Штам культивованих клітин унгернії віктора ungernia victoris vved. ex artjuschenko – продуцент біологічно активних речовин

Штам культивованих клітин унгернії Віктора Ungernia victoris Wed. ex Artjuschenko - продуцент біологічно активних речовин, який зареєстровано в Колекції клітинних культур Інституту молекулярної біології і генетики НАН України під номером 10. Винахід відноситься до галузі біотехнології і може бути використаний у медичній, харчовій та косметичній промисловостях. Унгернія Віктора є головним джерелом одержання цінного для медицини алкалоїда таланта* міна. Ця рослина - рідкісний ендемічний вид, що зустрічається на Памірі (Південні схили Пссарського хребта, Таджикистан). Відомий штам культивованих клітин Ungernia victoris - продуцент алкалоїдів групи галантаміна та лікорина [1]. Цей штам є низьким за продуктивністю (вихід сирої маси - 87-126 г/л, сухої маси - 5-9,8 г/л, вміст суми алкалоїдів в перерахунку на суху біомасу - 0,042-0,051%), вирощується у вигляді калюсної тканини на агаризованому збагаченому азотом середовищі з мінеральною основою за Мурасіге-Скугом, яке не є оптимальним для накопичення речовин спеціалізованого обміну. Завданням винаходу є створення штаму культивованих клітин унгернії Віктора - продуцента біологічно активних речовин широкого спектру дії, що мають, зокрема, радіопротекторну та антимутагенну дії. Завдання вирішується створенням нового штаму культивованих клітин унгернії. Родовід культури. Штам Унгернія UV-2 отримано від тканин дикорослої цибулини унгернії масою 143 г. Вихідна цибулина перед введенням в культуру in vitro 2 роки витримувалася в стадії спокою при температурі 5-8°С. Штам Унгернія UV-2 зберігається в колекції клітинних культур Інституту молекулярної біології і генетики НАН України під номером №10. Число пасажів на момент паспортизації - 38. Стандартні умови вирощування. Культивування штаму проводиться у вигляді калюсу (на агаризованому живильному середовищі) або у вигляді суспензії" (в рідкому середовищі) при температурі 24-26Х, відносній вологості повітря 70-80% при відсутності освітлення. Суспензійну культуру вирощують при постійному перемішуванні на качалці при 80-100 об/хв, для вирощування калюсної культури качалка не використовується. Культивування Унгернії UV-2 здійсся одностадійним способом в середовищі за лупного складу, мг/л: NH4NO, 400 - 600 1000-1200 KNO3 (NH4)2SO4 200-400 MgSO47H2O 400-600 Ca(NO3)4H2O 800 -1000 500 - 700 NH4H2PO4 (NH 4 ) 2 HP0 4 90-110 KCI 60-80 KJ 0,8 - 0,9 Na2MoO42H2O 0,2 - 0,3 CuSO45H2O 0,02 - 0,03 CoCI 2 6H 2 O 0,02 - 0,03 MnSO45H2O 23-25 5-8 H3BO3 ZnSO44H2O 7-9 FeSO4.7H2O 27-28 Na2 ЕДТА 37-38 тіамін 0,8-1,2 CM Ю О Э 39572 гтіридоксин 0.5-1,0 нікотинова кислота 0,5-1,0 гліцин 1,5-2,5 мезоінозит 20-100 1-нафтилоцтова кислота 0,5-2,2 кінетин 0.02-1.2 гідролізат казеїну 50 - 600 сахароза 50000 - 60000 агар 0.6 - 0,8 % рН до автоклавування 5,8-6,2 Для суспензійної культури використовують аналогічне за складом середовище, з якого вилучають агар. Посуд з середовищем стерилізують гарячою парою при 115-120°С протягом 15-20 хв Для вирощування культури використовують скляні ємкості (колби) місткістю 250-300 мл. Калюсну культуру можна вирощувати також в пробірках і чашках Петрі, різних за об'ємом Культуральні властивості. Біомаса культивованих клітин штаму Унгернія V-2 складається з клітин і клітинних агрегатів різної щільності. Розмір клітинних агрегатів суспензійної культури складає біля 0,5 см в діаметрі. При вирощуванні на твердому (агаризованому) живильному середовищі калюснч культура більш гетерогенна, вона складається з малорозсипчатих агрегатів від 0,1 до 0,8 см в діаметрі, що більш щільні, ніж агрегати в суспензії. Колір культури від світло-сірого до світло-жовтого, Тривалість пасажу та режим пересуву суспензійної культури - 45-55 днів, калюсної культури, що вирощується на агаризованому