Спосіб кількісного визначення концентрації пероксинітриту в гомогенаті м’яких тканин

Реферат: Спосіб кількісного визначення концентрації пероксинітриту в гомогенаті м'яких тканин включає визначення концентрації атомарного йоду, що утворюється в реакції пероксинітриту та йодиду калію в присутності фосфатного буферного розчину із рН=7,0. Для аналізу беруть 0,1 мл 10 % гомогенату тканин, загальний робочий об'єм зменшується до 5 мл. Використовують кювету із довжиною оптичного шляху 10 мм, концентрацію пероксинітриту обчислюють за формулою: С=20·А, де С - концентрація пероксинітриту мкмоль/г, А - адсорбція проби на довжині хвилі 355 нм. 20 - коефіцієнт пропорційності, що враховує розведення проби підчас аналізу, довжину оптичного шляху, коефіцієнт молярної екстинкції йоду при довжині хвилі 355 нм, вагу проби. Для визначення швидкості та джерел продукції пероксинітриту використовують 5 хв. інкубація при t=37 °C та індуктори у вигляді: 0,1 мл буферного розчину (в 1 л дистильованої води розчинити 5,37 г безводного однозаміщеного фосфату калію, 8,5 хлориду натрію та 1,5 г гідроксиду натрію), 0,1 мл 3 % розчину НАДН, 0,1 мл 3 % розчину НАДФН, 0,1 мл розчину "Пірогенал". UA 120064 U (54) СПОСІБ КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ КОНЦЕНТРАЦІЇ ПЕРОКСИНІТРИТУ В ГОМОГЕНАТІ М'ЯКИХ ТКАНИН UA 120064 U UA 120064 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до біологічної хімії та патофізіології. Пероксинітрит (ONOO) - один із метаболітів циклу оксиду азоту (NО) [Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих /[В.П. Реутов, Е.Г. Сорокина, В.Е. Охотин и др.] // М.: "Наука", 1998. - 157 с.], із яким пов'язують розвиток оксидаційного стресу і пов'язаного з цим ушкодження клітин організму [Eliasson MJ Neuronal nitric oxide synthase activation and peroxynitrite formation in ischemic stroke linked to neural damage /MJ Eliasson, Z. Huang, RJ Ferrante et al. //J. Neurosci. - 1999. - № 14. - P. 5910-5918.]. Тому кількісне визначення рівня пероксинітриту є важливим для оцінки функціонального стану циклу оксиду азоту (NO) та рівня оксидаційного стресу. Найближчим аналогом є спосіб визначення рівня пероксинітриту у водних розчинах та фотолізатах нітратів [Шрайбман Г.Н. Спектрофотометрические методики определения пероксинитрита и нитрита /Г.Н. Шрайбман, Е.П. Дягилева, А.В. Скибина // Вестник КемГУ. 2011. - № 45. - С. 200-206]. Спосіб полягає в тому, що до мірної колби місткістю 25 мл додається 5 мл 5 % розчину йодиду калію та 10 мл фосфатного буферного розчину (рН=7,0), далі додається від 0,25 до 4 мл розчину пероксинітриту, об'єм доводиться до мітки дистильованою водою. Через 2-15 хв. визначається оптична густина на довжині хвилі 355 нм проти холостої проби. Концентрація пероксинітриту визначається за калібрувальним графіком. Однак найближчий аналог має недоліки. По-перше, він не є адаптованим для використання при дослідженні гомогенатів тканин людини та тварин. По-друге, для визначення концентрації пероксинітриту необхідний калібрувальний графік. По-третє, використовується велике розведення (0,25 мл розчину пероксинітриту розводиться до 25 мл робочого розчину). Почетверте, даний спосіб не дозволяє визначити швидкість та джерела продукції пероксинітриту. В основі корисної моделі поставлена задача вдосконалити найближчий аналога, шляхом його адаптації для дослідження гомогенату тканин, заміна калібрувального графіку на розрахунок за формулою, зменшення робочого об'єму проби, встановлення швидкості продукції пероксинітриту та джерел його продукції. Поставлена задача вирішується тим, що у способі кількісного визначення концентрації пероксинітриту в гомогенаті м'яких тканин, що включає визначення концентрації атомарного йоду, що утворюється в реакції пероксинітриту та йодиду калію в присутності фосфатного буферного розчину із рН=7,0, згідно з корисною моделлю, для аналізу береться 0,1 мл 10 % гомогенату тканин, загальний робочий об'єм зменшується до 5 мл, використовується кювета із довжиною оптичного шляху 10 мм, концентрація пероксинітриту обчислюється за формулою: С=20А, де С - концентрація пероксинітриту мкмоль/г, А - адсорбція проби на довжині хвилі 355 нм, 20 - коефіцієнт пропорційності, що враховує розведення проби підчас аналізу, довжину оптичного шляху, коефіцієнт молярної екстинкції йоду при довжині хвилі 355 нм, вагу