Спосіб одержання специфічних імунних сироваток для діагностики ентеровірусних хвороб свиней

Реферат: Спосіб одержання специфічних імунних сироваток для діагностики ентеровірусних хвороб свиней передбачає імунізацію кролів шляхом чотирикратного введення антигену з триденним 3 інтервалом між ін'єкціями. 1 та 3 введення - внутрішньом'язово 5 см антигену з ад'ювантом в 3 стегновий м'яз, 2 та 4 введення - внутрішньовенно 5 см антигену в крайову вушну вену. Як ад'ювант використовують Montanide ISA-25, який утворює стабільну емульсію з вірусним матеріалом. Коефіцієнт використання Montanide ISA-25/антиген складає 25/75. Відбір крові проводиться через 10 діб після останнього введення. UA 114545 U (12) UA 114545 U UA 114545 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, біотехнології, імунології, вірусології. Наявність специфічних імунних сироваток дозволяє встановити родову, видову та типову належність збудників ентеровірусних хвороб свиней. Найближчим аналогом корисної моделі є спосіб одержання специфічних імунних сироваток для діагностики ентеровірусного гастроентериту. Відома схема імунізації кролів передбачала п'ятикратне введення антигену з інтервалом сім днів. При першому та третьому введенні 3 антиген вводили підшкірно з масляною емульсією в кількості 5 і 10 см . Друге, четверте та п'яте 3 введення вірусної культуральної рідини відповідно в об'ємі 5-5-7 см здійснювали внутрішньовенно в крайову вушну вену. Як ад'ювант використовувалась масляна суміш, яка складалась з 9 частин вазелінового масла й 1 частини ланоліну, що попередньо стерилізуються автоклавуванням при 1,5 атм протягом 30 хв. Співвідношення антигену до ад'юванту становило 1,5:1. Кров відбиралась через 14 днів після останнього введення антигену [1]. Використання масляної суміші як адювант при імунізації кролів спричинює ряд ускладнень. По-перше, відбувається не повне змішування ад'юванту та антигену, що пояснюється великою різницею густини цих компонентів, за відсутності емульгатора. По-друге, масляні ад'юванти викликають розвиток сильної запальної реакції, яка запускає весь механізм імунної відповіді. Відповідно, така реакція організму на ін'єкцію крім своїх позитивних якостей має і негативні наслідки: у місці введення можливі побічні явища у вигляді утворення абсцесів, гранулем та ін. Згідно S. Nicolau [2], імунна сироватка, що отримана в результаті нетривалої імунізації за частих інокуляцій, володіє високою специфічністю, в той час, як довготривала імунізація приводить до отримання сироваток більш широкої реактивності. Антиген не є гомогенним, а містить реактивні групи або антигенні детермінанти. Різні детермінанти володіють різними антигенними властивостями: детермінанти більшого значення викликають утворення антитіл з початку імунізації, в той час як детермінанти меншого значення викликають відповідну імунну реакцію тільки після тривалої імунізації, чим пояснюється зниження специфічності сироваток, отриманих шляхом гіперімунізації. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб одержання специфічних імунних сироваток для діагностики ентеровірусних хвороб свиней, який би усував перераховані недоліки прототипу і володів новими якісними показниками. Розроблена нами схема імунізації кролів застосовується для отримання специфічних імунних сироваток до референтних штамів та польових ізолятів ентеровірусів свиней з високим титром антитіл за короткий час без ускладнень. Як реціпієнт використовуються кролі вагою 2,5-3,0 кг, сироватка крові яких цінна тим, що в ній мало видоспецифічних нормальних антитіл, які ускладнюють проведення серологічних досліджень. Розроблена нами схема імунізації кролів включає чотирикратне введення антигену з триденним