомбинантным путем эукариодовательности протокса из выбранного организма. тический фермент протоке пригоден для различМожно ожидать, что картирование, таким образом, ных целей. Например, он может применяться для генов протокса будет наиболее целесообразным обеспечения ферментативной активности протокдля целей селекции растений. Например, на осноса in vitro. Он также может применяться в анализе ве знания о положении на генетической карте муin vitro для скрининга новых соединений с гербитантного гена протокса, который обусловливает цидной активностью, мишень для которых ранее устойчивость к гербицидам, могут быть идентине была выявлена, с целью определения, могут фицированы фланкирующие маркеры ДНК из соли они ингибировать протоке. Такой анализ in vitro ответствующей генетической карты (см., напритакже может быть применен в качестве более обмер, у Helentjaris, Trends Genet. 3: 217 (1987)). При щего скрининга для идентификации химических интрогрессии признака устойчивости к гербицидам соединений, ингибирующи х активность протокса, в новую селектируемую линию эти маркеры могут и, следовательно, являющихся потенциальными быть, затем применены для мониторинга длины гербицидами. В другом варианте полученный ресцепленной с протоксом фланкирующей хромокомбинантным путем фермент протоке может сомной ДНК, еще присутствующей в родительской применяться для дальнейшей характеризации его форме, с которой гибрид скрещивают вновь после связи с известными ингибиторами, чтобы рациокаждого круга обратного скрещивания. нально сконструировать новые ингибирующие 15 71536 16 гербициды, а также толерантные к гербицидам на протоке дикого типа в ингибиторном анализе. формы фермента. Во-вторых, ингибитор протокса дикого типа приОбычно ингибирующее действие в отношении сутствуе т в обеих реакционных смесях. В-третьих, протокса определяют путем измерения флуоресмутированную активность (ферментативная акценции при длинах волн от приблизительно 622 тивность в присутствии ингибитора и мутировандо 635нм после возбуждения длинами волн от ного протокса) и немутированную активность приблизительно 395 до 410нм (см., например, у (ферментативная активность в присутствии ингиJacobs и Jacobs, Enzyme 28: 206 (1982); Sherman и битора и протокса дикого типа) сравнивают для др., Plant Physiol. 97: 280 (1991)). Этот анализ осопределения, наблюдается ли существенное увенован на том факте, что протопорфирин IX предличение ферментативной активности в мутироставляет собой флуоресцирующий пигмент, а ванной активности по отношению к немутированпротопорфириноген IX является нефлуоресциной активности. Мутированная активность рующим. Экстракты протеина получают из выпредставляет собой любую меру ферментативной бранных субклеточных фракций, например, из активности мутированного фермента протокса в этиопластов, митохондрий, микросом или плазмаприсутствии пригодного субстрата и ингибитора. тических мембран путем дифференциального Немутированная активность представляет собой центрифугирования (см., например, Lee и др., любую меру ферментативной активности ферменPlant Physiol. 102: 881 (1993); Prado и др., Plant та протокса дикого типа в присутствии пригодного Physiol. 65: 956 (1979); Jackson и Moore в Plant субстрата и ингибитора. За достоверное увеличеOrganelles, Reid ред., стр.1-12; Jacobs и Jacobs, ние принимают увеличение ферментативной акPlant Physiol., 101: 1181 (1993)). Протопорфиринотивности, превышающее предел погрешности ген получают путем восстановления протопорфитехники измерения, предпочтительно приблизирина амальгамой натрия, как описано у Jacobs и тельно двукратное увеличение по сравнению с Jacobs (1982). Реакционные смеси обычно состоят активностью фермента дикого типа в присутствии из 100мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'ингибитора, более предпочтительно приблизи2-этансульфоновая кислота) (рН7,5), 5мМ ЭДТК, тельно пятикратное увеличение, наиболее пред2мМ ДТТ (дитиотреитол), приблизительно 2Μ пропочтительно увеличение более чем приблизитопорфириногена IX и приблизительно 1мг/мл тельно в десять раз. экстракта протеина. До начала ферментативной Гербициды, которые ингибируют протоке, реакции к экстракту фермента добавляют раствовключают многие различные по структуре классы ры ингибитора в различных концентрациях, намолекул (Duke и др., Weed Sci. 39: 465 (1991); пример, в 1мМ, 100мкМ, 10мкМ, 1мкМ, 100нМ, Nandihalli и др., Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193 10нМ, 1нМ, 100пМ. После добавления экстракта (1992); Matringe и др., FEBS Lett. 245: 35 (1989); протеина в течение нескольких минут регистрируYanase и Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 ют флуоресценцию и в области линейного изме(1989)), включая дифениловые эфиры {например, нения вычисляют тангенс угла наклона кривой ацифлуорфен, 5-[2-хлор-4-(трифторме(скорость реакции). Значение IС50 определяют тил)фенокси]-2-нитробензойная кислота; ее метипутем сравнения тангенса угла наклона реакции в ловый эфир; или оксифлуорфен, 2-хлор-1-(3условиях ингибирования с таковым в контрольной этокси-4-нитрофенокси)-4-(трифторбензол)}, оксиреакции. диазолы (например, оксидиазон, 3-[2,4-дихлор-5Другой вариант осуществления настоящего (1-метилэтокси)фенил]-5-(1,1-диметилэтил)-1,3,4изобретения включает применение протокса в оксадиазол-2-(3Н)-он), циклические имиды (наанализе по выявлению устойчивых к ингибитору пример, S-23142, N-(4-хлор-2-фтор-5мутантов протокса. Типичный анализ включает пропаргилоксифенил)-3,4,5,6следующие стадии: тетрагидрофталимид, хлорфталим, N-(4(а) инкубирование первого образца протокса и хлорфенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид), фенилего субстрата, т.е. протопорфириногена IX, в пригшразолы (например, ТНПП-этил, этил-2-[1-(2,3,4сутствии второго образца, содержащего ингибитор трихлорфенил)-4-нитропиразолил-5протокса; окси]пропионат; М&В 39279), производные пири(б) измерение ферментативной активности дина (например, LS 82-556) и фенопилат и его Опротокса из стадии (а); фенилпирролидино- и пиперидинкарбаматные (в) инкубирование первого образца мутироаналоги. ванного протокса и его субстрата в присутствии Наиболее важные дифениловые эфиры предвторого образца, содержащего тот же самый инставляют собой таковые общей формулы гибитор протокса; (г) измерение ферментативной активности мутированного протокса из стадии (в); и (д) сравнение ферментативной активности где R обозначает -COONa (формула II), мутированного протокса с таковой, обеспечиваеCONHSO2CH3 (формула III) или мой немутированным протоксом. СООСН2СООС2Н5 (формула IV; см. у Maigrot и др., Реакционная смесь и условия реакции являBrighton Crop Protection Conference-Weeds: 47-51 ются теми же, что и для анализа по выявлению (1989)). ингибиторов протокса (ингибиторный анализ) со Дополнительными, представляющими интерес следующими модификациями. Во-первых, мутант дифениловыми эфирами являются таковые, где R протокса, полученный аналогично описанному обозначает выше, заменяют в одной из реакционных смесей 17 71536 18 (формула Va; см. у Hayashi и др., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 53-58 (1989)). Дополнительным, представляющим интерес дифениловым эфиром является таковой формулы: (формула IVb; бифенокс, см. Dest и др., Proc. Northeast Weed Sci. Conf. 27:31 (1973)). Также важным является класс гербицидов, известных как амиды, имеющие общую формулу где Q обозначает (см. у Hemper и др., (1995) в "Proceedings of the Eighth International Congress of Pesticide Chemistry", Ragdaie и др., ред., Amer. Chem. Soc, Washington, D.C., стр.42-48 (1994)), и R1 обозначает Н, Сl или F, R2 обозначает Сl и R3 обозначает необязательно замещенный простой эфир, тиоэфир, сложный эфир, амино- или алкильную группу. В другом варианте R2 и R3 вместе могут образовывать 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо. Примерами имидных гербицидов, представляющих особый интерес, являются Гербицидная активность вышеуказанных соединений описана в Proceedings of 1991 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (формулы X и XVI), Proceedings of 1993 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (формулы XII и XIII), в патенте США 4746352 (формула XI) и в Abstracts of the Weed Science Society of America, том.33, стр.9 (1993) (формула XIV). Наиболее предпочтительными имидными гербицидами являются таковые, классифицированные как арилурацилы и имеющие общую формулу где R обозначает группу (С2С6алкенилокси)карбонил-С 1-С4алкил, как описано в патенте США 5183492, включенном в настоящее описание в качестве ссылки. Также важными являются гербициды, имеющие общую формулу: (см. у Miura и др., Crop Protection ConferenceWeeds: 35-40 (1993)), (см. у Weiter и др., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 29-34 (1993)); 19 71536 20 культуры, т.е. важные представители покрытосемянных и голосемянных растений, такие, как хлопчатник, соя, рапс, сахарная свекла, кукуруза, рис, пшеница, ячмень, овес, рожь, сорго, просо, густой травяной покров (дерн или газонные травы), кормовые травы, дернообразующие злаки и т.п. Под "измененной ферментативной активно(см. у Van Saun и др., Brighton Crop Protection стью протокса" понимают ферментативную активConference-Weeds: 19-22 (1993)); ность протокса, отличную от таковой, которая N-замещенные пиразолы общей формулы: встречается в растении в естественных условиях (т.е. активность протокса, которая встречается в естественных условия х в отсутствии прямого или косвенного воздействия человека на эту активность), устойчивую к гербицидам, которые ингибируют активность, встречающуюся в естественных условиях. Измененная ферментативная активность протокса может быть придана растению по изобретению путем увеличения экспрессии про(см. публикацию международных заявок WO токса дикого типа, чувствительного к гербицидам, 94/08999, WO 93/10100 и патент США 5405829, экспрессии в растении измененного, толерантного переданный фирме Schering); к гербицидам эукариотического фермента протокN-фенил пиразолы, такие, как са, экспрессии в растении немодифицированной или модифицированной бактериальной формы фермента протокса, которая является устойчивой к гербицидам, или комбинацией этих способов. Получение измененной активности фермента протокса путем увеличения экспрессии приводит к достижению уровня протокса в клетке растения, по крайней мере, достаточного для преодоления ингибирования роста, вызываемого гербицидом. Уровень экспрессируемого протокса обычно, по крайней мере, в два раза, предпочтительно в пять раз, более предпочтительно, по крайней мере, в (см. стр.621 в “The Pesticide Manual”, 9-е изд., ред. десять раз превышает количество, экспрессируеC.R.Worthing, British Crop Protection Council, Surrey мое в естественных условиях. Увеличенная экс(1991)); прессия может быть обусловлена множественныи 3-замещенные-2-арил-4,5,6,7ми копиями гена протокса дикого типа; тетрагадроиндазолы (Lyga и др., Pesticide Sci. 42: множественным распространением кодирующей 29-36 (1994)). протоке последовательности внутри гена протокса Уровни гербицида, которые обычно являются (т.е. амплификацией гена) или мутацией в некодостаточными для ингибирования активности продирующей регуляторной последовательности энтокса, соответствуют нормам расхода, известным догенного гена протокса в клетке растения. Растев данной области техники и частично зависящим ния, обладающие такой измененной от внешних факторов, таких, как окружающая среферментативной активностью, могут быть получеда, время и способ обработки. Например, в случае ны направленной селекцией в растениях. Этот имидных гербицидов, представленных формуласпособ известен в данной области техники. См., ми V-IX, ив частности таковых, представленных например, патент США 5162602 на имя Somers и формулами X-XVIII, интервал норм расхода содр., патент США 4761373 на имя Anderson и др. и ставляет от 0,0001 до 10кг/га, предпочтительно от указанные в них ссылки. Эти растения также могут 0,005 до 2кг/га. Эта норма расхода или конценбыть получены с помощью методов генной инжетрация гербицида может различаться в зависимонерии, известных в данной области техники. сти от требуемого действия и конкретного испольУвеличенная экспрессия чувствительного к зуемого соединения и может быть определена гербицидам протокса также может быть получена способами, известными в данной области техники. путем стабильной трансформации клетки растеНастоящее изобретение, кроме того, относитния рекомбинантной или химерной молекулой ся к растениям, ткани растения и семенам растеДНК, содержащей промотор, способный стимулиния, толерантным к гербицидам, которые ингибировать экспрессию связанного структурного гена в руют активность протокса, встречающуюся в этих клетке растения, сцепленного с гомологичным или растениях в естественных условиях, причем толегетерологичным структурным геном, кодирующим рантность обусловлена измененной ферментапротоке. Понятие "гомологичность" подразумевативной активностью протокса. Характерные расет, что ген протокса выделяют из организма, тактения включают любые растения, которые сономически идентичного клетке растенияобрабатывают этими гербицидами в соответствии мишени. Понятие "гетерологичность" подразумес их обычным предназначением. Предпочтительвает, что ген протокса выделяют из организма, ными являются важные сельскохозяйственные таксономически отличного от клетки растения 21 71536 22 мишени. Гомологичные гены протокса могут быть протеинами, связанными с патогенезом, наприполучены путем комплементации бактериального мер, PR-1, PR-2 и т.п. См., например, Payne и др., или дрожжевого ауксотрофного мутанта библиоPlant Моl. Biol. 11: 89-94 (1988). Примеры транзиттекой экспрессии кДНК из растения-мишени. См., ных пептидов включают транзитные пептиды хлонапример, пример 1 и у Snustad и др., Genetics ропласта, такие, как описанные у von Heijne и др., 120: 1111-1114 (1988) (глутамин-синтаза кукуруPlant Моl. Biol. 9: 104-126 (1991); Mazur и др., Plant зы); у Delaimey и др., Моl. Genet. 221: 299-305 Physiol. 85: 1110 (1987); Vorst и др., Gene 65: 59 (1990) (пирролин-5-карбоксилатредуктаза сои); у (1988), и транзитные пептиды митохондрий, такие, Frisch и др., Моl. Genet. 228: 287-293 (1991) (дикак описанные у Воutry и др., Nature 328: 340-342 гидродипиколинат-синтаза кукурузы); у Eller и др., (1987). Предполагают, что транзитные пептиды Plant Моl. Biol. 18: 557-566 (1992) (3хлоропласта и митохондрий будут наиболее приизопропилмалат-дигидрогеназа хлоропласта рапемлемы для настоящего изобретения, так как са); в Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 1731-1735 ферментативная активность протокса обычно со(1991); у Minet и др., Plant J. 2: 417-422 (1992) (дидержится в митохондриях и хлоропласте. Наибогидрооротат-дегидрогеназа) и ссылки, указанные в лее предпочтительными для применения являютэтих п убликациях. Др угие известные способы ся транзитные пептиды хлоропласта, поскольку включают скрининг библиотек геномной или кДНК существуе т предположение, что ингибирование высших растений, например, в отношении послеферментативной активности протокса в хлоропладовательностей, которые перекрестно гибридизистах является первичной основой действия ингируются с зондами специфичных нуклеиновых кибирующи х протоке гербицидов (Witkowski и слот, или скрининг библиотек экспрессии для Hailing, Plant Physiol. 