Штам культивованих клітин полісціасу папоротелистого poliscias filicifolia ( moore et fournier) bailey-продуцент біологічно активних речовин

Винахід відноситься до галузі біотехнології і може бути використаний у медичній промисловості. Відомий штамм ПП-1 культивованих клітин полісціасу папоротелистого Polysclas filicifolia (Moore et Fournler) Bailey, який використовується для одержання тритерпенових глікозидів [1], але культивовані клітини цього штаму характеризуються недостатнім рівнем накопичення біомаси та глікозидів. Завданням винаходу є підвищення продуктивності культивованих клітин полісціасу папоротелистого Polysclas filicifolia (Moore et Fournler) Bailey по накопиченню біомаси та глікозидів. Завдання вирішується створенням нового штаму Polysclas F-2 з підвищеною продуктивністю біологічно активних речовин з Імуномодулюючим та загальностимулюючим спектром дії. Штам одержано з калусної культури тканин штаму ПП-1 в результаті тривалої селекції на підвищену продуктивність по загальному вмісту глікозидів. Штам зберігається у колекції клітинних культур Інституту молекулярної біології та генетики АН України під номером 6. Штам Polysclas F-2 характеризується слідуючими ознаками. Анатомо-морфологічні та цитологічні ознаки. Біомаса культивованих клітин являє собою досить щільну тканину без ознак органогенезу, світло-жовтого кольору, має специфічний приємний запах та смак після висушування при 55-60°С. Культура складається переважно з округлих клітин. Зустрічаються клітини округло-овальної форми. Розміри клітин - 47-172 мкм, середній розмір клітин - 90 мкм. Переважну більшість складають дрібні та середні за розміром клітини (47-120 мкм), значно менше (10%) великих клітин (121-172 мкм). Співвідношення великих і дрібних клітин змінюється протягом пасажу. Клітини меристематичного та паренхімного типів. Зустрічаються короткі ланцюжки з округлих та округло-овальних клітин. Паренхімні клітини містять включення типу амілопластів. Ядра по формі округлі. Розміри ядер змінюються від 6,6 до 14 мкм. Середній розмір ядер - 10 мкм. Фізіологічні ознаки. На протязі пасажу спостерігається два-три підйоми мітотичної активності з основними піками на 8-9 та 1416 добу росту. Цикл вирощування характеризується S-подібного кривою з виходом на стаціонарну фазу на 3840 добу. Ростовий індекс на 30 добу росту - 10-15. Каріологічні ознаки. Межі варіювання числа хромосом - від 13 до 50. Модальний клас складають клітини з числом хромосом від 19 до 30, переважна більшість яких - більше 70% - складають диплоїдні (2n = 24) клітини. Біля 8% мітотично активних клітин - поліплоїдні. Хромосоми дрібні, біля 2 мкм довжиною, виглядають як одноплечі. Частота анафаз з порушеннями не перевищує 1,5%. Біохімічні та фітохімічні ознаки. Штам Polyscias F-2 характеризується наявністю 7 молекулярних форм естераз та 5 молекулярних форм кислих фосфатаз. Біомаса культивованих клітин містить 3-5% від сухої ваги суми глікозидів, 0,8-1,2% bситостерину, 0,3-0,5% аглікону тритерпенових глікозидів - хедерогеніну. Методом хроматографії в тонкому шарі силікагелю виявляється 13 глікозидів в системі хлороформ-метанол-вода (65:35:7) і 11 глікозидів в системі бутанол-етанол-аміак (9:2:5). Способ Ілюструється такими прикладами. Приклад 1. В склотару для молочних продуктів розливають по 50 мл живильного середовища слідуючого складу, мг/л: Посуд з середовищем стерилізують при 115-120°С протягом 10 хв. Після застигання середовища в стерильних умовах на його поверхню поміщають 2,0-3,5 г біомаси штаму Poliscias F-2. Культуру клітин вирощують при 25-26°С в темряві і при відносній вологості 65-70%. На 40 добу біомасу клітин відокремлюють від агару, висушують при 55-60°С і аналізують на загальний вміст глікозидної фракції. Результати досліджень представлені в табл.1. Приклад 2. Вирощують культуру клітин штаму Polyscias F-2, як в прикладі 1, але на живильному середовищі, яке містить замість сахарози цукор. На 40 добу біомасу клітин відокремлюють від агару, висушують при 55-60°С і аналізують на загальний вміст глікозидної фракції. Результати досліджень представлені в табл. 2. Приклад 3. Проводять нарощування біомаси штаму Polyscias F-2, як описано в прикладі 2, і досліджують її фармакологічні властивості. Загальностимуюючу і адаптогенну дію біомаси визначали за допомогою плавального тесту як змішаного виду стресу з психофізичним навантаженням. Біомасу вводили per os у вигляді порошку в хлібних кульках через металевий зонд для внутрішньо-шлункового введення лікарських препаратів в дозі 1, 5, 10 і 20 мг на 20 г маси тварин. Біомасу вводили протягом одного - трьох днів до тесту. В експерименті використовувались б/п миші-самці масою 18-20 г. Температура води при плаванні була 32°С. На хвіст мишей закріплювали вантаж, який складав 5% від маси тварин. Загальностимулюючу і адаптогенну дію біомаси оцінювали по тривалості плавання тварин. Результати досліджень представлені в табл. 3. Результати, представлені в табл. 1, 2, свідчать, що продуктивність культури клітин штаму Polyscias F-2 перевищує відомий штам полісціасу ПП-1 [1] по сухій біомасі на 61-97%, по загальному вмісту глікозидів - на 10-60%. Вивчення загальностимулюючої та адаптогенної дії показало (табл. 3), що біомаса культури клітин штаму Polyscias F-2 проявляє значну біологічну активність, подовжуючи час плавання тварин в 1,5-3 рази відносно контролю.