інтервалом між ін'єкціями. Спосіб введення: внутрішньомязово - в стегновий мяз, внутрішньовенно - в крайову вушну вену. Як ад'ювант використовується Montanide ISA-25. Цей ад'ювант утворює стабільну емульсію з вірусним матеріалом, використовуючи просте змішування при кімнатній температурі та нижче. При цьому він добре переноситься тваринами та індукує сильну короткочасну імунну відповідь. Коефіцієнт використання Montanide ISA-25 / антиген складає 25 / 75, тобто для отримання 5 3 3 3 см суспензії для внутрішньом'язового введення потрібно 1,25 см адюванту / 3,75 см антигену. Схема імунізації кролів для одержання специфічних імунних сироваток до ентеровірусів свиней описана в таблиці 1. Таблиця 1 Схема імунізації кролів Номер ін'єкції в/м з ад'ювантом Об'єм 3 антигену, (см ) в/в без ад'юванту 50 1 5 2 5 3 5 4 5 Знекровлення Через 10 днів після останнього введення Кров відбирають через 10днів після останнього введення антигену. Після одержання сироваток, до них додають антибіотики (пеніцилін та стрептоміцин), розфасовують в 3 пеніцилінові флакони в об'ємі по 2 см і заморожують при температурі від мінус 20 до мінус 80 °C, або ліофілізують. Приклад 1 1 UA 114545 U Результати перевірки активності імунних сироваток кролів, одержаних на референтні штами та польові ізоляти ентеровірусів свиней за двома схемами імунізації з різними ад'ювантами, зведені в таблиці 2. Таблиця 2 Титр віруснейтралізуючих антитіл в імунних сироватках кролів, одержаних на референтні штами та польові ізоляти ентеровірусів свиней Титри віруснейтралізуючих антитіл Штам вірусу, до якого Контрольна схема Розроблена схема № п/п одержана гіперімунна Log2, (ланолін-вазелінова (MONTANIDE ISAсироватка середнє суміш) 25) 1 Березнянський-652 1:128-1:256 7,44±0,21 1:2048-1:4096 2 Konratice 1:128-1:256 7,33±0,19 1:1024-1:2048 3 Т-80 1:128-1:256 7,44±0,26* 1:1024-1:2048 4 F7 1:256-1:1024 9,67±0,19 1:2048-1:4096 5 К9 1:256-1:512 7,89±0,25 1:1024-1:2048 6 Ізолят 1 1:128-1:256 7,17±0,17 1:256-1:512 7 Ізолят 2 1:256-1:512 8,33±0,21 1:512-1:1024 8 Ізолят 3 1:128-1:256 7,5±0,22 1:256-1:512 9 Ізолят 4 1:64-1:128 6,17±0,17 1:128-1:256 10 Ізолят 5 1:256-1:512 8,17±0,17 1:512-1:1024 Log2, середнє 11,33±0,21 10,5±0,22 10,33±0,21 11,67±0,21 10,67±0,21 8,67±0,21 9,83±0,17 8,33±0,21 7,67±0,21 9,5±0,22 5 10 Титри віруснейтралізуючих антитіл у сироватках крові кролів, одержаних згідно розробленої нами схеми значно вищі, порівняно із контрольною схемою. При цьому час імунізації зменшився від 7 до 3 тижнів, що дає змогу швидко отримувати імунні специфічні сироватки до ентеровірусів свиней. Джерела інформації: 1. Патент на винахід UA 25055 СІ Набір діагностикумів ентеровірусного гастроентериту свиней. - 25.12.1998. - Бюл. № 6. - Романенко В. П., Полевик О. І. - 18 с. 2. Элементы общей инфрамикробиологии Elemente de inframicrobiologie generala: пер. с румынского / Шт. Николау, Н. Кажал, К. Николау. // Бухарест: Мередиане. - 1965. - С. 525-539. 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб одержання специфічних імунних сироваток для діагностики ентеровірусних хвороб свиней, що включає імунізацію кролів шляхом чотирикратного введення антигену з триденним 3 інтервалом між ін'єкціями, 1 та 3 введення - внутрішньом'язово 5 см антигену з ад'ювантом в 3 стегновий м'яз, 2 та 4 введення - внутрішньовенно 5 см антигену в крайову вушну вену, як ад'ювант використовують Montanide ISA-25, який утворює стабільну емульсію з вірусним матеріалом, добре переноситься тваринами та індукує сильну короткочасну імунну відповідь, коефіцієнт використання Montanide ISA-25/антиген складає 25/75, відбір крові проводиться через 10 діб після останнього введення. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2