87: 632 (1988); Lehnen и др., получения ферментов протокса, которые вступают Pestic. Biochem. Physiol. 37: 239 (1990); Duke и др., в перекрестную реакцию со специфичными зонWeed Sci. 39: 465 (1991)). Сюда также включены дами-антителами. Предпочтительный способ последовательности, которые приводят к локаливключает комплементацию ауксотрофного мутанзации кодируемого протеина в различных клеточта hemG Ε. coli библиотекой кДНК кукурузы или ных компартментах, таких, как вакуоли. См., наArabidopsis thaliana. пример, у Neuhaus и др., Рrос. Natl. Acad. Sci. USA Примеры промоторов, способных функциони88: 10362-10366 (1991) и Chrispeels, Ann. Rev. ровать в растениях или в клетках растений, т.е. Plant Physiol. Plant Моl. Biol. 42: 21-53 (1991). Сотаковых, способных стимулировать экспрессию ответствующие данные из этих публикаций, относвязанных структурных генов, таких, как протокса, сящиеся к настоящему изобретению, полностью в растительных клетках, включают промоторы 19S включены в данное описание в качестве ссылки. или 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) Химерная(ые) конструкция(и) ДНК по изобреи двойные промоторы CaMV; промоторы нопалинтению может (гут) содержать множественные косинтазы; промоторы протеина, связанного с патопии промотора или множественные копии струкгенезом (PR); промоторы малой субъединицы ритурных генов протокса. Кроме того, конструкция(и) булозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы (ssuRUBISCO) может (гут) включать кодирующие последовательи т.п. Предпочтительными являются промотор ности для маркеров и кодирующие последоваактина риса (McElroy и др., Моl. Gen. Genet. тельности для других пептидов, таких, как сиг231:150 (1991)), промотор убикитина кукурузы (ЕР нальные или транзитные пептиды, каждый в 0342926; Taylor и др. Plant Cell Rep. 12: 491 (1993)) соответствующей рамке считывания с другими и промотор Рr-1 из табака, Arabidopsis или кукуруфункциональными элементами в молекуле ДНК. зы (см. международную заявку PCT/IB95/00002 на Получение таких конструкций соответствует имя Ryals и др., полностью включенную в данное обычному уровню техники в данной области. описание в качестве ссылки). Также предпочтиПригодные маркеры включают пептиды, обутельными являются промотор 35S и усиленный словливающие устойчивость к гербициду, антиили двойной промотор 35S, такой, как описанный биотику или лекарству, такие, как обусловливаюу Ка у и др., Science 236: 1299-1302 (1987), и двойщие, например, устойчивость к гигромицину, ной промотор 35S, клонированный в pCGN2113, канамицину, G418, гентамицину, линкомицину, депонированный под номером АТСС 40587, котометотрексату, гли фосфа ту, фосфинотрицину или рые описаны в европейской заявке ЕР-А 0392225, т.п. Эти маркеры могут применяться для отделесоответствующие данные из которой, относящиения клеток, трансформированных химерными конся к настоящему изобретению, полностью вклюструкциями ДНК по изобретению, от чены в данное описание в качестве ссылки. Сами ^трансформированных клеток. Другими пригодпромоторы могут быть модифицированы в соотными маркерами являются пептидные ферменты, ветствии с известными в данной области техники которые можно легко обнаружить с помощью реметодиками таким образом, чтобы манипулироакции визуально, например, с помощью цветной вать длиной промотора для повышения экспресреакции, в их число входят луци фераза, βсии протокса. глюкуронидаза или β-галактозидаза. Сигнальные или транзитные пептиды могут Измененную активность фермента протокса быть слиты с последовательностью, кодирующей можно также получить путем генерирования или протоке, в химерных конструкциях ДНК по изобреидентификации модифицированных форм выдетению, чтобы направить транспорт экспрессируеленной эукариотической кодирующей протоке помого фермента протокса в требуемое место дейследовательности, имеющей, по крайней мере, ствия. Примеры сигнальных пептидов включают одно аминокислотное замещение, дополнение или таковые, сцепленные в естественных условия х с делецию, которые кодируют измененный фермент 23 71536 24 протоке, устойчивый к гербициду и ингибирующий торой устойчивые аллели встречаются в выбраннеизмененную, встречающуюся в естественных ной популяции. Подвергнутый мутагенезу семенусловиях форму (т.е. формы, встречающиеся в ной материал может быть получен из различных естественных условия х в эукариоте, не подверисточников, включая химический или физический гавшиеся манипуляциям со стороны человека лимутагенез семян или химический или физический бо непосредственно с помощью методологии ремутагенез пыльцы (см. Neuffer, в Maize for Biologiкомбинантной ДНК, либо косвенным путем с cal Research, Sheridan, изд. Univ. Press, Grand помощью избирательной селекции и т.д.). Гены, Forks, ND., стр.61-64 (1982)), которую затем прикодирующие такие ферменты, могут быть получеменяют для оплодотворения растений, после чего ны с помощью различных стратегий, известных в собирают полученные мутантные семена M1. данной области техники. Первая общая стратегия Обычно для Arabidopsis семена М2 (фирма Lehle включает технику прямого или непрямого мутагеSeeds, Tuscon, AZ), т.е. потомство семян растенеза микроорганизмов. Например, пригодный для ний, выращенных из семян, подвергнутых мутагегенетических манипулиций микроорганизм, такой, незу с помощью химических соединений, таких, как Е.coli или S.cerevisiae, может быть подвергнут как этилметансульфонат, или физических агентов, неспецифическому мутагенезу in vivo с помощью, таких, как гамма-излучение или быстрые нейтронапример, УФ-излучения или этил- или метилмены, высевают в чашки с плотностью до 10000 сетансульфоната. Методы мутагенеза описаны, намян/чашку (диаметром 10см) на минимальную пример, у Miller, Experiments in Molecular Genetics, солевую среду, содержащую соотве тствующую Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, концентрацию ингибитора для селекции на устойNY (1972); Davis и др., Advanced Bacterial Genetics, чивость. Проростки, которые продолжают расти, и Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, остаются зелеными в течение 7-20 дней после NY (1980); Sherman и др., Methods in Yeast Genetвысевания, пересаживают в почву и выращивают ics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harдо созревания и получения семян. Потомство этих bor, NY (1983); и в патенте США 4975374 (на имя семян тестируют на устойчивость к гербициду. Goodman и др.). Микроорганизм, выбранный для Если признак устойчивости является доминантмутагенеза, содержит эукариотический ген проным, растения, семена которых расщепляются в токса с нормальной чувствительностью к гербицисоотношении 3:1 (устойчивые:чувствительные), дам и зависит от активности протокса, обусловвероятно, являются гетерозиготными по гену усленной этим геном. Подвергнутые мутагенезу тойчивости в поколении М2. Растения, все семена клетки выращивают в присутствии гербицида в которых обладают устойчивостью, вероятно, явконцентрациях, которые ингибируют немодифициляются гомозиготными по гену устойчивости в рованный фермент протоке. Колонии подвергнутопоколении М2. Такой мутагенез интактных семян и го мутагенезу микроорганизма, которые в присутскрининг семян их поколения М2 также может быть ствии ингибитора растут лучше, чем осуществлен на други х вида х, например, на сое неподвергнутый мутагенезу микрорганизм (т.е. (см., например, патент США 5084082 (на имя проявляющие устойчивость к ингибитору), отбиSebastian)). Мутантные семена, которые будут рают для дальнейшего анализа. Гены протокса из подвергнуты скринингу на толерантность к гербиэтих колоний выделяют либо путем клонирования, циду, также могут быть получены в результате либо с помощью амплификации с использованием оплодотворения пыльцой, подвергнутой мутагенеполимеразно-цепьевой реакции и определяют их зу химическим или физическим агентами. последовательности. Последовательности, кодиДля подтверждения того, что генетической осрующие измененный фермент протоке, затем клоновой устойчивости является измененный ген нируют вновь в микроорганизме для подтверждепротокса, могут быть использованы два подхода. ния их способности обусловливать устойчивость к Во-первых, аллели гена протокса из растений, ингибитору. проявивших устойчивость к ингибитору, могут Второй метод получения мутантных, несущи х быть выделены с помощью ПЦР с праймерами, устойчивость к гербициду аллелей эукариотичеоснованными либо на консервативных областях в ского фермента протокса, включает прямую сепоследовательностях кДНК протокса у Arabidopsis лекцию в растениях. Например, воздействие ингии кукурузы, приведенных ниже в SEQ ID NO: 1 3, 5, битора протокса, такого, как описан выше, на 7, либо более предпочтительно на основе неизподавление роста растений, таких, как Arabidopsis, мененных последовательностей гена протокса из соя или кукуруза, может быть выявлено путем растения, использованного для получения устойпомещения семян, стерилизованных с использочивых аллелей. После секвенирования аллелей ванием известных в данной области техники медля определения присутствия мутаций в кодитодов, на чашки в простую минимальную солевую рующей последовательности аллели могут быть среду, содержащую возрастающие концентрации тестированы на их способность обусловливать ингибитора. Такие концентрации составляют устойчивость к ингибитору в растениях, в которых 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0.1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 110, были трансформированы предполагаемые, обу300, 1000 и 3000 частей на миллион (част./млн). словливающие устойчивость аллели. Эти растеСамую низкую дозу, при которой можно наблюния могут представлять собой либо растения дать воспроизводимое существенное ингибироваp.Arabidopsis, либо любое другое растение, рост ние роста, применяют для последующи х эксперикоторого чувствителен к ингибиторам. Во-вторых, ментов. гены протокса могут быть картированы на основе Мутагенез растительного материала может известных полиморфизмов длин рестрикционных быть использован для увеличения частоты, с кофрагментов (ПДРФ) (см., например, у Chang и др., 25 71536 26 Рrос. Natl. Аса. Sci. USA 85: 6856-6860 (1988); Nam неза с использованием олигонуклеотидов и др., Plant Cell 1: 699-705 (1989)). Признак устой(Hutchinson и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: чивости может быть картирован независимо с ис710-714 (1986); или с помощью различных стратепользованием тех же маркеров. Если устойчигий, основанных на ошибке включения полимеравость является следствием мутации в гене зы (см., например, Shortle и др., Proc. Natl. Acad. протокса, признак устойчивости будет расположен Sci. USA, 79: 1588-1592 (1982); Shiraishi и др., на карте в положении, неотличимом от положения Gene, 64: 313-319 (1988); и у Leung и др., гена протокса. Technique, 1: 11-15 (1989)). Колонии, которые расТретий способ получения устойчивых к гербитут в присутствии концентраций ингибитора, поциду аллелей протокса представляет собой седавляющих в нормальных условия х рост, отбиралекцию в культурах растительной клетки. Эксют и очищают п утем повторных посевов штрихом. плантаты растительной ткани, например, эмбрион, Их плазмиды очищают и тестируют на способлистовые диски и т.д., или активно растущий калность придавать устойчивость к ингибитору путем люс, или суспензию культур растения, представретрансформации их в лишенном протокса микляющего интерес, выращивают на определенной роорганизме. Затем определяют последовательсреде с отсутствием гема в присутствии возрасности ДНК протокса кДНК-вставок из плазмид, тающей концентрации ингибирующего гербицида прошедших это т тест. или аналогов ингибитора, пригодных для примеКогда аллель устойчивого к гербициду протокнения в лабораторных условиях. В различных са идентифицирован, он может быть сконструирокультурах получают различную интенсивность ван с помощью методов геннной инженерии для роста. В определенных культурах получают быстоптимальной экспрессии в культурном растении. рорастущие варианты колоний, которые продолЭта методика может включать изменение кодижают расти даже в присутствии концентраций инрующей последовательности устойчивого аллеля гибитора, вызывающих в норме подавление роста. для оптимальной экспрессии в представляющем Частота, с которой появляются такие быстрораинтерес виде культурного растения. Способы мостущие варианты, может быть увеличена путем дификации кодирующих последовательностей для обработки химическим или физическим мутагеном достижения оптимальной экспрессии в конкретных до воздействия на ткани или клетки гербицидом. видах культурных растений хорошо известны (см., Предполагаемые аллели гена протокса, придаюнапример, у Perlak и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, щие резистентность, выделяют и тестируют ана88: 3324 (1991); Koziel и др., Bio/Technol. 11: 194 логично описанному в предшествующи х абзацах. (1993)). Генетическое конструирование аллеля Аллели, которые идентифицированы как обусловпротокса для оптимальной экспрессии может такливающие устойчивость к гербициду, затем могут же включать сцепление действенным образом быть сконструированы для оптимальной экспрессоответствующи х регуляторных последовательносии и трансформированы в растении. В другом стей (т.е. промотора, сигнальной последовательварианте растения могут быть регенерированы из ности, терминатора транскрипции). Предпочтитканевых или клеточных культур, содержащих эти тельными промоторами будут те, которые аллели. обусловливают высокий уровень конститутивной Четвертый способ включает мутагенез чувстэкспрессии, или более предпочтительно те, котовительных к гербициду генов протокса дикого типа рые обусловливают высокий специфический уров бактериях или дрожжах с последующим культивень экспрессии в тканях, чувствительных к повированием микроорганизма в среде, лишенной вреждению гербицидом. гема, но содержащей ингибирующие концентраРекомбинантные молекулы ДНК могут быть ции ингибитора, и затем с отбором тех колоний, интродуцированы в растительную клетку многокоторые растут в присутствии ингибитора. Более численными известными в данной области техниконкретно кДНК растения, такую, как кДНК, кодики путями. Для специалиста в данной области рующую протоке Arabidopsis или кукурузы, клонитехники, очевидно, что выбор метода может завируют в микроорганизме, у которого первоначально сеть от типа растения, предназначенного для отсутствует активность протокса. Примеры таких трансформации, т.