Спосіб визначення загальної нітрат- та нітритредуктазної активності в гомогенаті м’яких тканин

Реферат: Спосіб визначення загальної нітрат-нітритредуктазної активності в гомогенаті м'яких тканин включає визначення спектрофотометричним методом кількості азобарвників, які утворюються в реакції із реактивом Грісса. Визначення загальної нітрат-нітритредуктазної активності проводять в гомогенаті м'яких тканин, як донор електронів для нітрат- та нітритредуктаз використовують НАДН (1 мг/мл); як буферну систему для підтримання постійного, ацидотичного відносно норми, рН використовують фосфатний буфер (рН=7,0); також до проби додають 100 мкМ нітриту та 100 мкМ нітрату натрію. UA 111232 U (12) UA 111232 U UA 111232 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до біологічної хімії та патофізіології. Нітратредуктазні та нітритредуктазні системи організму людини привертають до себе все більше уваги в наукових колах, оскільки їх роль в регуляції такого процесу як синтез оксиду азоту є суперечливою [Jаnsson Е.А. А mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis /E.A. Jansson, L. Huang, R. Malkey et al. //Nat. Chem. Biol. -2008. -№ 4. -P. 411-417. Lundberg J.O. Inorganic nitrate is a possible source for systemic generation of nitric oxide /J.O.Lundberg, M. Govoni //Free Radic. Biol. Med. -2004. -№ 37. -P. 395-400]. Проте в даний час не існує спектрофотометричної методики по визначенню окремо активності нітратредуктаз та нітритредуктаз в гомогенаті м'яких тканин ссавців. Для визначення загальної активності нітратредуктаз та нітритредуктаз в гомогенаті м'яких тканин пропонується використати як маркер кольорову реакцію між нітрит-іоном, сульфаніловою кислотою, нафтиламіном-1 з утворенням азобарвників. Відомий спосіб визначення активності нітратредуктази в слині людини [Храмов В.А. Нитратредуктазная активность слюны человека /В.А. Храмов //Вопр. Питания. -1992. -№ 5-6. -С. 65-68.], який було нами взято за прототип. Метод прототипу полягає в тому, що до 0,3 мл проби змішаної слини додавали 0,2 мкмоль нітриту натрію. Суміш інкубують при t=36 °C впродовж 2 годин. Кінцевий рівень нітритів визначають за реакцією Грісса. Максимум світлопоглинання кольорового продукту припадає на довжину хвилі в 520 нм. Коефіцієнт молярної екстинкції при цій довжині 4 -1 -1 хвилі складає 4,010 моль см . Наведений спосіб має ряд недоліків: не враховується активність нітратредуктазної системи оскільки невідомою є кількість нітратів до інкубації, яка здатна змінювати кількість нітритів; не враховується активність нітритредуктазної системи, яка здатна змінювати кількість нітритів, перетворюючи їх на NO; окрім того спосіб не є адаптованим для оцінки активності ферментів у гомогенаті м'яких тканин ссавців. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення способу визначення нітратредуктазної активності шляхом розділення на дві складові: нітратредуктазну та нітритредуктазну та створення оптимальних умов перебігу реакції в гомогенаті тканин. Поставлена задача вирішується шляхом використання як донора електронів водного розчину НАДН (1 мг/мл) як буферну систему для підтримання постійного, ацидотичного відносно норми, рН використовують фосфатний буфер (рН=7,0); також до проби додають 100 мкМ нітрату та 100 мкМ нітриту натрію; функціонування нітратредуктаз оцінюється за формулою: R1=1000((C2-C1)-(C3-C4))/(60N), R2=1000(C2-(C4-(X-У)))/(60N), при Х=(C2-C1), У=(C3C4), де R1 - загальна активність нітратредуктаз мкмоль/хвг, порахована на 1 л гомогенату. R2 загальна активність нітритредуктаз мкмоль/хв·г, порахована на 1 л гомогенату. С 1-4 концентрації нітритів в відповідних аліквотах (1-4) мкмоль, порахована на 1 мл гомогенату. N кількість загального білка порахована біуретовим методом г/л. 60 - час інкубації в хв. 1000 коефіцієнт перерахунку на 1 л гомогенату. Спосіб здійснюється наступним чином: береться 4 однакові за об'ємом проби матеріалу (аліквота1, аліквота2, аліквота3, аліквота4) по 0,1 мл 10 % гомогенату м'яких тканин (гомогенат готується за стандартною методикою на трис-буфері), та до аліквоти 3 та 4 додається 1 мл фосфатного буферного розчину (рН=7,0). Готується розчин відновника - сульфату гідразину: в колбу місткістю 50 мл поміщають 0,275 г гідразину-сульфату, доводять до мітки дистильованою водою та ретельно перемішують. Готуються 100 мкМ розчин нітриту натрію: в колбу місткістю 1 л