проби; для визначення швидкості та джерел продукції пероксинітриту використовуються 5 хв. інкубація при t=37 °C та індуктори у вигляді: 0,1 мл буферного розчину (в 1 л дистильованої води розчинити 5,37 г безводного однозаміщеного фосфату калію, 8,5 хлориду натрію та 1,5 г гідроксиду натрію), 0,1 мл 3 % розчину НАДН, 0,1 мл 3 % розчину НАДФН, 0,1 мл розчину "Пірогенал". Спосіб здійснюють наступним чином: в пробірку місткістю 10 мл набирається для аналізу 0,1 мл 10 % гомогенату тканин (на 0,1 Μ трис-буферному розчині з рН=7,4), далі додається 3,9 мл 0,2 Μ фосфатного буферного розчину (рН=7,0) та 1 мл 5 % розчину йодиду калію, після 5 хв проводиться центрифугування 3000 об./хв. 10 хв., далі визначається поглинання 1 мл надосаду на довжині хвилі 355 нм в кюветі з довжиною оптичного шляху 10 мм проти контролю (1 мл суміші 1 мл 5 % йодиду калію та 4,0 мл 0,2 Μ фосфатного буферного розчину із рН=7,0), кількість пероксинітриту визначається за формулою: С=20 А, де С - концентрація пероксинітриту в мкмоль/г, А - поглинання проби, 20 - коефіцієнт перерахунку, що враховує розведення проби, довжину оптичного шляху, коефіцієнт молярної екстинкції та вагу проби. Далі до чотирьох аліквот гомогенату додаються наступні індуктори: 0,1 мл буферного розчину (в 1 л дистильованої води розчинити 5,37 г безводного однозаміщеного фосфату калію, 8,5 хлориду натрію та 1,5 г гідроксиду натрію), 0,1 мл 3 % розчину НАДН, 0,1 мл 3 % розчину НАДФН та 0,1 мл розчину "Пірогенал". Після 5 хв. інкубації при t=37 °C проводимо визначання концентрації пероксинітриту за методикою, зазначеною вище. Для оцінки базової продукції пероксинітриту використовуємо формулу: V b=(Cb-C)/5, мкмоль/хвт, де С - концентрація пероксинітриту до використання індуктора, Сb - концентрація пероксинітриту після інкубації із використанням буферного розчину як індуктора. Для оцінки НАДФН-залежної, мікросомальної продукції пероксинітриту використовуємо формулу: Vmc=(Cmc-C)/5, мкмоль/хвт, де С концентрація пероксинітриту до використання індуктора, Cmc - концентрація пероксинітриту після інкубації із використанням 3 % розчину НАДФН як індуктора. Для оцінки НАДН-залежної, мітохондріальної продукції пероксинітриту використовуємо формулу: V mt=(Сmt-С)/5, мкмоль/хвт, 1 UA 120064 U 5 10 де С - концентрація пероксинітриту до використання індуктора, Сph - концентрація пероксинітриту після інкубації із використанням 3 % розчину НАДН як індуктора. Для оцінки НАДФН-оксидазо-залежної, фагоцитарної продукції пероксинітриту використовуємо формулу: Vph=(Cph-С)/5, мкмоль/хвт, де С - концентрація пероксинітриту до використання індуктора, С ph концентрація пероксинітриту після інкубації із використанням розчину "Пірогенал" як індуктора. Позитивний ефект полягає в тому, що даний спосіб дозволяє визначити кількість пероксинітриту в гомогенаті тканин, дає можливість не використовувати калібрувальний графік, зменшує загальне розведення проби в ході аналізу в двічі, дозволяє визначити базову швидкість продукції пероксинітриту та його індуковану продукцію, що вказує на джерела його продукції. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 Спосіб кількісного визначення концентрації пероксинітриту в гомогенаті м'яких тканин, що включає визначення концентрації атомарного йоду, що утворюється в реакції пероксинітриту та йодиду калію в присутності фосфатного буферного розчину із рН=7,0, який відрізняється тим, що для аналізу беруть 0,1 мл 10 % гомогенату тканин, загальний робочий об'єм зменшується до 5 мл, використовують кювету із довжиною оптичного шляху 10 мм, концентрацію пероксинітриту обчислюють за формулою: С=20·А, де С - концентрація пероксинітриту мкмоль/г, А - адсорбція проби на довжині хвилі 355 нм, 20 - коефіцієнт пропорційності, що враховує розведення проби під час аналізу, довжину оптичного шляху, коефіцієнт молярної екстинкції йоду при довжині хвилі 355 нм, вагу проби; для визначення швидкості та джерел продукції пероксинітриту використовують 5 хв. інкубація при t=37 °C та індуктори у вигляді: 0,1 мл буферного розчину (в 1 л дистильованої води розчинити 5,37 г безводного однозаміщеного фосфату калію, 8,5 хлориду натрію та 1,5 г гідроксиду натрію), 0,1 мл 3 % розчину НАДН, 0,1 мл 3 % розчину НАДФН, 0,1 мл розчину "Пірогенал". Комп’ютерна верстка В. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2