е. однольного или двудольного. микроорганизмов включают ауксотрофных м утанПригодные методы трансформации растительных тов Е.coli, S.typhimurium и S.cerevisiae, в том числе клеток включают микроинъекцию (Crossway и др., штамм Е.coli SASX38 (Sasarman и др., J.Gen. BioTechniques 4: 320-334 (1986)), электропорацию MicrobioL, 113: 297 (1979), штамм S.typhimurium (Riggs и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 5602TE2483 или ТТ13680 (Xu и др., J.Bacteriol., 174: 5606 (1986); трансформацию, медиируемую 3953 (1992)) и мутант дрожжей hem14-1 (Camadro Agrobacterium (Hinchee и др., Biotechnology 6: 915и др., Biochem. Biophys. Res. Comm., 106: 724 921 (1988), прямой перенос гена (Paszkowski и др., (1982)). Трансформированный микроорганизм ЕМВО J. 3: 2717-2722 (1984)) и баллистическую затем подвергают мутагенезу in vivo, такому, как бомбардировку частицами с использованием приописанный непосредственно выше, или мутагенеспособлений, поставляемых фирмами Agracetus, зу in vitro с помощью любого из нескольких химиInc., Madison, Wisconsin и Dupont, Inc. Wilmington, ческих или ферментативных методов, известных в Delaware (см., например, у Sanford и др., патент данной области техники, например, с помощью США 4945050; и McCabe и др., Biotechnology 6: бисульфита натрия (Shortle и др., Methods 923-926 (1988)). См. также у Weissinger и др., AnEnzyraol. 100: 457-468 (1983); метоксиламина nual Rev. Genet. 22: 421-477 (1988); Sanford и др., (Kadonaga и др., Nucleic Acids Res., 13: 1733-1745 Paniculate Science and Technology 5: 27-37 (1987) (1985); насыщенного сайтнаправленного мутаге(лук); Christou и др., Plant Physiol. 87: 671-674 27 71536 28 (1988) (соя); McCabe и др., Bio/Technology 6: 923трансформированных с помощью способа по изо926 (1988) (соя); Datta и др., Bio/Technology 8: 736бретению и, следовательно, состоящие, по край740 (1990) (рис); Klein и др., Ргос. Natl. Acad. Sci. ней мере, частично из трансгенных клеток, также USA, 85: 4305-4309 (1988) (кукуруза); Klein и др., являются предметом настоящего изобретения. Bio/Technology 6: 559-563 (1988) (кукуруза); Klein и До поступления в продажу материала для др., Plant Physiol. 91: 440-444 (1988) (кукуруза); размножения растений (плоды, клубни, зерна, Fromm и др., Bio/Technology 8: 833-839 (1990); и семенной материал), прежде всего семенного маGordon-Kamm и др., Plant Cell 2: 603-618 (1990) териала, в качестве коммерческого продукта его (кукуруза). обычно обрабатывают защитным покрытием, соПод объем настоящего изобретения также держащим гербициды, инсектициды, фунгициды, подпадают трансгенные растения, в частности бактерициды, нематоциды, моллюскициды или трансгенные фертильные растения, трансформисмеси нескольких эти х препаратов, при необходированные с помощью вышеуказанных способов, и мости вместе с дополнительными носителями, их бесполое и/или половое потомство, которое поверхностно-активными веществами или способсохраняет устойчивость или, по крайней мере, ствующими нанесению адьювантами, обычно толерантность к ингибированию гербицидом в применяемыми в технике получения препаративконцентрациях, которые в норме ингибируют ных форм для обеспечения защиты от повреждевстречающуюся в естественных условиях активния, вызванного бактериями, грибами или насеконость протокса в растении. Наиболее предпочтимыми-вредителями. тельными являются гибридные растения, которые Для обработки семенного материала защитустойчивы или, по крайней мере толерантны к ное покрытие может быть нанесено на семенной ингибированию гербицидом в концентрациях, коматериал либо путем пропитки клубней или зерен торые в норме ингибируют встречающуюся в есжидким составом, либо покрытием их сложной тественных условиях активность протокса в расвлажной или сухой композицией. Кроме того, в тении. особых случаях возможно использование других Трансгенное растение по изобретению может способов обработки растений, например, путем быть двудольным или однодольным растением. направленной обработки почек или плода. Предпочтительны однодольные растения семейСеменной материал растения по изобретества злаковых (Graminaceae), включающие растению, содержащий последовательность ДНК, кодиния p.p.Loliura, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, рующую протеин из эукариота, обладающего акSaccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, тивностью протопорфириноген-оксидазы (протоке) Secale и Setaria. по изобретению, может быть обработан защиНаиболее предпочтительными являются щающим семенной материал покрытием, содертрансгенные кукуруза, пшеница, ячмень, сорго, жащим соединение для обработки семенного марожь, овес, дернообразующие травы и рис. териала, такое, как, например, каптан, карбоксин, Среди двудольных растений наиболее предтирам (TMTD®), металаксил (Apron®) и пиримипочтительными в контексте настоящего изобретефос-метил (Actellic®), а также другие соединения, ния являются соя, хлопчатник, табак, сахарная которые обычно применяют для обработки семенсвекла, масличный рапс и подсолнечник. ного материала. Термин "потомство" включает потомство Таким образом, еще один предмет настоящетрансгенных растений, полученное как "беспого изобретения относится к материалу для разлым", так и "половым" путем. Под это понятие множения растений, предназначенному для культакже подпадают все мутанты и сорта, получаетивируемых растений, и прежде всего к мые с помощью известных способов, таких, как, семенному материалу растения, которое обрабанапример, слияние клеток или селекция мутантов, тывают защищающим семенной материал покрыи которые еще проявляют характерные свойства тием, обычно применяемым для обработки сеисходного трансформированного растения наряду менного материала. со всеми продуктами скрещивания и слияния Если устойчивый к гербициду аллель протокса трансформированного растительного материала. получают п утем прямой селекции в культурном Еще один предмет изобретения относится к растении или в культуре растительной клетки, из пролиферационному материалу трансгенных раскоторой может быть регенерировано культурное тений. растение, он может быть перенесен в коммерчеПод пролиферационным материалом трансские сорта с использованием традиционных спогенных растений в контексте настоящего изобресобов селекции для получения толерантной к гертения понимают любой растительный материал, бициду культуры без необходимости который может быть размножен половым или бесгенетического конструирования аллеля и его полым путем in vivo или in vitro. Наиболее предтрансформации в растении. В другом варианте почтительными согласно настоящему изобретеаллель устойчивости к гербициду может быть вынию являются протопласты, клетки, каллюсы, делен, подвергнут генетическому конструироваткани, органы, семена, эмбрионы, пыльца, яйцению для оптимальной экспрессии и затем трансклетки и зиготы наряду с любым другим материаформирован в требуемом сорте. лом для размножения, полученным из трансгенГены, кодирующие измененный протоке, усных растений. тойчивый к ингибитору протокса, также могут приЧасти растений, такие, как, например, цветки, меняться в качестве селектируемых маркеров в стебли, плоды, листья, корни, развившиеся у способах трансформации растительной клетки. трансгенных растений или у их потомства, ранее Например, растение, растительная ткань или рас 29 71536 30 тительныеклетки, трансформированные трансгеProtox-3, в векторе pFL61, был депонирован ном, могут также быть трансформированы геном, 10 июня 1994г. под обозначением pWDC-5 (NRRL кодирующим измененный протоке, способный №B-21280). быть экспрессированным растением. ТрансфорpMzC-lVal, в векторе pBluescript SK, был депомированные таким образом клетки переносят в нирован 30 сентября 1994г. под обозначением содержащую ингибитор протокса среду, в которой pWDC-8 и получил каталожный номер NRRL будут выживать только трансформированные №21340. клетки. Ингибиторы протокса, которые, вероятно, pAraC-2Cys, в векторе pFL61, был депониродолжны быть наиболее приемлемы в качестве ван 14 ноября 1994 г. под обозначением pWDC-7 и селектирующи х агентов, представляют собой диполучил каталожный номер NRRL №21339N. фениловые эфиры {например, ацифлуорфен, 5-[2Примеры хлор-4-(трифторметил)фенокси]-2Стандартные рекомбинантные ДНК и способы нитробензойная кислота; ее метиловый эфир; или молекулярного клонирования, применяемые в оксифлуорфен, 2-хлор-1-(3-этокси-4настоящем исследовании, хорошо известны в нитрофенокси)-4-(трифторбензол)}, оксидиазолы данной области техники и описаны у Т.Maniatis, (например, оксидиазон, 3-[2,4-дихлор-5-(1E.F.Fritsch и J.Sambrook в Molecular Cloning: A метилэтокси)фенил]-5-(1,1-диметилэтил)-1,3,4Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, оксадиазол-2-(3Н)-он), циклические имиды (наCold Spring Harbor, NY (1982), и у Τ.J.Silhavy, MX. пример, S-23142, Ν-(4-хлор-2-фтор-5Berman и L.W.Enquist, Experiments with Gene пропаргилоксифенил)-3,4,5,6Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring тетрагадрофталимид; хлорфталим, N-(4Harbor, NY (1984). хлорфенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид), фенилПример 1: Выделение кДНК Arabidopsis, кодипиразолы (например, ΊΉΠΠ-этил, этил-2-[1-(2,3,4рующих гены протокса путем функциональной трихлорфенил)-4-нитропиразолил-5комплементации мутанта Е.coli. окси]пропионат; М&В 39279), производные пириПолучали и амплифицировали библиотеку дина (например, LS 82-556) и фенопилат и его ОкДНК Arabidopsis thaliana (фирма Landsberg) в фенлпиролидино- и пиперидинкарбаматные анаплазмидном векторе pFL61 (Minet и др., Plant J. 2: логи. Способ применим к любой растительной 417-422 (1992)). Приобретали вторую библиотеку клетке, способной быть трансформированной изкДНК Arabidopsis (фирма Columbia) в векторе мененным геном, кодирующим протоке, и может лямбда UniZap (фирма Stratagene) и амплифицибыть применен для любого представляющего инровали в качестве плазмид pBluescript путем мастерес трансгена. Экспрессия трансгена и гена сового исключения in vivo исходного фага. Полупротокса может стимулироваться одним и тем же чали мутант hemG штамма Е.coli SASX38 промотором, функционирующим в растительных (Sasarman и др., J.Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)) клетках, или различными промоторами. и поддерживали на L-среде, содержащей 20мг/мл Ниже изобретение более подробно поясняетгематина (фирма United States Biochemicals). ся на примерах. Эти примеры приведены только Плазмидные библиотеки трансформировали в для иллюстрации и не ограничивают объем изоSASX38 путем электропорации с использованием бретения, если не указано иное. прибора Bio-Rad Gene Pulser в условиях, рекоДепонирование мендованных производителем. Клетки высевали Следующие молекулы векторов для целей на L-arap, содержащий 100мг/мл ампициллина, с процедуры патентования были депонированы в плотностью приблизительно 500000 трансфорколлекции культур Службы сельскохозяйственных мантов/чашку диаметром 10см. Клетки инкубироисследований (NRRL), Северный региональный вали при 37°С в течение 40 часов при слабой осисследовательский центр (Nothern Regional вещенности и отбирали на основе способности Research Center, 1815 North university Street, расти без добавления экзогенного гема. ГемPeoria, Illinois 61604, USA) в указанное ниже врепрототрофов выделяли из библиотеки pFL61 с мя. частотой 400/107 и из библиотеки pBluescript с Protox-1, в векторе pBluescript SK, был депочастотой 2/107. ДНК плазмиды выделяли из 24 нирован 5 апреля 1994г. под обозначением pWDCколоний для анализа последовательности. Каж2 (NRRL №B-21238). дую из 24 колоний повторно трансформировали в Protox-2, в векторе pFL61, был депонирован 5 SASX38 для проверки способности к комплеменапреля 1994г. под обозначением pWDC-1 (NRRL тации. №B-21237). Анализ последовательности выявил наличие MzProto x-1, в векторе pBluescript SK, был дедвух классов предполагаемых клонов протокса. понирован 20 мая 1994 г. под обозначением Девять из них относились к типу, обозначенному pWDC-4 (NRRL №В-21260) и представлен в по"Protox-1". Каждый имел происхождение из одного следовательности SEQ ID NO: 5. и того же гена, а два представляли собой полноMzProto x-1, в векторе pBluescript SK, был поразмерные клоны. кДНК имеет длину 1719 пар вторено депонирован 11 июля 1994г. под обознаоснований и кодирует протеин с молекулярной чением pWDC-4 (NRRL №B-21260N) и представмассой 57,7кДа. N-концевая пептидная последолен в последовательности SEQ ID NO: 5. вательность имеет признаки, характерные для MzProto x-2, в векторе pBluescript SK, был детранзитного пептида хлоропласта, состоящего из понирован 20 мая 1994г. под обозначением приблизительно 60 аминокислот. Исследование pWDC-3 (NRRL №B-21259) и представлен в побазы данных с помощью программы GAP следовательности SEQ ID NO: 7. (Deveraux и др., Nucleic Acids Res. 12: 387-395 31 71536 32 (1984) выявило гомологию с протеином hemY Arabidopsis на нуклеотидном уровне и идентичен (протоке) В. subtilis (Hansson и Hederstedt, 1992, на 58% (подобие на 76%) на аминокислотном Dailey и др., J.Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Два уровне (см. таблицу 2). Клон из кукурузы имеет Nпротеина были подобны на 53% и идентичны на концевую последовательность, которая на 30 31% с областями высокой гомологии, включая аминокислот длиннее, чем таковая в клоне предполагаемый домен связывания динуклеотида Arabidopsis. Так же, как и для клонов Arabidopsis, протеина hemY (Dailey и др., J.Biol. Chem. 269: 813 гомология между двумя генами протокса кукурузы (1994)). довольно низка, идентичность между последоваДругие 15 клонов кДНК относились к типу, тельностями двух протеинов составляет только обозначенному "Protox-2". По-видимому, они так31%. же происходят от одного гена. Вероятно, полноMzProto x-1, в векторе pBluescript SK, депониразмерная кДНК имеет длину 1738 пар оснований рованный 20 мая 1994г. под обозначением pWDCи кодирует протеин с молекулярной массой 4 (NRRL №В-21260), представлен в последова55,6кДа. Конец, содержащий аминогруппу, в опретельности SEQ ID NO: 5. деленной мере характерен для митохондриальноMzProto x-1, в векторе pBluescript SK, повторно го транзитного пептида. Протеин Protox-2 имеет депонированный 11 июля 1994г. под обозначениограниченную гомологию с Protox-Ι (подобие на ем pWDC-4 (NRRL №B-21260N), представлен в 53%, идентичность на 28%) и с протоксом последовательности SEQ ID NO: 5. В.subtilis (подобие на 50%, идентичность на 27%). MzProto x-2, в векторе pBluescript SK, депониProtox-1, в векторе pBluescript SK, был депорован 20 мая 1994г. под обозначением pWDC-3 нирован 5 апреля 1994г. под обозначением pWDC(NRRL №B-21259), представлен в последователь2 (NRRL №В-21238). ности SEQ ID NO: 7. Protox-2, в векторе pFL61, был депонирован 5 Пример 3: Выделение дополнительных генов апреля 1994г. под обозначением pWDC-1 (NRRL протокса на основе гомологии последовательно№B-21237). сти с известными последовательностями, кодикДНК Arabidopsis, кодирующие Protox-Ι, сорующими протоке держащийся в pWDC-2, и Protox-2, содержащийся Библиотеку фага или плазмиды высевают с в pWDC-Ι, приведены ниже в последовательноплотностью приблизительно 10000 бляшек на стях SEQ ID NО: 1 и 3 соотве тственно. чашки Петри диаметром 10см и после выращиваПример 2: Выделение кДНК кукурузы, кодиния растений в течение ночи при 37°C осуществрующих гены протокса, путем функциональной ляют съем бляшек при помощи фильтра. Съемы комплементации мутанта Е.coli. бляшек зондируют с помощью одной из кДНК, У фирмы Stratagene приобретали библиотеку представленных в SE.Q ID NO: 1,3,5 или 7, меченкДНК кукурузы Zea mays (имбредная линия В73) в ной по 32Р-дЦТФ методом рассеянной затравки с векторе лямбда UniZap и превращали в библиотеиспользованием набора PrimeTime (фирма ку pBluescript путем массового исключения in vivo. International Biotechnologies, Inc. New Haven, CT). Вторую библиотеку кДНК, сделанную