середовищі 55-65 днів. Калюсна культура не втрачає життєздатності і помітно не змінює основних парамегрів при вирощуванні в стандартних умовах без пересадки протягом 90-95 днів Маса інокуляту становить 100-120 г живої біомаси в перерахунку на 1 л живильного середовища. Життєздатність культури та стабільність її основних ознак і характеристик перевірялись протягом 5 років (1995-1999 pp.). Ростові ознаки. Тип росту переважно неорганізований. Інколи в старіючій культурі спонтанно формуються коренеподібні та рідше стеблоподібні структури. Ростовий індекс 3-5 для суспензійної культури і 4-7 - для калюсної. Крива росту має типовий S-подібиий характер з виходом на плато на 45-50 день росту для суспензії і на 5560 день росту для калюсу Вихід сирої біомаси з 1 л на 65 день росту складає 400-500 г, інколи до 550 г. В перерахунку на суху 6«омасу вихід складає 20-35 г/л Життєздатність клітин становить 85-90% в стандартних умовах культивування. Крива мітотичної активності має, як правило, один підйом з максимумом на 10-15 день росту в суспензії і на 14-18 день росту на агаризованому середовищі. Кількість клітин, що знаходяться в різних стадіях мітозу (мітотичний індекс) в максимумі мітотичної активності сягає 1,4-2,3%. Каріологічні ознаки. Культура є міксоплоїдною популяцією. Розподіл клітин за числом хромосом має межі варіювання від 16 до 92 хромосом. Модальний клас формують клітини, що містять 20-26 хромосом, вони складають 50% популяції. Частота аберацій хромосом в анафазі мітозу - біля 6%, при цьому анафази зі свіжими розривами хромосом (анафази з фрагментами) складають менше 1%. Цитоморфологічні ознаки. Як суспензійну, так і калюсну культуру формують клітини паренхіматичного та меристематичного типу переважно округлої форми. Співвідношення між цими клітинами протягом пасажу змінюється, однак на всіх етапах росту переважну кількість культури складають клітини меристематичного типу. Вони знаходяться в невеликих агрегатах, що містять, як правило, від 4-8 до 25-35 клітин. Розмір клітин меристематичного типу коливається в межах 26-60 мкм, їх ядра мають розміри 14-22 мкм. Клітини паренхіматичного типу більші за розміром (80-280 мкм) Ядра в них більш гетерогенні за формою і розміром, їх розмір коливається в межах 10-30 мкм. Найчастіше ядра паренхіматичних клітин мають розміри 20-28 мкм, інколи (до 10-15% випадків) такі клітини містять кілька (як правило, 2-4) ядра. В старіючій культурі (після 30-35 дня росту) зростає кількість елементів клітинної' диференціації. Зокрема кількість трахеїд може сягати на 50 день росту і пізніше 2,5% і більше всіх клітин. Зростає також поліморфізм ядер: з'являються пікнотичні, видовжені, стрічкоподібні, сплющені, гантелевидні ядра, великі дифузні ядра неправильної форми, ядра з багатьма (чотирмашести) ядерцями тощо. Маркерні ознаки. Забарвлення культури від світло-сірого до світло-жовтого, здатність до неорганізованого типу росту як на агаризованому, так і в рідкому живильному середовищі за [2]. При цьому приріст біомаси складає на 65 день росту 400-500 г (в деяких випадках до 550 г) сирої маси на 1 л живильного середовища. В перерахунку на суху біомасу це складає 20-35 г на 1 л середовища. Ростовий індекс 47. Протягом пасажу (50-60 днів) крива мітотичної активності характеризується одним підйомом мітотичної активності з піком на 12-18 день росту. Значення мітотичного індексу в максимумі -1,42,3%. Модальний клас формують клітини, що містять 20-26 хромосом, частота клітин з цим числом складає близько 50%. Рівень аберацій хромосом в анафазі -біля 6%, переважну кількість серед яких складають анафази з мостами без фрагментів. Культура формується переважно невеликими клітинами меристематичного типу з порівняно крупним ядром, зібраними в агрегати. Розмір таких клітин 26-60 мкм» їх ядра мають розміри 1422 мкм. При старінні культури в ній зростає кількість елементів