Спосіб визначення загальної аргіназної активності в гомогенаті м’яких тканин

Реферат: Спосіб визначення загальною аргіназною активністю в гомогенаті м'яких тканин включає визначення спектрофотометричним методом кольорових продуктів реакції L-орнітину та нінгідрину. Визначення кількості L-орнітину проводять в гомогенаті м'яких тканин на довжині хвилі 515 нм та довжині оптичного шляху в 10 мм. Першим етапом визначають вихідну кількість L-орнітину в гомогенаті м'яких тканин; як буферний розчин використовують фосфатний буфер, інкубацію гомогенату тканин проводять в присутності фосфатного буферного розчину. Другим етапом визначають кінцеву концентрацію L-орнітину в гомогенаті м'яких тканин. UA 111874 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ЗАГАЛЬНОЇ АРГІНАЗНОЇ АКТИВНОСТІ В ГОМОГЕНАТІ М'ЯКИХ ТКАНИН UA 111874 U UA 111874 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до біологічної хімії та патофізіології. Аргінази (EC 3.5.3.1) - група ферментів, що каталізує розщеплення L-аргініну до L-орнітину та сечовини. Аргінази є субстратними конкурентами із NO-синтазами (EC 1.14.13.39) за Lаргінін. Один із кінцевих продуктів реакції NO-синтазаного шляху - оксид азоту (NO) здатен інгібувати швидкість реакції, що контролюється аргіназами [Durante W. Arginase: a critical regulator of nitric oxide synthesis and vascular function / W. Durante, F.K. Johnson, R.A. Johnson // Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. - 2007. - № 34. - P. 906-911.]. Тому визначення функціонального стану аргіназного шляху метаболізму дозволяє оцінити авторегуляцію циклу L-аргініну та стан циклу оксиду азоту. Відомий спосіб визначення активності аргінази в сироватці крові [В.А. Храмов Модификация метода определения орнитина по Chinard и ее использование для количественного определения сывороточной аргиназы / В.А. Храмов, Г.Г. Листопад // Лабораторное дело. - 1973. - № 10. - С. 591-592.], який було взято нами у якості прототипу. Метод прототипу полягає в тому, що до 0,1 мл сироватки крові додають 0,5 мл ізотонічного розчину натрію хлориду та 0,2 мл 0,024 Μ розчину L-аргініну, рН проби = 7,0. Інкубаційну суміш потім інкубують при t=37 °C, після чого до неї додають 1 мл льодоцтової кислоти та 0,1 мл нінгідринового реактиву (2,5 % р-р нінгідрину на кислотній суміші: 2 частини 60 % ортофосфорної кислоти та 3 частини льодоцтової кислоти в співвідношенні 6 до 4 із водою). Суміш кип'ятять протягом години на водяній бані. Потім до суміші додають 1 мл 20 % розчину трихлороцтової кислоти для осадження білків та центрифугують при 8000 об./хв. 10-15 хв. надосадову рідину колориметрують при довжині хвилі 490 нм, товщина кювети 3 мм. Однак цей метод має ряд недоліків. По-перше він не пристосований для визначення активності ферментів в гомогенаті тканин людей та інших ссавців, по-друге він не враховує можливу наявність орнітину в гомогенаті до інкубації. По-третє запропонований світлофільтр на 25 нм відрізняється від максимального рівня поглинання орнітину (515 нм). В основі корисної моделі поставлена задача по вдосконаленню методу-прототипу шляхом його адаптації для дослідження гомогенату тканин, наближення довжини хвилі світлофільтра до максиму поглинання та врахування вихідного рівня орнітину в гомогенаті. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення загальної аргіназної активності в гомогенаті м'яких тканин включає визначення спектрофотометричним методом кольорових продуктів реакції L-орнітину та нінгідрину (реактив Chinard) після 20 годинної інкубації при t=37 °C із 0,2 мл 0,024 Μ розчину L-аргініну, згідно з корисною моделлю, визначення кількості Lорнітину проводять в гомогенаті м'яких тканин на довжині хвилі 515 нм та кювета із довжиною оптичного шляху 10 мм, першим етапом визначається вихідна концентрація L-орнітину, інкубація проводиться в присутності 0,5 мл фосфатного буферного розчину із рН=7,0, другим етапом вимірюється кінцева концентрація L-орнітину, загальна аргіназна активність обчислюється за формулою: ARG=1000(A2232-Α1216)/(1200Ν), де Α1 і А2 - адсорбція 1 та 2 аліквоти відповідно, 1200 - інкубація в хв., 1000 коефіцієнт перерахунку на 1 л гомогенату, а N загальна кількість білка, розрахована біуретовим методом г/л. Спосіб здійснюється наступним чином: для врахування вихідного рівня L-орнітину в досліджуваному гомогенаті слід відібрати 0,1 мл гомогенату (аліквота 1). До 0,1 мл аліквоти 1 додати 0,5 мл фосфатного буферу (рН=7,0). Потім додаємо 1 мл льодоцтової кислоти та 0,1 мл нінгідринового реактиву. Кип'ятимо на водяній бані 1 годину. Потім додаємо 1 мл 20 % розчину трихлороцтової кислоти та центрифугуємо при 3000 об./хв. 40 хв. Потім 1,0 мл надосаду колориметруємо при довжині хвилі 515 нм, в кюветі із довжиною оптичного шляху 1 см. Отримуємо величину поглинання A1 (Absorbtion). Цю величину слід перевести в концентрацію орнітину за формулою: С1=216А1 (мкмоль). Для визначення кінцевої концентрації орнітину до 0,1 мл Аліквоти 2 додати 0,5 мл фосфатного буферу (рН=7,0) та 0,2 мл 0,024 Μ розчину Lаргініну. Суміш інкубується впродовж 20 годин при t=37 °C. Потім додаємо 1 мл льодоцтової кислоти та 0,1 мл нінгідринового реактиву. Кип'ятимо на водяній бані 1 годину. Потім додаємо 1 мл 20 % розчину трихлороцтової кислоти, та центрифугуємо при 3000 об./хв. 40 хв. Потім 1,0 мл надосаду колориметруємо при довжині хвилі 515 нм, в кюветі із довжиною оптичного шляху 1 см. Отримуємо величину поглинання А2 (Absorbtion). Цю величину слід перевести в концентрацію орнітину за формулою: С2=232А2 (мкм оль). Тоді загальну активність аргінази в гомогенаті тканин можна вирахувати за формулою: ARG=1000(C2-C1)/(TN) де ARG - загальна аргіназна активність, С1 і С2 концентрації аліквоти 1 та 2 відповідно, а Т - час інкубації (20 годин = 1200 хв.), а N - концентрація білка в г/л порахована біуретовим методом. Одиниці виміру мкмоль/хв.г, 1000 - перерахунок на 1 л гомогенату. Позитивний ефект полягає в тому, що даний спосіб дозволяє розрахувати загальну активність аргіназ в гомогенаті м'яких тканин, враховуючи вихідну концентрацію L-орнітину та 1 UA 111874 U кількість загального білка в гомогенаті, що дає можливість порівняння результатів при використанні способу у тканинах із різною кількістю міжклітинної рідини. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 20 Спосіб визначення загальної аргіназної активності в гомогенаті м'яких тканин, що включає визначення спектрофотометричним методом кольорових продуктів реакції L-орнітину та нінгідрину (реактив Chinard) після 20 годинної інкубації при t=37 °C із 0,2 мл 0,024 Μ розчину Lаргініну, який відрізняється тим, що визначення кількості L-орнітину проводиться в гомогенаті м'яких тканин на довжині хвилі 515 нм та довжині оптичного шляху в 10 мм, першим етапом визначається вихідна кількість L-орнітину в гомогенаті м'яких тканин; як буферний розчин використовують 0,5 мл фосфатний буфер (рН=7,0), інкубація гомогенату тканин проводиться в присутності 0,5 мл фосфатного буферного розчину (рН=7,0), другим етапом визначається кінцева концентрація L-орнітину в гомогенаті м'яких тканин, загальна аргіназна активність визначається за формулою: ARG=1000(A2232-A1216)/(1200N), де ARG - загальна активність аргіназ мкмоль/хвг, розрахована на 1 л гомогенату, А1 - адсорбція проби до інкубації, А2 - адсорбція проби після інкубації, N - концентрація загального білка, розрахована біуретовим методом г/л, 1000 - коефіцієнт перерахунку на 1 л гомогенату, 1200 - час інкубації в хв. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2