по заказу в Применяют следующие условия гибридизации: векторе UniZap, приобретали у фирмы Clontech и 7%-ный додецилсульфат натрия (ДСН), 0,5Μ аналогичным образом превращали в плазмиды NaPO4 с рН7,0, 1мМ ЭДТК при 50°С. После гибриpBluescript. Выбор функциональных генов протокдизации в течение ночи фильтры промывают са из кукурузы осуществляли аналогично описан2´SSC, 1%-ным ДСН. С помощью авторадиограному выше в примере 1 для библиотек фии выявляют положительно гибридизирующиеся Arabidopsis. бляшки. После очистки до получения отдельных Из библиотеки фирмы Stratagene выделяли бляшек выделяют вставки кДНК и их последовадва гем-прототрофа в 10 трансформантах, облательность определяют с помощью метода термидающих способностью к рекомплементации, и нации цепи с использованием дидезоксисеквенировали. Эти кДНК были идентичными и терминаторов, меченных флуоресцентными краоказались гомологичными Protox-1 Arabidopsis. сителями (Applied Biosystems, Inc., Foster City, C A). Этот клон кукурузы, обозначенный как MzProtox-1, Стандартный протокол эксперимента, описанявляется неполным. кДНК имеет длину 1698 пар ный выше, может быть использован специалистом оснований и кодирует только предполагаемый в данной области техники для получения генов зрелый фермент протоке; в ней нет последовапротокса с последовательностями, гомологичнытельности транзитного пептида и нет кодона иними известным последовательностям, кодирующим циации метионина. Ген идентичен на 68% гену протоке, из любого другого эукариота, в частности Protox-1 Arabidopsis на нуклеотидном уровне и из других видов высших растений. идентичен на 78% (подобие на 87%) на аминокисУпорядоченное расположение предсказанных лотном уровне (см. таблицу 1). аминокислотных последовательностей соответстИз библиотеки фирмы Clontech выделяли вующи х протеинов, кодируемых последовательодин гем-прототроф в 107 трансформантах, обланостями, представленными в SEQ ID NO: 2 и 6, дающий способностью к рекомплементации, и приведено в таблице 1. Упорядоченное располосеквенировали. кДНК, по-видимому, является жение предсказанных аминокислотных последополной, имеет длину 2061 пар оснований и кодивательностей соответствующих протеинов, кодирует протеин с молекулярной массой 59кДа. Этот руемых последовательностями, представленными клон является характерным для кукурузы гомолов SEQ ID NO: 4 и 8, приведено в таблице 2. гом Protox-2 Arabidopsis, и его обозначили как MzProto x-2. Ген идентичен на 58% гену Protox-2 33 71536 34 Таблица 1 Срав нение аминокислотных последов ательностей Protox-1 Arabidopsis (SEQ ID NO: 2) и кукурузы (SEQ ID NO: 6) Процент подобия: 87,137. Процент идентичности: 78,008. Protox-1.Pep x MzProtox-1.Pep Идентичные остатки обозначены с помощью вертикальных черточек между двумя последовательностями. Упорядочивание осуществляют с помощью программы GAP, описанной у Deveraux и др., Nucleic Acids Res. 12: 387-395 (1984). Таблица 2 Срав нение аминокислотных последов ательностей Protox-2 Arabidopsis (SEO ID NO: 4) и кукурузы (SEO IP NO: 8) Процент подобия: 75,889. Процент идентичности: 57,905. Protox-2.Pep x MzProtox-2.Pep Пример 4: Выделение загрязненного дрожжами клона Protox из библиотеки кДНК Arabidopsis Для идентификации любых редких кДНК, обладающих активностью протокса, осуществляли второй скрининг библиотеки Arabidopsis в векторе pFL61 таким же образом, как это описано выше, получая вновь сотни комплементирующи х клонов. Приблизительно 600 из них помещали индивидуально на сетчатые пластинки и инкубировали при 28°C в течение 18 часов. Осуществляли двукратные съемы с фильтра на мембраны для скрининга колоний/бляшек (фирма NEN) в соответствии с инструкциями производителя. кДНК Protox-1 и Protox-2 удаляли из их векторов путем разложения с помощью EcoRI/XhoI и NotI соответственно. Вставки разделяли с помощью гельэлектрофореза в 1,0%-ной легкоплавкой агарозе SeaPlaque GTG (фирма FMC), вырезали и метили по Ρ путем рассеянной затравки (Life Technologies). Один набор съемов гибридизировали с каждым зондом. Условия гибридизации и промывки соответствовали таковым, описанным у Church и Gilbert, 1984. Колонии (-20), которые не проявили выраженную гибридизацию с Protox-1 или с Protox-2, амплифицировали в жидкой культуре и получали ДНК плазмиды. ДНК разлагали с помощью NotI, два экземпляра образцов разгоняли на 1%-ном агарозном геле и подвергали саузерн-блоттингу на фильтре типа Gene Screen Plus [фирма NEN (New England Nuclear)]. Зонды двух известных генов Protox метили и гибридизировали по описанной выше методике. Было обнаружено два идентичных клона, которые не представляли собой ни Protox-1, ни Protox-2. Было установлено, что такой клон рекомплементирует мутант SASX38, хо тя он растет очень медленно, и он был обозначен как Protox-3. Protox-3 в векторе pFL61 был депонирован 10 июня 1994г. под обозначением pWDC-5 (NRRL №В-21280). Было установлено, что эта кодирующая последовательность должна иметь происхождение из ДНК дрожжей, которые присутствуют в качестве побочного загрязнителя в библиотеке кДНК Arabidopsis. ДНК дрожжей, кодирующая Protox-З, входящая в pWDC-5, представлена ниже в виде SEQ ID NO: 9. Пример 5: Демонстрация чувствительности клона протокса растения к ингибирующим протоке гербицидам в бактериальной системе Жидкие культуры Protox-1/SASX38, Proto x2/SASX38 и pBluescript/XLl-Blue выращивали в среде L аmp100. Аликвоты объемом сто микролит 35 71536 36 ров каждой культуры высевали в среду L amp100, ошибке включения полимеразы (см., например, у содержащую различные концентрации (1,0нМShortle и др., Рrос. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 158810мМ) ингибитора протокса, а именно, гербицида 1592 (1982); Shiraishi и др., Gene 64: 313-319 из класса арилурацила формулы XVII. Двойные (1988); и у Leung и др., Technique 1: 11-15 (1989))]. наборы чашек инкубировали в течение 18 часов Ожидаемые позитивные мутанты промотора при 37°C либо при слабом освещении, либо в вследствие мутагенеза всей плазмиды исключают полной темноте. путем повторного клонирования кодирующей поШтамм Е.coli протоке+ XLl-Blue не проявил следовательности в векторе дикого типа и почувствительности к гербициду при любой изученвторного тестирования. Если предполагается, что ной концентрации, что согласуется с опубликоболее высокая экспрессия приведет к лучшему ванными данными об устойчивости нативного бакросту в отсутствии гербицида, то возможен также териального фермента к аналогичным визуальный скрининг кодирующей последовагербицидам. Protox-1/SASX38 проявил выражентельности мутантов. ную чувствительность к гербициду, причем "газон" Любые гены протокса растений, экспрессибактерии почти полностью уничтожался конценрующие устойчивость к гербициду в бактериальтрациями ингибитора ниже 10нМ. Protox-2/SASX38 ной системе, могут быть сконструированы для также оказался чувствительным, но только к бооптимальной экспрессии и трансформированы в лее высокой концентрации (10мМ) гербицида. растениях с применением стандартных методов, Воздействие гербицида на оба штамма протокса приведенных в данном описании. Затем получениз растений было более сильным при слабой осные растения могут быть обработаны гербицидом вещенности, но также проявлялось на чашках, для подтверждения и количественной оценки содержавшихся в полной темноте. Токсичность уровня устойчивости, обусловливаемого введенгербицида полностью элиминировалась при доным геном протокса. бавлении в чашки 20мг/мл гематина. Пример 7: Конструкции для экспрессии в расРазличная толерантность к гербициду между тениях устойчивого(вых) к гербициду гена(ов) продвумя штаммами протокса из растений, вероятно, токса микроорганизма является скорее результатом различной экспресКодирующие последовательности для гена сии из этих двух плазмид, чем любым присущим протокса В subtilis hemY (Hansson и Hederstedt, ему различием в чувствительности фермента. J.Bacteriol. 174: 8081 (1992); Dailey и др., J.Biol. Protox-1/SASX38 растет существенно медленнее, Chem., 269: 813 (1994)) и для гена протокса Е.coli чем Protox-2/SASX3S в любой среде с дефицитом hemG (Sasarman и др., Can. J.Microbiol. 39: 1155 гема. Кроме того, штамм MzProto x-2/SASX38, (1993)) выделяли из лабораторных штаммов пусравнимый по скорости роста с Protox-1/SASX38 тем ПЦР-амплификации с применением стандартArabidopsis, также является очень чувствительным ных условий и фланкирующи х праймеров, сконстк более низким концентрациям гербицида (10руированных из опубликованных 100нМ). Первичная характеризация клона Protox-3 последовательностей. Известно, что эти гены кодрожжей показала, что он также чувстви телен к дируют устойчивые к гербициду формы фермента гербициду. протокса. Пример 6: Селекция на устойчивость генов Применяя стандартные методики перекрыпротокса растений к гербицидам-ингибиторам вающего ПЦР-слияния (Ausubel и др., Current протокса в системе экспрессии Е.coli Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Ингибирование ферментов протоксов растеInc. (1994)), оба бактериальных гена сливали с ний в бактериальной системе пригодно для крупдвумя различными последовательностями транномасштабного скрининга мутаций, обусловлизитного пептида хлоропласта Arabidopsis (CTP). вающи х устойчивость к гербициду в генах Первый представлял собой СТР из синтазы ацерастений. Первичные эксперименты по выявлетоксикислоты (AHAS, Ma zur и др., Plant Physiol. 85: нию зависимости доза-реакция, сделанные путем 1110 (1987)), который должен обеспечивать имвысевания жидких культур, дали появление высопорт в строму хлоропласта. Второй имел проиской частоты "устойчивы х" колоний даже к высоким хождение из гена пластоцианина Arabidopsis концентрациям гербицида. Эта устойчивость не (Vorst и др., Gene 65: 59 (1988)), который имеет была обусловлена плазмидой, как показал анализ состоящий из двух частей транзитный пептид. ретрансформации/чувствительности к гербициду. Аминоконцевая часть этого СТР ориентирует проПлазмиды, трансформирующие протоке в мутанте теин в хлоропласт, где конец с карбоксильной SASX38 и высеянные непосредственно на чашки, группой направляет его в мембраны тилакоида. содержащие гербицид, почти полностью устраняВсе четыре гибридных гена клонировали за проли эту фоновую проблему. мотором 2X35S в бинарном векторе экспрессии, Плазмиды с протоксом растительного происсконструированном для получения трансгенных хождения мутируют различными способами, исрастений путем трансформации агробактерии. пользуя опубликованные методы химического муПосле выделения кДНК протокса Arabidopsis и тагенеза [например, с помощью бисульфита кукурузы транзитный пептид хлоропласта из натрия (Shortle и др., Methods Enzymol. 100: 457Protox-1 или MzProtox-1 также может быть слит с 468 (1983)); метоксиламина (Kadonaga и др., двумя бактериальными протеинами протокса споNucleic Acids Res. 13: 1733-1745 (1985)); насыщенсобом, описанным выше. ного сайт-специфического мутагенеза (Hutchinson Векторы, описанные выше, могут быть, затем и др., Рrос. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 710-714 трансформированы в требуемых видах растений, (1986)); или различных стратегий, основанных на а полученные трансформанты могут быть проана 37 71536 38 лизированы в отношении увеличенной устойчивоpCIB200protox, трансформируют в штамм A. сти кгербициду. tumefaciens CIB542. См., например, у Ukness и др., Пример 8: Смена домена генов Plant Cell, 5: 159-169 (1993). Arabidopsis/B.subtilis для получения химерного, Листовые диски Nicotiana tabacum cv. Xanthiустойчивого к гербициду протокса nc заражают штаммом А. tumefaciens CIB542, неОдним из способов, который может быть иссущим pCIB200IGPD, как описано у Hoersch и др., пользован для получения гена протокса, как облаScience, 227: 1229, (1985). Устойчивые к канамидающего устойчивостью к гербициду, так и споцину проростки из 15 независимых листовых диссобного обеспечивать эффективную ков переносят в среду для выращивания, затем ферментативную активность протокса в растении, пересаживают в почву и полученные растения является слияние части(ей) бактериального и расвыращивают в теплице до созревания. Семена от тительного генов протокса. Полученные химерные этих растений собирают и проращивают в агарогены могут быть, затем подвергнуты скринингу для вой среде MS, содержащей канамицин. Большое выделения тех, которые способны обеспечить количество проростков, устойчивых к канамицину активность устойчивого к гербициду протокса в от каждого независимого первичного трансфорклетке растения. Например, последовательности манта выращивают в теплице до созревания и пептида протокса Arabidopsis и В.subtilis (hemY) в затем собирают их семена. Эти семена проращидостаточной степени колинеарны с областями вают в агаровой среде MS, содержащей канамивысокой гомологии. Кодирующую последовательцин. ность hemY клонируют в pBluescript и тестируют Линии растения, дающие проростки, облана ее способность экспрессировать активность дающие исключительной устойчивостью к канаустойчивого к гербициду протокса в SASX38. Химицину, являются гомозиготными по встроенному мерные гены Protox-1/hemY конструируют с пригену и их подвергают дальнейшему исследоваменением методики слияния на основе ПЦР с понию. Листовые диски каждой из 15 независимых следующим обратным лигированием в вектор трансгенных линий вырезают с помощью бумажpBluescript. Исходный обмен осуществляют приного пуансона и помещают на агаровую среду MS, близительно в середине протеинов. Эти гибриды содержащую различные увеличивающиеся контестируют на функционирование протокса путем центрации гербицида, ингибирующего протоке. комплементации и затем анализируют в отношеЧерез три недели два набора из 10 дисков от нии устойчивости к гербициду путем высевания в каждой линии взвешивали и регистрировали ресреду с гербицидом, применяя интактные Protox-1 зультаты. Трансгенные линии, более устойчивые к и hemY в качестве контроля. действию ингибитора, чем нетрансформированПример 9: Получение толерантных к гербициные растения дикого типа, отбирают для дальду растений с помощью сверхэкспрессии генов нейшего анализа. протокса растения Из листьев каждой из этих линий экстрагируют Для экспрессии протеина Arabidopsis или куРНК. Общую ДНК из каждой независимой гомозикурузы в трансгенных растениях соответствующую готной линии и из нетрансгенных контрольных полноразмерную кДНК встраивали в вектор эксрастений разделяют с помощью электрофореза пресии pCGN1761ENX, имеющий происхождение на агарозном геле в присутствии формальдегида из pCGN1761, следующим образом. pCGN1761 (Ausubel и др., Current Protocols in Molecular разлагали в его уникальном сайте EcoRI и лигироBiology, Wiley & Sons, New York (1987)). Гель нановали с фрагментом двухцепочечной ДНК, вклюсят на найлоновую мембрану (Ausubel и др., вычающим два олигонуклеотида, имеющих последоше) и гибридизируют с радиоактивно меченной вательности 5'-ААТ ТАТ GAC GTA ACG TAG GAA кДНК протокса Arabidopsis. Условия гибридизации ТТА GCG GCC CGC ТСТ CGA GT-3' (SEQ ID NO: и смыва являются теми же, которые описаны у 11) и 5'-ААТ TAG TCG AGA GCG GCC GCG ААТ Church и Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: ТСС ТАС GTT ACG ТСА Т-3' (SEQ ID NO: 11). По1991-1995 (1984). Остаток на фильтре подвергают лученная плазмида pCGN1761ENX содержала авторадиографии и определяют интенсивные поуникльные сайты EcoRI, NotI и Xhol, расположенлосы РНК, соответствующие трансгену протокса, ные между дублированным промотором 35S из во все х толерантных к гербициду линиях трансвируса мозаики цветной капусты (Кау и др., генных растений. Science 236: 1299-1302 (1987) и 3'Для дальнейшей оценки устойчивости линий нетранслируемыми последовательностями гена со сверхэкспрессией протокса растения выращиtml Agrobacterium tumefaciens. Эту плазмиду развают в теплице и обрабатывают различными конлагают и лигируют с фрагментом, образованным в центрациями ингибирующего протоке гербицида. результате разложения рестриктазой одной из Пример 10: Выращивание суспензионных плазмид, несущей кДНК протокса, так, чтобы она культур клеток табака несла полную кДНК протокса. Из этой плазмиды Среда вырезают фрагмент Xbal, содержащий кДНК проМХ1: Эта среда состоит из среды Murashiga и токса Arabidopsis, фланкируемую дублированным Skoog ("MS", Т.Murashiga и др., Physiol. Plant. 