Спосіб оцінки токсичності нанопорошків безкисневих сполук металів за функціональною активністю мононуклеарних клітин крові in vitro

Реферат: Спосіб оцінки токсичності нанопорошків безкисневих сполук металів за функціональною активністю мононуклеарних клітин крові in vitro включає імунологічне дослідження периферичної крові. З крові виділяють мононуклеарні клітини, розміщують їх в культуральне середовище, інкубують без стимулюючого агента та при стимуляції нанокомпозитним наноматеріалом в отриманих супернатантах мононуклеарних клітин вимірюють концентрації цитокінів IL-1, IL-6, IL-4, TNF- імуноферментним методом. При підвищенні концентрації IL-1, IL6, IL-4, TNF-, при стимуляції нанокомпозитним матеріалом оцінюють токсичність нанопорошків та їх потенціальний вплив на формування хронічних запалень та алергічних реакцій. UA 119419 U (54) СПОСІБ ОЦІНКИ ТОКСИЧНОСТІ НАНОПОРОШКІВ БЕЗКИСНЕВИХ СПОЛУК МЕТАЛІВ ЗА ФУНКЦІОНАЛЬНОЮ АКТИВНІСТЮ МОНОНУКЛЕАРНИХ КЛІТИН КРОВІ IN VITRO UA 119419 U UA 119419 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до гігієни, і може бути використана для оцінки токсичності нанопорошків безкисневих сполук металів за функціональною активністю мононуклеарних клітин крові in vitro. Важливим стає визначення чутливої ланки імунітету при впливі сучасних нанокомпозитних матеріалів, для яких, у порівнянні з їх традиційними об'ємними матеріалами, характерна низка фізико-хімічних особливостей, що впливають на механізм їх біологічної дії. Відомо, що накомпозитний матеріал здатний викликати відповідні реакції з боку різних органів і систем, в тому числі імунної, а саме підвищувати функціональну активність клітин моноцитарно-макрофагального ряду по продукції інтерлейкінів IL-1, IL-6, IL-4, TNF-α, які в нормі регулюють взаємодію клітин імунної системи, а при запаленні виконують функції активаторів запалення і тканинного пошкодження. Із зазначеного випливає, що вивчення in vitro впливу сучасних нанокомпозитних матеріалів на імунокомпетентні клітини є одним з ключових параметрів при визначенні їх імуноспецифічної активності і може бути основою для оптимізації подальших профілактичних заходів. Насамперед, це стосується вивчення функціональної активності імунокомпетентних клітин шляхом аналізу їх проліферативної здатності і особливо продукції цитокінів, які відіграють роль медіаторів, що забезпечують кооперативну міжклітинну взаємодію. Патогенетичним обґрунтуванням виникнення імунодефіцитного стану у людини, що контактує з нанокомпозитними матеріалами, може бути зниження якості міжклітинної взаємодії між мононуклеарними клітинами периферичної крові, що пов'язане з порушеннями регуляції синтезу цитокінів. В останні роки, завдяки розвитку методів кількісного визначення рівнів продукції цитокінів, був досягнутий значний прогрес у розумінні ролі цих речовин в нормі і при патології. Вивчення продукції цитокінів дозволяє отримати інформацію про функціональну активність різних типів імунокомпетентних клітин; про тяжкість запального процесу, його перехід на системний рівень, прогноз та стадії розвитку ряду важких ускладнень. Відомий спосіб впливу нанопорошку оксиду силіцію (SiO2) in vitro на клітини ротової порожнини людини TR146, за яким оцінюють взаємодію нанопорошку з клітинною мембраною та перехід через неї всередину клітини [1]. Цей спосіб дозволяє оцінити токсичну дію нанопорошку оксиду силіцію, але не враховує його вплив на функціональну властивість клітин моноцитарно-макрофагального ряду і, відповідно, на формування хронічного запалення та алергічних реакцій у людини. Цей спосіб не має ознак, які збігаються з ознаками способу, що заявляється, тобто є лише аналогом за призначенням. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб оцінки токсичності нанопорошків безкисневих сполук металів за функціональною активністю мононуклеарних клітин крові in vitro, який здійснюють шляхом виділення мононуклеарних клітин периферичної крові, їх інкубування та вимірювання концентрації цитокінів (IL-1, IL-6, IL-4, TNF-α) в отриманих супернатантах мононуклеарних клітин. Спосіб дозволяє досягти технічного результату: оцінити вплив токсичності нанопорошків безкисневих сполук металів на функціональну активність клітин моноцитарно-макрофагального ряду по продукції прозапальних цитокінів IL-1, IL-6,TNF-α та продукцію IL-4 людини і, відповідно, на формування хронічного запалення та алергічних реакцій. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб оцінки токсичності нанопорошків безкисневих сполук металів за функціональною активністю мононуклеарних клітин крові in vitro, що включає імунологічне дослідження периферичної крові, при якому з крові виділяють мононуклеарні клітини, розміщують їх в культуральне середовище, інкубують без стимулюючого агента та при стимуляції нанокомпозитним наноматеріалом, в отриманих супернатантах мононуклеарних клітин вимірюють концентрації цитокінів IL-1, IL-6, IL-4, TNF-α імуноферментним методом і при підвищенні концентрації IL-1, IL-6, IL-4, TNF-α при стимуляції нанокомпозитним матеріалом оцінюють токсичність нанопорошків та їх потенціальний вплив на формування хронічних запалень та алергічних реакцій. Спосіб здійснюють наступним чином. Мононуклеарні клітини периферичної крові виділяють із застосуванням градієнта щільності фіколл-верографіну (1,076-1,078) і поміщають в культуральне середовище RPMI-1640, що містить 10 % ембріональної телячої сироватки, 40 мкг/мл гентаміцину, 5×10М 2-меркаптоетанол 6 і 3 % L-глютаміну. Клітинну суспензію в концентрації 1,5×10 кл/мл інкубують 24 години в СO2інкубаторі при 37 °C без стимулюючого агента та при стимуляції нанокомпозитним матеріалом, в концентрації 10 мкг/мл. Для досліджуваного нанокомпозитного матеріалу нітриду титану (TiN) використовувалася концентрація, що відповідала добовій дозі в перерахунку на кількість клітин 6 лімфоцитарно-моноцитарного ряду в 1 мл культурального середовища - 1,5×10 кл/мл. 1 UA 119419 U 5 10 15 20 В отриманих супернатантах мононуклеарних клітин імуноферментним методом (ELISA) вимірюють концентрацію цитокінів (IL-1, IL-6, IL-4, TNF-α) із застосуванням тест-систем ЗАТ "Вектор Бест" (Росія) [2]. Тестування проводять за допомогою імуноферментного аналізатора "Stat Fax-303 Plus". За результатами досліджень було встановлено, що концентрація цитокінів при здійсненні способу без стимулюючого агента складає: IL-1-31,9±8,9 пкг/мл; IL-6-24,9±9,8 пкг/мл; IL-4-3,6±2,0 пкг/мл та TNF-α - 36,7±10,9 пкг/мл. Концентрація цитокінів при здійсненні способу при стимуляції нанокомпозитним матеріалом складає: IL-1-73,8±15,9 пкг/мл; IL-6-57,7±14,9 пкг/мл; IL-4-29,5±8,1 пкг/мл та TNF-α - 78,4±9,8 пкг/мл. Тобто стимуляція нанокомпозитним матеріалом активності мононуклеарних клітин периферичної крові підвищує концентрацію цитокінів IL-1, IL-6, IL-4, TNF-α, що підтверджує токсичний вплив нанопорошків і, відповідно, потенціальний вплив на формування хронічних запалень та алергічних реакцій працівників, зайнятих виробництвом нанопорошків тугоплавких сполук металів. Джерела інформації: 1. Chor Yong Тау, Wanru Fang, Magdiel Inggrid Setyavati. Reciprocal Responseof Human Oral EpithelialcellstoInternalizedSiliciaNanoparticles // Part. Syst. Charact. - 2013. - DOI: 10.1002/ppsc.20130011. - 10 p. 2. Г.Н.Дранник. Клиническая иммунология и аллергология. - К.: ООО "Полиграф плюс", 2010. - 552 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб оцінки токсичності нанопорошків безкисневих сполук металів за функціональною активністю мононуклеарних клітин крові in vitro, що включає імунологічне дослідження периферичної крові, при якому з крові виділяють мононуклеарні клітини, розміщують їх в культуральне середовище, інкубують без стимулюючого агента та при стимуляції нанокомпозитним наноматеріалом, в отриманих супернатантах мононуклеарних клітин вимірюють концентрації цитокінів IL-1, IL-6, IL-4, TNF- імуноферментним методом, і при підвищенні концентрації IL-1, IL-6, IL-4, TNF- при стимуляції нанокомпозитним матеріалом оцінюють токсичність нанопорошків та їх потенціальний вплив на формування хронічних запалень та алергічних реакцій. 35 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2