диференціації, зокрема кількість трахеїдних елементів може перевищувати 2,5%. Культура здатна до органогенезу, з ній спонтанно можуть формуватися корене- та стеблоподібні структури. Настойка із свіжої біомаси культивованих клітин на 45° етиловому спирті має антимутагенну та радіопротекторну дії. Винахід ілюструється такими прикладами. Приклад 1. Для калюсної культури в конічні колби Ерленмейєра об'ємом 250 мл розливають по 50 мл живильного середовища, склад якого наведено вище. Середовище стерилізують в авток 39572 лаві при 1 атм 15-20 хв. Після охолодження в кожну колбу в стерильних умовах саджають калюсну тканину живою масою біля 5 г. На 65 день росту калюсну тканину виймають із колб і зважують (результати наведені в табл.1). Із цієї тканини готують спиртову настойку у ваговому співвідношенні 1 частина біомаси : 3 частини 45 е спирту. Одержану спиртову настойку вивчають на радіопротекторну та антимутагенну дію. Результати такого вивчення наведено в табл.2-4. Вони свідчать, що спиртовий екстракт із клітинної біомаси штаму Унгернія UV-2 зменшує число гамма-індукованих мікроядер в поліхромагофільних еритроцитах кісткового мозку мишей більше, ніж на 50% (табл. 2), знижує радіаційну загибель тварин майже на 50% (табл. 3), пригнічує рівень індукованих мутацій в тесті Еймса на 25% (табл. 4). СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1. Патент СССР №1806188 А 3. МПК С 12 N 5/04. Штамм культивируемых клеток растений Ungernia victoris - продуцент алкалоидов группы галантамина и ликорина // Александрова И.В., Гордонова Л.К., Тулакин В.Г., Усманов П.Д., Соложенкин П.М. - 30.03 93, Бюл №12 2. Патент України №10338 А, МПК С 12 N 5/00, С 12 N 5/02. Живильне середовище для одержання і вирощування квпюсикх тканин рослин / Кунах В.А., Алпатова Л.К., Можилевська Л.П. 25.12.1996. Таблиця 1 Вихід біомаси калюсної гканини штаму Унгернія UV-2 на 65 день росту в колбах Ёрленмейера об'ємом 250 мл, що містили 50 мл живильного середовища Номер колби Маса сирої тканини, г на колбу Вихід біомаси в перерахунку на 1л середовища сира тканина суха тканина 1 27,1 542 32,7 2 25,3 506 31,2 3 23,8 476 30,1 4 27,5 550 34,6 5 21.3 426 27,3 6 20,1 402 21,7 7 24,6 492 28,3 8 21,5 430 20,2 25.3 506 30,8 22,7 454 28,1 9 10 ' Таблиця 2 Визначення біологічної активності субстрату, отриманого із біомаси культивованих клітин Унгернії Віктора за критерієм зниження числа гамма-індукованих мікроядер (ЬАЯ) в поліхроматофільних еритроцитах кісткового мозку мишей Радіаційна обробка Вплив субстрату із біомаси клітин Число МЯ, % Без обробки Без обробки 2,87±0,56 Без обробки Обробка субстратом (0,2 мл на 1 тварину) 2,31±0,78 Гамма-випромінювання (1,5 Гр) Без обробки 37,1±1,31 Гамма-випромінювання (1,5 Гр) Обробка субстратом (0,2 мл на 1 тварину) 15,9±0,83 39572 Таблиця З Визначення біологічної активності субстрату, отриманого із біомаси культивованих клітин Унгернії Віктора за критерієм виживання лабораторних тварин (мишей), опромінених сублетальними дозами радіації Радіаційна обробка Вплив субстрату із біомаси клітин Частка тварин, що вижили, % Без обробки Без обробки . 100 Без обробки Обробка субстратом (0,2 мл на 1 тварину протягом 60 днів) 100 Гамма-випромінювання (7,5 Гр) Без обробки 27±3 Гамма-випромінювання (7,5 Гр) Обробка субстратом (0,2 мл на 1 тварину протягом 60 днів) 51 ±1 Таблиця 4 Визначення біологічної активності субстрату, отриманого із біомаси культивованих клітин Унгернії Віктора за критерієм зменшення індукованих мутацій в тесті Еймса Хімічна обробка Вплив субстрату із біомаси клітин Число колоній -ревертантів, М±т Без обробки Без обробки 23±0,9 Без обробки Обробка субстратом (0,1 мл на чашку) 21 ±1,0 ДДДТДП (500 мкг/год) Без обробки 775±57,8 ДДДТДП (500 мкг/год) Обробка субстратом (0,1 мл на чашку) 580±4,7 Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 - 7 2 - 8 9 (03122) 2 - 5 7 - 0 3