15: промотором 35S и 3'-нетранслируемыми последо473-497, 1962), содержащей основные соли, повательностями гена tml А. tumefaciens. Этот фрагбочные соли и Fe-ЭДТК (фирма Gibco №500-1117; мент Xbal встраивают в бинарный вектор рСІВ200 4,3г/л), 100мг/л миоинозитола, 1мг/л никотиновой в его уникальном сайте Xbal, расположенном мекислоты, 1мг/л пиридоксина-НСl, 10мг/л тиаминажду пограничными последовательностями Т-ДНК. НСl1, 2-3г/л сахарозы, 0,4мг/л 2,4Полученную плазмиду, обозначенную как дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,04мг/л кине 39 71536 40 тина, рН5,8. Среду стерилизуют путем автоклавималом объеме жидкой среды по верхней поверхрования. ности отвердевшей среды. Добавляют равное N6: Эта среда включает макроэлементы, микколичество теплой жидкой агаровой среды (1,2роэлементы и Fe-ЭДТК, как описано у С-С. Chu и 1,6% агара), выдерживавшейся в расплавленном др., Scientia Sinica, 18: 659 (1975), и следующие состоянии при приблизительно 40°C, и чашку сраорганические соединения: пиридоксин-НСl зу же осторожно приводят во вращение, чтобы (0,5мг/л), тиамин-HCL (0,1мг/л), никотиновую киравномерно распределить клетки по поверхности слоту (0,5мг/л), глицин (2,0мг/л) и са харозу среды и смешать клетки и агаровую среду до того, (30,0мг/л). Раствор автоклавируют. Окончателькак среда отвердеет. ное значение рН равно 5,6. В другом варианте клетки смешивают с расПримечание: макроэлементы готовят в виде плавленной агаровой средой до распределения маточного раствора 10-кратной концентрации, а по поверхности среды для селекции. Этот метод микроэлементы в виде маточного раствора 1000имеет то преимущество, что клетки внедряются и кратной концентрации. Маточный раствор витамииммобилизируются в тонком слое отвердевшей на обычно готовят в 100-кратной концентрации. среды на верхней поверхности среды для селекСуспензию культивируемых клеток линии S3 ции. Это дает возможность лучшей аэрации клеNicotiana tabacum (Harms и DiMaio, J.Plant PhysioL, ток по сравнению с клетками, внедренными в весь 137: 513-519, 1991) выращивают в жидкой среде объем, составляющий 20-30мл. для культивирования МХ1. 25мл среды МХ1, соПример 12: Получение культур клеток табака, держащейся в 100мл колбах Эрленмейера, инокутолерантных к гербицидному ингибитору протокса, лируют 10мл культуры клеток, предварительно путем выращивания клеток в жидкой среде для выращенных в течение 7 дней. Клетки инкубируют селекции при 25°C в темноте на вращающемся шейкере при Клетки, выращенные аналогично описанному 100об/мин (с амплитудой 2см). Клетки пересевают в примере 10, инокулируют в пригодной конценс 7-дневными интервалами путем инокулирования трации клеток в жидкую среду МХ1, содержащую аликвотного образца в свежую среду с помощью необходимую концентрацию гербицидного ингибидекантирования или пипетирования приблизитора протокса. Клетки инкубируют и выращивают тельно 90% суспензии клеток с последующим попо описанной в примере 10 методике. Через 7-10 полнением свежей средой для получения требуедней клетки пересевают соответствующим обрамого объема суспензии. В течение 10 дней роста зом в зависимости от скорости роста, применяя, после инокуляции 250-350мг клеток получают 5-8г свежую среду, содержащую необходимую конценсырой массы клеток. трацию ингибитора. Пример 11: Получение культур клеток табака, В зависимости от концентрации ингибитора толерантных к гербицидным ингибиторам протокрост клеток может быть менее интенсивным, чем са, путем выращивания клеток на отвердевшей при отсутствии ингибитора. среде для селекции Пример 13: Получение культур клеток табака с Клетки предварительно выращивают аналоповышенными уровнями фермента протокса гично описанному в примере 10. Клетки собирают Для получения культур клеток или каллюса с путем седиментации или путем кратковременного повышенными уровнями фермента протокса сусцентрифугирования при 500xg и удаляют испольпензионные культуры клеток или каллюс поэтапно зованную среду. Затем клетки разбавляют свежей переносят в среду со все более высокими конценсредой для культивирования для получения плоттрациями гербицидного ингибитора протокса. В ности клеток, достаточной для высевания клеток частности осуществляют следующие этапы. на чашках и составляющей приблизительно 10000 Колонии клеток, образовавшихся из высеянколониеобразующи х единиц на мл. Для высевания ных клеток в соответствии с примером 11, переноклетки в малом объеме среды (приблизительно сят в жидкую среду МХ1, содержащую такую же 1мл) равномерно распределяют по верхней поконцентрацию ингибитора протокса, которая была верхности отвердевшей среды для культивироваиспользована при селекции в соответствии с приния (МХ1, 0,8% агара), содержащей необходимую мером 11, чтобы образовать суспензионные кульконцентрацию ингибитора. Используют приблизитуры. В другом варианте отобранные суспензионтельно 20-30мл среды на чашку Петри диаметром ные культуры клеток, полученные в соответствии 10см. Пригодную концентрацию ингибитора опрес примером 12, пересевают в жидкую среду МХ1, деляют на основе кривой доза-реакция (пример содержащую такую же концентрацию ингибитора 14), и она является по крайней мере в два раза протокса, которая была использована для селеквыше, чем IС50 для чувствительных клеток дикого ции в соответствии с примером 12. типа. Культуры пересевают 1-20 раз с недельными Чашки с культурой, содержащие клетки, расинтервалами и затем пересевают в среду МХ1, пределенные на среде для селекции, инкубируют содержащую следующую более высокую конценпри нормальных условия х для роста при 25-28°C в трацию гербицида. Клетки выращивают для полутемноте до образования колоний. Образовавшиечения 1-10 пассажей в среде, содержащей эту ся колонии клеток переносят в свежую среду, соболее высокую концентрацию гербицида. Затем держащую ингибитор в необходимой концентраклетки переносят в среду МХ1, содержащую слеции. дующую более высокую концентрацию гербицида. В предпочтительной модификации описанного В другом варианте кусочки отобранного калметода предварительно выращенную суспензию люса в соответствии с примером 11 переносят в культивируемых клеток сначала распределяют в отвердевшую среду МХ1, дополненную до необ 41 71536 42 ходимой концентрации гербицида. Перенос в сретойчивых к гербициду, как описано в примерах 11 ду с более высокой концентрацией осуществляют и 13, переносят на отвердевшую среду для кульв соответствии с методикой, описанной в предытивирования каллюса, содержащую различные дущем абзаце, за исключением того, что испольконцентрации гербицида. Относительный рост зуют о твердевшую среду. определяют после 2-6-недельного культивироваПример 14: Измерение роста клеток в зависиния путем взвешивания кусочков каллюса и сравмости от дозы в суспензионных культурах нения с ростом культуры в контроле в среде без Для получения кривой доза-реакция опредегербицида. Однако метод с использованием сусляют рост клеток при различных концентрациях пензии более предпочтителен вследствие его богербицида. Суспензионные культуры чувствительлее высокой точности. ных к гербицидному ингибитору протокса клеток Пример 15: Определение перекрестной толеS3 табака дикого типа и толерантных к гербициду рантности селектированных или трансгенных клеток S3 и Для определения степени, в которой клетки толерантных к гербициду селектированных или проявляют толерантность по отношению к аналотрансгенных клеток предварительно выращивают гичным или другим гербицидам, повторяют опив жидкой среде, как описано в примере 11, до высанную в примере 14 методику по выращиванию сокой плотности клеток в течение 2-4 дней. Клетки клеток во все возрастающих концентрациях выотмывают от использованной среды и добавляют бранных гербицидов. Для цели сравнения для свежую среду без гербицида для получения необкаждого гербицида определяют относительный ходимой плотности клеток (приблизительно 150мг рост клеток и его значение IC50. сырого веса (СВ) клеток на мл суспензии). Затем Пример 16: Определение стабильности фенообразец суспензии клеток объемом 2,5мл, содертипа толерантности к гербициду с течением врежащий приблизительно 250-300мг СВ клеток, иномени кулируют в приблизительно 30мл жидкой среды с Для определения, сохраняется ли со временеобходимой концентрацией гербицида, содернем фенотип толерантности к гербициду культуры жащейся в колбе Эрленмейера объемом 100мл. клеток, клетки переносят из среды, содержащей Предпринимают соответствующие меры, чтобы гербицид, в среду без гербицида. Клетки выращиинокулировать одинаковое количество клеток в вают по описанной в примере 10 методике в откаждую колбу. Каждая колба содержит одинакосутствие гербицида в течение 3 месяцев, примевый объем среды. На одну концентрацию гербиняя регулярный пересев через соответствующие цида инокулируют 3-6 колб-дубликатов. Конценинтервалы времени (7-10 дней для суспензионных трацию гербицида выбирают из следующего ряда: культур; 3-6 недель для культур каллюса). Затем ноль (=контроль), 0,1част./млрд, 0,3част./млрд, определенные количества клеток переносят об1част./млрд, 3част./млрд, 10част./млрд, ратно в среду, содержащую гербицид, и культиви30част./млрд, 100част./млрд, 300част./млрд, руют в течение 10 дней (суспензионные культуры) 1000част./млрд, 3000част./млрд и или 4 недель (культуры каллюса). Относительный 10000част./млрд. В момент инокуляции отбирают рост определяют согласно описанному в примере несколько образцов инокулированных клеток для 14. определения массы клеток, инокулированных в Пример 17: Индукция и культивирование эмодну колбу. бриогенного каллюса из ткани щитка кукурузы Затем клетки инкубируют для роста в контроПочатки растений самоопыляющейся кукурузы лируемых условиях при 28°C в темноте в течение инбредной линии Funk 2717 собирают через 12-14 10 дней. Клетки собирают путем сливания. содердней после опыления. Удаляют листовую обертку, жимого каждой колбы на диск из фильтровальной и початки стерилизуют в течение 15 минут при бумаги, присоединенный к всасывающему устройвстряхивании в 20%-ном растворе коммерчески ству для удаления всей жидкости и получения доступного отбеливателя Chlorox с добавлением массы достаточно сухих свежих клеток. Опреденескольких капель детергента для лучшего смачиляют массу свежих клеток. Сухую массу образца вания. Затем початки промывают несколько раз можно определить после высуши вания. стерильной водой. Все дальнейшие стадии осуОпределяют рост клеток, выражают в виде ществляют в асептических условиях в стерильном прироста клеток за 10 дней, а также в виде провытяжном шкафу с потоком воздуха. Эмбрионы цента по отношению к росту клеток при отсутствии длиной 1,5-2,5мм удаляют из зерен с помощью гербицида в соответствии со следующей формушпателя и помещают, направляя ось эмбриона лой: (конечная масса клеток, выращенных с привниз, в среду для культивирования MS, содержасутствием гербицида, минус масса инокулята щую 2,4-дихлор феноксиуксусную кислоту (2,4-Д) в концентрации 2мг/л и 3%-ную сахарозу, отвердж´100, деленная на конечную массу клеток, выраденную с помощью 0,24%-ного Gelrite®. щенных без гербицида, минус масса инокулята). Значения IС50 определяют из графика, построенЭмбриогенный каллюс образуется на ткани щитка эмбрионов в течение 2-4 недель роста ного по этим данным (относительная масса клеток культуры при 28°C в темноте. Каллюс удаляют из по отношению к концентрации гербицида). Значеэксплантата и переносят в свежую отвердевшую ние IС50 представляет собой концентрацию гербисреду MS, содержащую 2,4-Д в концентрации цида, при которой рост клеток составляет 50% от роста клеток в контроле (клетки, выращенные в 2мг/л. Пересев эмбриогенного каллюса повторяют с недельными интервалами. Пересевают только отсутствие гербицида). части каллюса, имеющие эмбрионогенную морВ модификации этого метода несколько кусочфологию. ков каллюса, полученных из культуры клеток, ус 43 71536 44 Пример 18: Селекция культур клеток кукурузы, ции 2мг/л и ингибитор протокса в концентрации, толерантных к гербицидным ингибиторам протокдостаточной для замедления роста, но которая не са оказывает вредного воздействия на эмбрионогена) Селекция с применением эмбрионогенного ность культуры. Культуры выращивают на шейкекаллюса ре при 120об/мин при 28°C в темноте. С недельЭмбрионогенный каллюс, полученный по меными интервалами среду удаляют и добавляют тодике из примера 17, переносят в среду для подсвежую. Культуры разбавляют средой для культидержания каллюса, состоящую из среды N6, совирования в соответствии с их ростом так, чтобы держащей 2,4-Д в концентрации 2мг/л, 3%-ную поддерживать концентрацию, равную приблизисахарозу и ингибитор протокса в концентрации, тельно 10мл объема упакованных клеток в 50мл достаточной для замедления роста, но которая не среды. При каждом пересеивании культуры обоказывает вредного воздействия на эмбрионогенследуют и со храняют для дальнейшего культивиность культуры, и отверждают с помощью Gelrite®. рования только быстро растущие культуры с неДля увеличения частоты мутаций, толерантных по обходимой рыхлой эмбрионогенной морфологией. отношению к гербициду, культуры предварительно После двух-десяти пересевов в среду, содержаобрабатывают до селекции химическим мутагещую N6, культуры увеличиваются в объеме, по ном, например, этилметансульфонатом, или фикрайней мере, в два-три раза после каждого ежезическим мутагеном, например, УФ-излучением, в недельного пересева. концентрации, немного ниже той, для которой Затем культуры переносят в среду N6, содерпроявляется ингибирование роста, как описано в жащую 2,4-Д в концентрации 2мг/л и дозу ингибипримере 14. Культуры инкубируют в темноте при тора, в три раза более высокую, чем та, которая 28°С. Через 14 дней роста каллюс переносят в применялась первоначально. Растущие культуры свежую среду такого же состава. Пересевают повторно пересевают в эту среду еще два-десять только культуры, имеющие необходимую эмбриораз, как описано выше. Для дальнейшего пересеногенную морфологию, известную как морфология ва отбирают быстро растущие культуры с необхотипа II хрупкого эмбрионогенного каллюса. Кульдимой рыхлой эмбрионогенной морфологией. Затуры размножают путем пересева с недельными тем быстро растущие культуры переносят