насипають 6,9 г нітриту натрію з точністю до 0,01 та доводять до мітки водою. Готуються 100 мкМ розчин нітрату натрію: в колбу місткістю 1 л насипають 8,5 г нітрату натрію з точністю до 0,01 та доводять до мітки водою. Готується 6 % розчин сульфату цинку: 6 г сульфату цинку перенести в мірну колбу на 100 мл та довести дистильованою водою до мітки. Готується 1 мг/мл розчин НАДН: 10 мг розчиняють в 10 мл бідистильованої води. Розчин не стійкий, тому готується безпосередньо перед використанням. До аліквоти 1 та 2 слід додають 0,1 мл 6 % сульфату цинку для депротеїнізації. До аліквоти 1 додають 1,1 мл 1 % розчину сульфанілової кислоти та тримають 5 хв. в темному місці для завершення реакції. Потім додають 1,1 мл 1 % розчину нафтиламіну-1. Центрифугують при 3000 об/хв. 15 хв. 1 мл надосаду фотометрують в кюветі із довжиною оптичного шляху 1 см, при довжині хвилі 520 нм. Концентрація нітритів визначається за формулою С1=110 А1 мкмоль. До аліквоти 2 додають 1,1 мл розчину відновника, та витримують на водяній бані при t=40 °C 5 хв. Далі додають 1,1 мл 1 % розчину сульфанілової кислоти та тримають 5 хв. в темному місці для завершення реакції. Потім додають 1,1 мл 1 % розчину нафтиламіну-1. Центрифугують при 3000 об/хв. 15 хв., 1 мл надосаду фотометрують в кюветі із довжиною оптичного шляху 1 см, при довжині хвилі 520 нм. Концентрація нітритів визначається за формулою С2=137,5А2 мкмоль. До аліквоти 3 додають 0,1 мл 1 мг/мл розчину НАДН. 1 UA 111232 U 5 10 15 Інкубація при t=37 °C 60 хв., додають 0,1 мл 6 % сульфату цинку. Далі додають 1,1 мл розчину відновника, та витримують на водяній бані при t=40 °C 5 хв. Далі додають 1,1 мл 1 % розчину сульфанілової кислоти та тримають 5 хв. в темному місці для завершення реакції. Потім додають 1,1 мл 1 % розчину нафтиламіну-1. Центрифугують при 3000 об/хв. 15 хв., 1 мл надосаду фотометрують в кюветі із довжиною оптичного шляху 1 см, при довжині хвилі 520 нм. Кількість нітритів розраховується за формулою С 3-170А3 мкмоль. До аліквоти 4 додають 0,1 мл 1 мг/мл розчину НАДН. Інкубація при t=37 °C 60 хв., додають 0,1 мл 6 % сульфату цинку. Далі додають 1,1 мл 1 % розчину сульфанілової кислоти та тримають 5 хв. в темному місці для завершення реакції. Потім додають 1,1 мл 1 % розчину нафтиламіну-1. Центрифугують при 3000 об/хв. 15 хв., 1 мл надосаду фотометрують в кюветі із довжиною оптичного шляху 1 см, при довжині хвилі 520 нм. Концентрація нітритів розраховується за формулою С 4=142,5А4 мкмоль. Активність нітратредуктазної системи визначають за формулою: R1=1000((C2-C1)-(C3C4))/(60N), де N - кількість білка визначена біуретовим методом, 1000 - коефіцієнт перерахунку на 1 л гомогенату. Одиниці виміру - мкмоль/хвг. Активність нітритредуктазної системи визначають за формулою: R2=1000 (C2-(C4-(X-У)))/(60N), де Х=(C2-C1), У=(C3-C4), N кількість білка визначена біуретовим методом, 1000 - коефіцієнт перерахунку на 1 л гомогенату. Одиниці виміру - мкмоль/ хвг. Позитивний ефект полягає в тому, що описаний спосіб дозволяє оцінити функціонування як нітрат - так і нітритредуктазної системи в гомогенаті м'яких тканин. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 35 Спосіб визначення загальної нітрат-нітритредуктазної активності в гомогенаті м'яких тканин, що включає визначення спектрофотометричним методом кількості азобарвників, які утворюються в реакції із реактивом Грісса, який відрізняється тим, що визначення загальної нітратнітритредуктазної активності проводять в гомогенаті м'яких тканин, як донор електронів для нітрат- та нітритредуктаз використовують НАДН (1 мг/мл); як буферну систему для підтримання постійного, ацидотичного відносно норми рН використовують фосфатний буфер (рН=7,0); також до проби додають 100 мкМ нітриту та 100 мкМ нітрату натрію; функціонування нітратнітритредуктаз рахується за формулою: R1=1000((C2-C1)-(C3-C4))/(60N), R2=1000(C2-(C4-(X-У)))/(60N), при Х=(C2-C1), У=(C3-C4), де R1 - загальна активність нітратредуктаз мкмоль/хвг, порахована на 1 л гомогенату, де R2 - загальна активність нітритредуктаз мкмоль/хвг, порахована на 1 л гомогенату, С1-4 - концентрації нітритів в відповідних аліквотах (1-4) мкмоль, порахована на 1 мл гомогенату, N - кількість загального білка порахована біуретовим методом, г/л, 60 - час інкубації в хв., 1000 - коефіцієнт перерахунку на 1 л гомогенату. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2