в среду интервалами, пересевая от двух до десяти раз в N6, содержащую 2,4-Д в концентрации 2мг/л и свежую среду, причем пересевают только наибодозу ингибитора, в десять раз более высокую, чем лее быстро растущие культуры. Затем быстро та, которая применялась превоначально, и прорастущий каллюс переносят в среду для поддерцесс пересева растущи х культур с требуемой жания каллюса. содержащую ингибирующий прорыхлой эмбрионогенной морфологией повторяют токе гербицид в требуемой концентрации, как опиот двух до десяти раз до те х пор, пока не будут сано в примере 11. Если каллюс растет хорошо получены быстро растущие культуры. Затем эти при этой концентрации, обычно после приблизикультуры переносят в среду N6, содержащую 2,4тельно пятидесяти еженедельных пересевов калД в концентрации 2мг/л и дозу ингибитора, в трилюс переносят в среду для поддержания каллюса, дцать раз более высокую, чем та, которая примесодержащую в три раза более высокую конценнялась первоначально. трацию ингибитора, и продолжают пересевание Для регенерации растений из каждой из эмдо получения хорошо растущей культуры. Это брионогенных суспензионных культур, селектиропроцесс повторяют, применяя среду, содержащую ванных определенным уровнем концентрации ингибитор протокса в концентрации, в 10 раз прегербицида, культуры сначала переносят в среду вышающей начальную пригодную концентрацию, N6, отвержденную с помощью Gelrite® и содержаа затем среды, содержащие в 20 и в 40 раз более щую 2,4-Д в концентрации 2 мг/л и необязательно высокие концентрации. ингибитор в концентрации, при которой выращиКогда получено достаточное количество калвали культуры, для получения эмбрионогенного люса, его переносят в среду для регенерации, каллюса. Эмбрионогенный каллюс пересевают в пригодную для созревания эмбриона и регенерасвежую среду для поддержания каллюса до тех ции растения. Эмбрионогенный каллюс, растущий пор, пока не будет получено необходимое для при каждой из исследованных концентраций геррегенерации количество каллюса. Пересевают бицида, переносят в среду для регенерации. только культуры с требуемой рыхлой эмбрионоб) Селекция с применением эмбрионогенных генной морфологией. суспензионных культур Пример 19: Регенерация растений кукурузы из Эмбрионогенные суспензионные культуры инселектированных каллюсных или суспензионных бредной линии 2717 кукурузы Funk создают анакультур логично методике из примера 24 и поддерживают Растения регенерируют из селектированных путем пересева с недельными интервалами в культур эмбрионогенного каллюса, полученных свежую жидкую среду N6, содержащую 2,4-Д в аналогично примеру 13, путем переноса в свежую концентрации 2мг/л. Для увеличения частоты мусреду для регенерации. Применяемыми средами таций, толерантных к гербициду, культуры в это для регенерации являются: среда N60, состоящая время могут быть обработаны химическим мутаиз среды N6, в которой отсутствует 2,4-Д, либо геном, например, этилметансульфонатом в конN61. состоящая из среды N6, содержащей 2,4-Д в центрации, немного ниже той, при которой проявконцентрации 0,25мг/л и кинетин (6ляется ингибирование роста, как это указано в Фур фуриламинопурин) в концентрации 10мг/л, примере 14. Для селекции культуры переносят в либо N62, состоящая из среды N6, содержащей жидкую среду N6, содержащую 2,4-Д в концентра2,4-Д в концентрации 0,1мг/л и кинетин в концен 45 71536 46 трации 1мг/л, все отверждаемые с помощью (1984)). Ниже описано конструирование двух ти0,24%-ного Gelrite®. Культуры выращивают при пичных векторов. 28°С на свету (освещение белыми флуоресцентКонструирование векторов рСlВ200 и ными лампами, дающими 10-100 мкэйнштейнов/м рСIB2001 с в течение 16 часов в день). Культуры пересеваБинарные векторы рСlВ200 и рСlВ2001 исют в свежую среду каждые две недели. Проростки пользуют для конструирования рекомбинантных образуются на 3-8 неделях. Проростки высотой, векторов с применением Agrobacterium и их констпо крайней мере, 2см отделяют из прилипшего руировали следующим образом. pTJS75kan созкаллюса и переносят в среду, стимулирующую давали путем разложения pTJS75 (Schmidhauser & рост корней. Используют различные стимулируюHelinski, J. Bacteriol., 164: 446-455 (1985)) с помощие рост корней среды. Среда состоит из среды щью Narl, позволяющей вырезать ген устойчивоN6 или MS, в которой отсутствуют ви тамины и в сти к тетрациклину, с последующей инсерцией которой содержится либо обычная концентрация фрагмента Accl из pUC4K, несущей NPTII (Messing солей, либо концентрация солей уменьшена на& Vierra, Gene, 19: 259-268 (1982); Bevan и др., половину, концентрация сахарозы уменьшена до Nature, 304: 184-187 (1983); McBridge и др., Plant 1г/л и, кроме того, могут либо отсутствовать ростMolecular Biology, 14: 266-276, (1990)). Линкеры Xhol лидировали с EcoRV-фрагментом плазмиды регулирующие соединения либо содержаться aнафталинуксусная кислота в концентрации рСlВ7, содержащим левую и правую границы ТДНК, селектируемый в растении химерный ген 0,1мг/л. Когда корни разовьются в достаточной nos/nptll и полилинкер pUC (Rothstein и др., Gene, мере, проростки переносят в смесь для горшеч53: 153-161 (1987)), и клонировали фрагмент, разных культур, состоящую из вермикулита, мохового ложенный с помощью Xhol, в pTJS75, разложенторфа и садовой почвы. При трансплантации весь оставшийся каллюс удаляют, весь агар смывают, ном с помощью Sall, для создания рСIB200 (см. также европейскую заявку ЕР 0332104. пример 19 и листья обрезают наполовину. Проростки выра[1338]). рСIB200 содержит следующие уникальные щивают в теплице сначала закрытыми на нескольполилинкерные сайты рестрикции: EcoRI, SstI, ко дней перевернутыми пластмассовыми чашками Kpnl, Bglll, Xbal и SaIl. pCIB2001 представляет содля сохранения влажности и выращивания в условиях затенения. После акклиматизации растебой производное от рСIВ200, которое создано путем встраивания в полилинкер дополнительных ния пересаживают в цветочные горшки и выращисайтов рестрикции. Уникальными сайтами рествают до созревания. Применяют удобрение Peters рикции в полилинкере рСIB2001 являются EcoRI, 20-20-20 (фирма Grace Sierra) для развития здоSstI, Kpnl, Bglll, Xbal. SaIl, MluU, BslI, Avrll, Apal, ровых растений. После зацветания растения опыляют, предпочтительно путем самоопыления. Hpal и Stul. В дополнение к тому, что рСIВ2001 содержит эти уникальные сайты рестрикции, он Пример 20: Конструирование векторов транстакже имеет избирательность по отношению к формации растения канамицину в растениях и бактериях, левую и Для трансформации растения пригодны мноправую границы Т-ДНК для трансформации, обугие векторы трансформации, а гены по изобретению могут быть использованы в сочетании с люсловленной Agrobacterium, функцию trfA, имеющую происхождение из RK2, для мобилизации бым из таких векторов. Выбор вектора для между Е.coli и другими хозяевами, и функции OriT применения будет зависеть от предпочтительного и OriV, также имеющие происхождение из RK2. способа трансформации и вида-мишени для Полилинкер рСIВ2001 пригоден для клонирования трансформации. Для определенных видовмишеней могут быть предпочтительны различные полигенных экспрессирующи х кластеров, содержащих их собственные регуляторные сигналы. антибиотические или селективные в отношении Конструирование рСIB10 и ее производных на гербицида маркеры. Маркеры селекции, обычно основе селекции гигромицином применяемые при трансформации, включают ген Бинарный вектор рСІВ10 содержит ген, кодиnptll, который придает устойчивость к канамицину и родственным антибиотикам (Messing & Yierra, рующий устойчивость к канамицину для селекции в растениях, правую и левую пограничные послеGene, 19: 259-268 (1982); Bevan и др., Nature 304: довательности Т-ДНК и включает последователь184-187 (1983)), ген bar, который придает устойчиности из плазмиды pRK252 с широким спектром вость к гербициду фосфинтрицину (White и др., хозяев, что позволяет осуществлять репликацию Nucl. Acids Res., 18: 1062 (1990), Spencer и др., Theor. Appl. Genet, 79: 625-631 (1990)), ген hph, как в Е.coli, так и в Agrobacterium. Его конструкция описана у Rothstein и др., Gene, 53: 153-161, который придает устойчивость к антибиотику гиг(1987)), Были сконструированы различные произромицину (Blochinger & Diggelmann, Моl. Cell Biol., водные рСІВ10, которые включают ген устойчиво4: 2929-2931) и ген dhfr, который придает устойчисти к гигромицин-В-фосфотрансферазе, описанвость к метотрексату (Bourouis и др., ЕМВО J., 2(7): 1099-1104 (1983)). ные у Gritz и др., Gene, 25: 179-188, (1983)). Эти производные дают возможность осуществлять (1) Конструирование векторов, пригодных для селекцию клеток трансгенных растений либо тольтрансформации Agrobacterium ко по устойчивости к гигромицину, либо по устойДля трансформации с применением чивости к гигромицину и канамицину (pCIB715, Agrobacterium tumefaciens пригодны многие векторы. Они обычно несут, по крайней мере, одну поpCIB717) (Rothstein и др., Gene, 53: 153-161, (1987)). граничную последовательность Т-ДНК и включают (2) Конструирование векторов, пригодных для такие векторы, как pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res., трансформации без использования Agrobacterium. 47 71536 48 Трансформация без использования пар оснований, кодирующий ген дигидрофолатAgrobacterium дает возможность обойти требоваредуктазы типа II из Е.coli, также амплифицирование наличия последовательностей Т-ДНК в выли с помощью ПЦР и эти два ПЦР-фрагмента собранном векторе трансформации, и, следоваединяли с фрагментом SacI-PstI из рВl221 (фирма тельно, векторы, в которых отсутствуют эти Clontech), содержащим основной вектор pUC19 и последовательности, могут быть использованы в терминатор нопалин-синтазы. Сборка этих фрагдополнение к векторам, таким, как описанные выментов давала плазмиду pSOG19, содержащую ше и которые содержат последовательности Тпромотор 35S, слитый с последовательностью ДНК. Способы трансформации, которые не осноинтрона 6, лидером GUS, геном DHFR и терминаваны на использовании Agrobacterium, включают тором нопалин-синтазы. Замена лидера GUS в трансформацию с помощью бомбардировки часpSOG19 на лидерную последовательность из витицами, поглощение протопласта (например, с руса хлоротической пятнистости кукурузы (MCMV) помощью ПЭГ и электропорации) и микроинъекдавала вектор pSOG35. pSOG19 и pSOG35 несут цию. Выбор вектора в значительной степени завиген pUC резистентности к ампициллину и имеют сит от предпочтительного выбора трансформисайты Hindlll, SphI, PstI и EcoRI, пригодные для руемых видов. Ниже описаны конструкции клонирования чужеродных последовательностей. некоторых типичных векторов. pSOG10 Конструирование рСIB3064 Данный вектор экспрессии β-глюкуронидазы рСiВ3064 представляет собой вектор, имею(GUS) получали из плазмиды рВl121, поставляещий происхождение из pUC и пригодный для мемой фирмой Clonetech Laboratories, Palo Alto, тодов прямого переноса гена в сочетании с селекCalifornia. Интрон 6 гена Adh1 кукурузы амплифицией гербицидом basta (или фосфинотрицином). цировали с помощью ПЦР из плазмиды рВ428, Плазмида рСIВ246 включает промотор 35S CaMV, описанной у Beimetzen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. действенным образом слитый с геном GUS Е coli, USA, 81: 4125-4128, (1987), с применением олигои терминатор транскрипции 35S CaMV, и она опинуклеотидных праймеров SON0003 и SON0004: сана в заявке WO 93/07278. Промотор 35S этого SON0003: 5'вектора содержит два кодона ATG 5' последоваCTCGGATCCAGC AGATTCGAAGAAGGTAC AG-3', тельности в сайте инициации. Эти сайты подверSON0004: 5'гали мутации с использованием стандартных ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG-3'. ПЦР-методик таким образом, чтобы удалить кодоПродукт ПЦР-реакции разлагали с помощью ны ATG и образовать сайты рестрикции Sspl и рестрикционной эндонуклеазы ВаmHI, расщепPvuII. Новые сайты рестрикции находились на ляющей сайт BamHI, добавленный на 5'-конце расстоянии 96 и 37 пар оснований от уникального каждого ПЦР-праймера. Полученный фрагмент сайта SaIl и на расстоянии 101 и 42 пар оснований ДНК очищали на агарозном геле и лигировали в от действительного сайта инициации. Полученное сайте BamHI плазмиды рВl121, который находится производное рСIВ246 обозначили как рСIВ3025. между промотором CaMV35S и геном GUS. ЛигиЗатем ген GUS вырезали из рСIВ3025 путем разрованную ДНК трансформировали в Е.соli и путем ложения с помощью SaIl и Sad, концы "затупляли" рестрикционного разложения идентифицировали и повторно лигировали для образования плазмиклоны с интроном 6 Adh1 в той же ориентации, что ды рСIB3060. Плазмида рJIT82 была получена из и ген GUS. John Innes Center, Norwich, и из нее вырезали pSOG19 фрагмент Smal длиной 400 пар оснований, содерДанный вектор экспрессии дигидрофолатжащий ген bar из Streptomyces viridochromogenes, редуктазы (DHFR) получали путем слияния прои встраивали в сайт Hpal плазмиды рСIB3060 мотора 35S и интрона 6 гена Adh1 плазмиды (Thompson и др., ЕМВО J., 6: 2519-2523, (1987)). pSOG10 с геном DHFR из плазмиды рНСО, опиЭто позволяло получить плазмиду рСIВ3064, сосанной у Bourouis и Jarry, ЕМВО J., 2: 1099-1104, держащую ген bar, находящийся под контролем (1983). Промотор 35S и интрон 6 гена Adh1 полупромотора 35S CamV и терминатора для селекции чали путем ПЦР-амплификации фрагмента из гербицидом, ген fro устойчивости к ампициллину плазмиды pSOG10 с использованием праймеров (для селекции в Е.coli) и полилинкер с уникальныSON0031 и SON0010: ми сайтами SphI, PstI, Hindlll и BamHI. Этот вектор SON0031: 5'пригоден для клонирования полигенных экспресCATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC-3', сирующи х кластеров растения, содержащих их SON0010: 5'собственные регуляторные сигналы. AGCGGATAAC AATTTCAC AC AGGA-3'. Конструирование PSOG19 и dSOG35 Полученные фрагменты разлагали с помощью pSOG35 представляет собой вектор трансрестрикционных эндонуклеаз PstI и BspHI и очиформации, который использует дигидрофолатщали на агарозном геле. редуктазу (DHFR) Е.coli в качестве селектируемоКодирующие области DHFR получали с помого маркера, придающего устойчивость к метотрекщью ПЦР-амплификации рНСО с использованием сату. Применяли ПЦР для амплификации промопраймеров SON0016 и SON0017; тора 35S (~800 пар оснований), интрона 6 из гена SON0016: 5'кукурузы Adh1 (~550 пар оснований) (Lou и др., GCTACC ATGGCCAC ATAGAAC ACC-3', Plant J., 3: 393-403, 1993; Dennis и др., Nucl. Acids SON0017: 5'Res., 12: 3983-4000, 1984) и 18 пар оснований неCGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG-3'. транслируемой лидерной последовательности GUS из плазмиды pSOG10. Фрагмент длиной 250 49 71536 50 Полученный фрагмент разлагали с помощью Sacl-фрагмента. Это привело к получению вектора рестрикционных эндонуклеаз Nsol и Sad и очищаpSOG33, который имеет генную структур у: промоли на агарозном геле. тор Adh-интрон 6 Adh1-лидерная последовательДва описанных выше фрагмента лигировали в ность MCMV-кодирующая область DGFRфрагменте вектора, полученного из плазмиды терминатор Nos с сайтом BgHI между промотором рВl121 путем разложения с помощью рестрикции интроном и с сайтом SacI между кодирующей онных эндонуклеаз PstI и Sacl и очистки на агаобластью и терминатором. Фрагмент Ncol-SacI розном геле фрагмента длиной 3 т.п.н., содержавыделяли с помощью разложения рестрикционной щего область терминатора Nos и область pUC19 эндонуклеазой и очистки на агарозном геле и липлазмиды рВl121. Это тройное лигирование погаровали в сайты BamHI и SacI вектора pSOG30, зволило слить промотор 35S, интрон 6 Adh1, ген замещая гибридную стр уктуру интрон 6 Adh1DGFR и терминатор Nos в правильном порядке и лидерная последовательность MCMVориентации для функциональной экспрессии в кодирующая область GUS вектора pSOG30 на растениях. структур у интрон 6 Adh1-лидерная последоваPSOG20 тельность MCMV-кодирующая область DGFR векДанный вектор экспресии GUS получали из тора pSOG33. pSOG10 путем инсерции лидера вируса хлоротиПример 21: Конструирование полигенных эксческой пятнистости кукурузы (MCMV), описанного прессирующи х кластеров растений у Lommel и др., Virology, 181: 382-385 (1991), в Генные последовательности, предназначеннетранслируемую лидерную последовательность ные для экспрессии в трансгенных растениях, гена 35S-GUS с помощью тройного лигирования. сначала объединяют в полигенные экспрессиСинтезировали и отжигали обе цепочки лирующие кластеры за пригодным промотором и в дерной последовательности капсидного протеина обратном направлении по отношению к пригодноMC MV длиной 17 пар оснований плюс соответстму терминатору транскрипции. Эти полигенные вующие сайты эндонуклеазной рестрикции. Полуэкспрессирующие кластенры затем легко могут ченный двухцепочечный фрагмент разлагали с быть перенесены в векторы трансформации распомощью ВаmHI и Ncol и очищали на акриламидтений, описанные выше в примере 19. ном геле. Выбор промотора Кодирующую область гена GUS амплифициВыбор промотора, используемого в полигенровали с помощью ПЦР с использованием прайных экспрессирующи х кластерах, будет опредемеров SON0039 и SON0041 и плазмиды рВl121 в лять пространственную и временную схему экскачестве матрицы: прессии трансгена в трансгенном растении. SON0039:5'Выбранные промоторы будет экспрессировать CGAC ATGGTACGTCCTGTAGAAACCCAC A-3', трансгены в определенных типах клеток (таких, SON0041: 5'как эпидермальные клетки листа, мезофильные ATCGC AAGACCGGC AAC AGGATTC-3'. клетки, клетки коры корня) или в определенных Эти праймеры добавляли сайт Ncol к 5'-концу тканях или органах (например, в корнях, листьях GUS и сайт Sacl к 3'-концу GUS. Полученный или цветках), и этот выбор должен отражать трефрагмент разлагали с помощью рестрикционных буемую локализацию экспрессии трансгена. В эндонуклеаз Ncol и Sacl и очищали на агарозном другом варианте выбранный промотор может стигеле. мулировать экспрессию гена под воздействием Ген GUS удаляли из плазмиды pSOG10 путем индуцируемого светом или регулируемого другими разложения рестрикционной эндонуклеазой Sacl и временными параметрами промотора. Еще одним частичного разложения рестрикционной эндонукальтернативным вариантом является таковой, леазой BamHI. Полученный вектор, который имел когда выбранный промотор представляет собой сайт BamHI и сайт Sacl, в который повторно промотор, регулируемый химическими агентами. встраивают кодирующую область за промотором Это будет обеспечивать возможность индуциро35S-интроном 6 Adh1, очищали на агарозном геле. вать экспрессию трансгена только тогда, когда Описанные выше три фрагмента лигаровали требуется, и вызывать ее путем обработки химипутем тройного лигирования для получения гибческим индуцирующим агентом. ридного гена, имеющего структур у: промотор 35SТерминаторы транскрипции интрон 6 Adh1-лидерная последовательность Широкое разнообразие терминаторов трансMC MV-GUS-терминатор Nos, все на основе вектокрипции доступно для применения в полигенных ра pUC19. экспрессирующих кластерах. Они ответственны за pSOG35 прекращение транскрипции позади трансгена и DGFR-селектируемый вектор-маркер идентиего правильное полиаденилирование. Соответстчен pUC19, за исключением того, что MCMVвующие терминаторы транскрипции и те, которые, лидера встраивают в нетранслируемый лидер как известно, обладают способностью функционигена DGFR для усиления трансляции. Эту операровать в растениях, включают терминатор 35S цию осуществляли в две стадии. Сначала кодиCaMV, терминатор tm1, терминатор нопалинрующую область гена GUS в pSOG32, векторе, синтаза, терминатор Е9 rbcS гороха. Они могут идентичном pSOG30, за исключением того, что он применяться как в однодольных, так и в двудольчаще содержит модифицированный промотор ных растениях. Adh, чем 35S, замещали кодирующей областью Последовательности для усиления или регуDGFR из pUC19 путем эксцизии GUS с помощью лирования экспрессии Ncol и SacI и лигирования в DGFR в виде Ncol 51 71536 52 Были обнаружены многочисленные последоляциям для осуществления ориентации гетероловательности, усиливающие экспрессию гена внутгичных генных продуктов в эти органеллы. Примери единицы транскрипции, и эти последовательрами таких последовательностей являются ности могут применяться в сочетании с генами по кодируемые в ядре АТФазы и специфичные для изобретению для усиления их экспрессии в трансмитохондрий изоформы аспартатаминогенных растениях. трансферазы. Ориентация к клеточным протеиноБыло установлено, что различные интронные вым тельцам была описана у Rogers и др., в Proc. последовательности усиливают экспрессию, в Natl. Acad Sci. USA 82: 6512-6516 (1985)). частности в клетках однодольных растений. НаКроме того, были охарактеризованы, послепример, обнаружено, что интроны гена Adh1 кукудовательности, приводящие к ориентации генных рузы значительно усиливают экспрессию гена дипродуктов к другим клеточным компартментам. кого типа под воздействием родственного Последовательности с концевой аминогруппой промотора при введении в клетки кукурузы. Было ответственны за ориентацию к эндоплазматичеустановлено, что интрон 1 является особенно скому ретикулюму (ЭР), апопласту, и за экстраэффективным и усиливает экспрессию в гибридклеточную секрецию из алейронных клеток ных конструкциях с геном хлорамфеникол(Koehler & Но, Plant Cell 2: 769-783 (1990)). Кроме ацетилтрансферазы (Callis и др., Genes Develop. того, последовательности с концевой аминогруп1: 1183-1200 (1987)). В этой же экспериментальпой в сочетании с последовательностями с конценой системе интрон гена bronzel кукурузы обладал вой карбоксильной группой ответственны за ориподобным действием в отношении усиления эксентацию генных продуктов к вакуолям (Shinshi и прессии (Callis и др., см. выше). В соответствии с др., Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)). принятой практикой интронные последовательноПутем слияния описанных выше соответстсти включали в векторы трансформации растения вующи х ориентирующи х последовательностей с обычно внутри нетранслируемой лидерной послепредставляющими интерес трансгенными последовательности. довательностями возможно направлять трансгенТакже известны многочисленные нетранслиный продукт к любой органелле или к любому руемые лидерные последовательности, усиликомпартменту клетки. Для ориентации, например, вающие экспрессию и имеющие происхождение из в хлоропласт сигнальную последовательность вирусов, и они являются особенно эффективными хлоропласта из гена RUBISCO. гена CAB, гена в клетках двудольных растений. В частности, быEPSP-синтазы или гена GS2 сливают в рамке с ло подтверждено, что лидерные последовательаминоконцевым колоном ATG трансгена. Выбранности из вируса мозаики табака (TMV, "Wная сигнальная последовательность должна последовательность"), из вируса хлоротической включать известный сайт расщепления, а при конпятнистости кукурузы (MC MV) и из вируса мозаики струировании гибридов следует учитывать любые люцерны (AMV) эффективны для усиления эксаминокислоты после сайта расщепления, которые прессии (см. например, у Gallie и др. Nucl. Acids необходимы для расщепления. В некоторых слуRes. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski и др., Plant чаях это требование может быть удовлетворено Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)). путем добавления небольшого количества аминоОриентация генного продукта внутри клетки кислот между сайтом расщепления и ATG трансИзвестны различные существующие в растегена или в альтернативном варианте путем замениях механизмы для ориентации генных продукщения нескольких аминокислот внутри тов, а последовательности, контролирующие трансгенной последовательности. Гибриды, сконфункционирование этих механизмов, охарактериструированные для импорта в хлоропласт, могут зованы достаточно подробно. Например, ориентабыть оценены на эффективность поглощения ция генных продуктов к хлоропласту контролирухлоропластом путем трансляции in vitro транскриется с помощью сигнальной последовательности, бируемых in vitro конструкций с последующем покоторая обнаружена на содержащем аминогруппу глощением in vitro хлоропластом с использованиконце различных протеинов и которую отщепляют ем методов, описанных у Bartlett и др. (Edelmann и во время импорта в хлоропласт, получая зрелый др. (ред.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, протеин (см., например, у Comai и др., J.Biol. Elsevier. стр.1081-1091 (1982)); Wasmann и др. Chem. 263: 15104-15109 (1988)). Эти сигнальные (Моl. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)). Эти методы последовательности могут быть слиты с гетеролоконструирования хорошо известны в данной обгичными генными продуктами для осуществления ласти техники и одинаково пригодны и для митоимпорта гетерологичных продуктов в хлоропласт хондрий, и для пероксисом. Выбор ориентации, (van den Broeck и др., Nature 313: 358-363 1985)). которая может требоваться для экспрессии трансДНК, кодирующая соответствующие сигнальные генов, будет зависеть от клеточной локализации последовательности, может быть выделена из 5'предшественника, необходимого в качестве исконца кДНК, кодирующи х протеин RUBISCO, проходной точки для данного процесса. Эта локалитеин CAB, фермент EPSP-синтазу, протеин GS2 и зация обычно бывает цитозольной или хлороплацелый ряд други х протеинов, для которых известстной, хотя в некоторых случаях может быть но, что они локализованы в хлоропласте. митохондриальной или пероксомальной. Обычно Другие генные продукты локализованы в друне требуется, чтобы продукты экспрессии трансгих органеллах, таких, как митохондрия и пероксигена были ориентированы к ЭР, апопласту или сома (см., например, у Unger и др., Plant Molec. вакуоли. Biol. 13: 411-418 (1989)). кДНК, кодирующие эти Вышеописанные механизмы для клеточной продукты, также могут быть подвергнуты манипуориентации могут быть использованы не только в 53 71536 54 сочетании с их родственными промоторами, но совместное культивирование Agrobacterium с экстакже в сочетании с гетерологичными промотораплантатами из растения и осуществляется в соотми так, чтобы обеспечивать специфическую клеветствии с протоколами, хорошо известными в точную ориентацию к месту назначения под регуданной области техники. Трансформированную ляцией транскрипции промотором, который имеет ткань регенирируют на селектируемой среде, несхему экспресии, отличную от таковой у промотосущей маркер устойчивости к антибиотику или ра, который стимулирует ориентацию сигнала. гербициду, находящийся между границами бинарПример 22: Трансформация двудольных расной плазмиды Т-ДНК. тений Пример 23: Трансформация однодольных Методы трансформации для двудольных расрастений тений хорошо известны в данной области техники Трансформация большинства видов однои включают как таковые, основанные на применедольных растений в настоящее время также стала нии Agrobacterium, так и методы, для которых не традиционной. Предпочтительные методы вклютребуется использовать Agrobacterium. Методы, чают непосредственный перенос гена в протопладля которых не требуются Agrobacterium, включасты с использованием ПЭГ или электропорацию и ют поглощение экзогенного генетического матебомбардировку частицами ткани каллюса. Трансриала непосредственно протопластами или клетформации могут быть осуществлены с одиночныками. Это может осуществляться с помощью ПЭГ ми видами ДНК или со множественными видами или медиируемого электропорацией поглощения, ДНК (т.е. путем котрансформации), и оба эти медоставки, медиируемой бомардировкой частицатода пригодны для использования по настоящему ми, или путем микроинъекции. Примеры этих меизобретению. Котрансформация может иметь то тодов описаны у Paszkowski и др., ЕМВО J. преимущество, что она позволяет избежать необ3:2717-2722 (1984), Potrykus и др., Моl. Gen. Genet. ходимости применения сложной векторной конст199: 169-177 (1985), Reich и др., Biotechnology 4: рукции и дает возможность генерировать транс1001-1004 (1986) и у Klein и др., Nature 327: 70-73 генные растения с несцепленными локусами для (1987). В каждом случае трансформированные представляющего интерес гена и селектируемого клетки регенерируют до целых растений, испольмаркера, давая возможность удалить селектируезуя стандартные методы, известные в данной обмый маркер в последующих поколениях, если это ласти техники. считается необходимым. Однако недостатком при Трансформация, медиируемая Agrobacterium, применении котрансформации является частота, является предпочтительным методом для транссоставляющая менее 100%, с которой отдельные формации двудольных вследствие высокой эфвиды ДНК интегрируются в геном (Schocher и др. фективности этой трансформации и ее широкой Biotechnology 4: 1093-1096 (1986)). применимости для различных многочисленных В описаниях европейских заявок ЕР 0292435 видов. Многие культурные виды, которые обычно (на имя фирмы Ciba-Geigy), ЕР 0392225 (на имя могут трансформироваться с помощью фирмы Ciba-Geigy) и WO 93/072778 (на имя фирAgrobacterium, включают табак, томаты, подсолмы Ciba-Geigy) приведены способы получения нечник, хлопчатник, масличный рапс, картофель, каллюса и протопластов из элитной инбредной сою, люцерну и тополь (ЕР 0317511 (хлопчатник), линии кукурузы, трансформации протопластов с ЕР 0249432 (томаты, на имя фирмы Calgene), WO использованием ПЭГ или электропорации и реге87/07299 (Brassica, на имя фирмы Calgene), панерации растений кукурузы из трансформировантент США 4795855 (тополь)). Трансформация с ных протопластов. Gordon-Kamm и др. в Plant Cell использованием Agrobacterium обычно включает 2: 603-618 (1990) и Fromm и др. в Biotechnology 8: перенос бинарного вектора, несущего чужерод833-839 (1990)) опубликовали способы трансфорную, представляющую интерес ДНК (например, мации линии кукурузы, имеющей происхождение рСlВ200 или рСІВ2001), в соответствующий из А188, с использованием бомбардировки частиштамм Agrobacterium, который может зависеть от цами. Кроме того, в международной заявке WO комплемента генов vir, которые несет штамм93/07278 (на имя фирмы Ciba-Geigy) и у Koziel и хозяин Agrobacterium, либо на ко-резидентной Тідр. в Biotechnology 11: 194-200 (1993)) описаны плазмиде, либо хромосомально (например, в способы трансформации элитных инбредных лиштамм СІВ542 для рСlВ200 и pCIB2001) (Uknes и ний кукурузы путем бомбардировки частицами. др., Plant Cell 5: 159-169 (1993)). Перенос рекомЭтот способ включает использование незрелых бинантного бинарного вектора в Agrobacterium эмбрионов кукурузы длиной 1,5-2,5мм, вырезаносуществляют методом трехпарентального (трехных из початка через 14-15 дней после опыления, родительского) скрещивания с использованием и устройств для бомбардировки типа PDS-1000He Е.coli, несущей рекомбинантный бинарный вектор, Biolistics. штамм-хелпер Е.coli, который несет такую плазТрансформация риса также может быть осумиду, как pRK2013, и который способен передаществлена с использованием методов непосредвать рекомбинантный бинарный вектор в штаммственного переноса гена с применением протомишень Agrobacterium. В другом варианте рекомпластов или бомбардировки частицами. бинантный бинарный вектор может быть перенеМедиируемая протопластом трансформация описен в Agrobacterium путем трансформации ДНК сана для японских и индийских типов риса (Zhang (Höfgen & Willmitzer, Nucl. Acid. Res. 16: 9877 и др., Plant Cell Rep. 7: 379-384 (1988); Shimamoto (1988)). и др., Nature 338: 274-277 (1989); Datta и др., Трансформация видов растений-мишений реBiotechnology 8: 736-740 (1990)). Оба типа также комбинантной Agrobacterium обычно включает трансформируют стандартными методами с ис 55 71536 56 пользованием бомбардировки частицами (Christou ции пшеницы, и эта заявка включена в настоящее и др., Biotechnology 9: 957-962 (1991)). описание в качестве ссылки. В европейской заявке ЕР 0332581 (на имя Пример 24: Селекция генов протокса растений фирмы Ciba-Geigy) описаны методы получения, на устойчивость к ингибирующим протоке гербитрансформации и регенерации протопластов расцидам в системе экспрессии Е.coli тений семейства мятликовых (Pooideae). Эти меПлазмиду pWDC-4, кодирующую хлороплатоды дают возможность трансформировать ежу стами фермент протоке кукурузы, трансформиру(Dactylis spp.) и пшеницу. Кроме того, трансфорют в подвергнутом неспецифическому мутагенезу мация пшеницы описана у Vasil и др., штамме XLl-Red (фирма Strategene, La Jolla, Са). Biotechnology 10: 667-674 (1992), с использованиТрансформант высевают в L-среду, содержащую ем бомбардировки частицами в клетках типа С 50г/мл ампициллина, и инкубируют в течение 48 каллюса с продолжительным временем регенерачасов при 37°С. Газоны трансформированных ции, а также у Vasil и др., Biotechnology 11: 1553клеток экспортируют из чашек и получают ДНК 1558 (1993) и у Weeks и др., в Plant Physiol. 102: плазмиды, используя набор Wizard Megaprep 1077-1084 (1993) с использованием бомбардиров(фирма Promega, Madison, WI). ДНК плазмиды, ки частицами незрелых эмбрионов и незрелого выделенную из этого штамма-мутатора, вероятно, каллюса эмбрионального происхождения. Однако содержит приблизительно одно случайным обрапредпочтительный метод для трансформации зом измененное основание на 2000 нуклеотидов пшеницы включает трансформацию пшеницы пу(см. Greener и др., Strategies 7(2): 32-34 (1994)). тем бомбардировки частицами незрелых эмбриоМутированную плазмидную ДНК переносят в нов и включает либо стадию высокого содержания мутант hemG SASX38 (Sasarman и др., J.Gen. сахарозы или высокого содержания мальтозы, Microbiol. 113: 297 (1979) и высевают в L-среду, предшествующую доставке гена. До бомбардисодержащую 100г/мл ампициллина, и в такую же ровки любое количество эмбрионов (длиной 0,75среду, содержащую различные концентрации ин1мм) помещают в MS-среду с добавлением 3%гибирующего протоке гербицида. Чашки инкубиной сахарозы (Murashige & Skoog, Physiologia руют в течение 2-3 дней при 37°С. ДНК плазмиды Plantarum 15: 473-497 (1962)) и 3мг/л 2,4-Д для выделяют из всех колоний, растущи х в присутстиндукции соматических эмбрионов, что дает им вии концентраций гербицида, которые эффективвозможность развиваться в темноте. В выбранный но вызывают гибель штамма дикого типа. Затем день бомбардировки эмбрионы удаляют из среды выделенную ДНК переносят в SASX38 и вновь для индукции и помещают в осмотикум (т.е. в сревысевают в среду с гербицидом для гарантии того, ду для индукции с добавлением сазарозы или что эта устойчивость обусловлена плазмидой. мальтозы в требуемой концентрации, обычно Мутированную ДНК плазмиды pWDC-4 вновь 15%-ной). Эмбрионам дают возможность пройти выделяют из устойчивых колоний и вырезают коплазмолиз в течение 2-3-ч и затем подвергают дирующую протоке последовательность путем бомбардировке. В одной чашке-мишени обычно разложения с помощью EcoRI и Xhol. Затем выреиспользуют по 20 эмбрионов, хотя это количество занную кодирующую протоке последовательность не имеет решающего значения. Соответствующую повторно клонируют в неподвергаутом мутагенезу несущую ген плазмиду (такую, как рСlВ3064 или векторе pBluescript и повторно тестируют на усpSOG35) осаждают на золотые частицы размером тойчивость к ингибирующему протоке гербициду порядка микрометра, используя стандартную метаким же образом, как описано выше. тодику. Каждую чашку с эмбрионами обстреливаЭтот процесс удаляет мутации некодирующей ют с помощью устройства Biolistics на основе гепоследовательности, которые обусловливают услия фирмы DuPont с использованием давления тойчивость, например, положительных мутантов залпа -1000фунтов/кв.дюйм и стандартного экрана (т.е. мутантов, устойчивость которых является с размером пор 80меш. После бомбардировки следствием мутаций, вызывающих повышенную эмбрионы помещают обратно в темноту для восэкспрессию немодифицированного протокса), и становления в течение приблизительно 24ч (все оставляет только тех мутантов, устойчивость коеще в осмотикуме). Через 24ч эмбрионы удаляют торых является следствием мутаций в кодируюиз осмотикума и помещают назад в среду для инщей последовательности протокса. Определяют дукции, где они остаются в течение приблизипоследовательность ДНК, идентифицированную с тельно месяца до регенерации. Приблизительно помощью этого процесса, для всех вероятных точерез один месяц эксплантаты эмбрионов с разлерантных к гербициду генов протокса и выявляют витым эмбриогенным каллюсом переносят в среду мутации путем сравнения с последовательностью протокса дикого типа в pWDC-4, для регенерации (MS+1мг/л NAA (aС использованием описанной выше методики нафтилуксусная кислота), 5мг/л GA), содержащую, были идентифицированы мутации устойчивости, кроме того, соответствующий селектирующий агент (10мг/л басты в случае рСlB3064 и 2мг/л превращающие С в Τ на нуклеотиде в положении 498 в последовательности в pWDC-4 (SEQ ID NO: метотрексата в случае pSOG35). Через приблизи5). Плазмиду, несущую эту мутацию, обозначили тельно один месяц развившиеся ростки переносят как pMzC-1Val. Это изменение превращает кодон в более крупные стерильные контейнеры, известGCT аланина в аминокислоте в положении 166 ные, как "GA7", содержащие MS с половинной крепостью, 2%-ную сахарозу и такую же концен(SEQ ID NO: 6) в кодон GTT валина и приводит к получению фермента протокса, который по крайтрацию селектирующего агента. В заявке на паней мере в 10 раз более устойчив к ингибируютент 08/147161 приведены методы трансформащему протоке гербициду в бактериальном тесте. 57 71536 58 Плазмида pMzC-1Val в векторе pBluescript SK Arabidopsis осуществляют, применяя набор для целей процедуры патентования была депониTransformer Site-Directed Mutagenesis Kit (фирма рована 30 сентября 1994г. под обозначением Clontech, Palo Alto, CA). После подтверждения pWDC-8 в коллекции культур Службы сельскохоаминокислотных изменений путем анализа послезяйственных исследований, и она получила катадовательности мутантные плазмиды переносят в ложный номер NRRL №21340. штамм SASX38 и высевают в среду L-amp100 для Такую же стратегию применяли для скрининга тестирования на функционирование и в различустойчивых к гербициду форм гена Protox 1 ные концентрации ингибирующего протоке гербиArabidopsis в различных векторах. Одна из модицида для тестирования на толерантность. фицированных мутаций представляет собой заЭту методику применяли к кодону аланина в мену С на Τ в нуклеотиде в положении 689 в понуклеотидах 688-690 и к кодону тирозина в нукследовательности pWDC-2 (SEQ ID NO: 1); эту леотидах 1306-1308 последовательности протокса плазмиду обозначили как pAraC-1Val. Это иденArabidopsis (SEQ ID NO: 1). Эти результаты покатично таковому в указанном выше мутанте pMzCзывают, что кодон аланина в нуклеотидах 688-690 1Val, что ведет к превращению кодона GCT аламожет быть заменен на кодон валина, треонина, нина в аминокислоте в положении 220 (SEQ ID лейцина или цистеина, чтобы получить устойчиNO; 2) в кодон GTT валина в соотве тствующем вый к гербициду фермент протоке, который сохраположении в последовательности протеина проняет свою функцию. Кроме того, эти результаты токса Arabidopsis. показывают, что кодон тирозина в нуклеотидах Второй ген устойчивости включает замену А 1306-1308 может быть заменен на кодон цистеина G в нуклеотиде в положении 1307 в последована, изолейцина, лейцина, валина или треонина с тельности pWDC-2 (SEQ ID NO: 1); эту плазмиду той целью, чтобы получить устойчивый к гербициобозначили как pAraC-2Cys. Это изменение преду ферменит протоке, который сохраняет свою вращает кодон ΤАС тирозина в аминокислоте в функцию. положении 426 (SEQ ID NO: 2) в кодон TGC цисПример 26: Демонстрация перекрестной толетеина. Соответствующий кодон тирозина в послерантности мутаций устойчивости к различным содовательности protox 1 кукур узы в нуклеотиде в единениям, ингибирующим протокс положении 1115-1117 (SEQ ID NO: 5; аминокислоУстойчивые мутантные плазмиды, прошедшие та в положении 372 последовательности SEQ ID селекцию на устойчивость к одному гербициду, NO: 6) может быть мутирован аналогичным обратестируют в отношении спектра других ингибизом для получения устойчивой к гербициду формы рующих протоке соединений. Штамм SASX38, соэтого фермента. держащий плазмиду дикого типа, помещают в Третий ген устойчивости имеет замену G на А среду, содержащую определенный интервал конв нуклеотиде в положении 691 в последовательцентраций каждого соединения для определения ности pWDC-2 (SEQ ID NO: 1); эту плазмиду оболетальной концентрации каждого из них. Устойчизначили как pAraC-3Ser. Это изменение превравые мутантные плазмиды в SASX38 высевают и щает кодон GGT глицина в аминокислоте в определяют способность выживать при конценположении 221 (SEQ ID NO: 2) в кодон AGT серитрации каждого соединения, которая, по крайней на в положении кодона, соседнем к мутации в рАмере, в 10 раз превышает концентрацию, являюгаС-1. Соответствующий кодон глицина в послещуюся летальной для штамма SASX38, содержадовательности protox 1 кукур узы в нуклеотиде в щего плазмиду дикого типа. положении 497-499 (SEQ ID NO: 5; аминокислота в Результаты, полученные при определении пеположении 167 последовательности SEQ ID NO: рекрестной толерантности, показывают, что каж6) может быть мутирован аналогичным образом дая из определенных мутаций обусловливает тодля получения устойчивой к гербициду формы лерантность к различным ингибирующим протокс этого фермента. соединениям. В частности результаты показываВсе описанные выше мутации приводят к поют, что: 1) мутация AraC-1Val обусловливает услучению фермента протокса, который, по крайней тойчивость к ингибиторам протокса, включающим мере, в 10 раз более устойчив к ингибирующему соединения формул IV, XI, XIII, XIV, XV и XVII, но протоке гербициду в бактериальном тесте. не обязательно ограниченных ими; 2) мутация Плазмида pAraC-2Cys в векторе pFL61 для AraC-2Cys обусловливает устойчивость к ингибицелей процедуры патентования была депонироторам протокса, включающим соединения формул вана 14 ноября 1994г. под обозначением pWDC-7 XI, XIII, XV и XVII, но не обязательно ограниченв коллекции культур Службы сельскохозяйственных ими; 3) мутация MzC-1Val обусловливает усных исследований, и она получила каталожный тойчивость к ингибиторам протокса, включающим номер NRRL №21339N. соединения формул XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI и Пример 25: Дополнительные замещения усXVII, но не обязательно ограниченных ими; 4) мутойчивого к гербициду кодона в положениях, вытация pAraC-3Ser обусловливает устойчивость к явленных путем случайного скрининга ингибиторам протокса, включающим бифенокс и Аминокислоты, выявленные в качестве сайтов соединения формул IV, XII, XIII, XIV, XV и XVII, но устойчивости к гербициду путем случайного скрине обязательно ограниченных ими. нинга, замещают другими аминокислотами и тесПример 27: Получение толерантных к гербитируют на функциональность и на толерантность к цидам растений путем сверхэкспрессии генов прогербициду в бактериальной системе. Сайттокса растений специфический мутагенез с использованием олиПоследовательности, кодирующие Protox-1 гонуклеотидов последовательности Protox-1 Arabidopsis как дикого типа, так и из устойчивых 59 71536 60 мутантных генов AraC-1Val, вырезают путем час(A) И МЯ/КЛЮЧ: CDS тичного разложения с помощью EcoRI и Xhol и (B) ПОЛОЖЕНИЕ: 31...1644 клонируют в плазмиде экспрессии растения (D) ПРОЧАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /note="кДНК pCGN1761ENX. Полигенные экспрессирующие Protox-1 Arabidopsis; последовательность из кластеры, содержащие гибриды 2X35S-reH Protox, pWDC-2" вырезают путем разложения с помощью Xbal и (xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: клонируют в бинарном векторе рСlВ200. Эти биSEQ ID NO: 1: нарные плазмиды с протоксом трансформируют путем электропорации в Agrobacterium и затем в Arabidopsis, используя метод вакуумной инфильтрации (Bechtold и др., 1993). Трансформантов селектируют канамицином и получают семенной материал Т2 из многочисленных независимых линий. Этот семенной материал помещают в среду GM, содержащую различные концентрации ингабирующего протоке гербицида, и оценивают прорастание и выживание. Полигенные трансгенные линии, обладающие способностью к сверхэкспрессии либо дикого типа, либо устойчивого мутанта протокса дают значительное количество зеленых проростков на концентрации гербицида, которая является летальной для пустого контрольного вектора. Различные представленные в настоящем описании модификации изобретения должны быть очевидны для специалистов в данной области техники. Подразумевается, что такие модификации подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения. ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ: (І) ЗАЯВИТЕЛЬ: (A) Н АИ МЕНОВАНИЕ: CIBA-GEIGY AG (B) УЛИЦА: Kl ybeckstr. 141 (C) ГОРОД: Базель (E) СТРАН А: Швейцария (F) ПОЧТОВЫЙ КОД (ZIP): 4002 (G) ТЕЛЕФОН: +41 61 69 11 11 (Н) ТЕЛЕФАКС: +41 61 696 79 76 (I) ТЕЛЕКС: 962 991 (ii) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Манипулирование ферментативной активностью протопорфириноген-оксидазы.у эукариот (iii) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 20 (iν) ФОРМА ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ДЛЯ КОМПЬЮТЕРА: (A) ТИП НОСИТЕЛЯ: флоппи-диск (B) КОМПЬЮТЕР: IBM PC, совместимый (C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: PC-DOS/MSDOS (D) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Patentln Release #1.0, версия #1.25 (ЕРО) (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 1: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (A) ДЛИН А: 1719 пар оснований (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (D) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (iii) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (iv) АНТИСМЫСЛ: нет (ix) ПРИЗНАК: