Спосіб визначення стійких до рифампіцину мікобактерій туберкульозу

Спосіб визначення стійких до рифампіцину мікобактерій туберкульозу, що включає висів дослідного матеріалу на щільне поживне середовище, інкубацію з подальшим обліком результатів, який відрізняється тим, що перед висівом дослідний матеріал інкубують при температурі 37°С в активаторі росту з 2,0 мкг/мл рифампіцину протягом 2 діб, а облік результатів проводять при наявності росту стійких до рифампіцину мікобактерій туберкульозу. (19) (21) u200508078 (22) 16.08.2005 (24) 16.01.2006 (46) 16.01.2006, Бюл. № 1, 2006 р. (72) Журило Олександр Анатолійович, Барбова Анна Іванівна, Трофімова Поліна Станіславівна, Миронченко Світлана Віталіївна (73) ІНСТИТУТ ФТИЗІАТРІЇ І ПУЛЬМОНОЛОГІЇ ІМ. Ф.Г. ЯНОВСЬКОГО АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ 3 12189 4 №93051626 RU, МКИ – 6 C12Q1/04 Екатеринбургпозначається на термінах одержання відповіді і, ский филиал НПО «Фтизиопульмонология» МЗ зрештою, на ефективності лікування хворих. РФ. - З. №93051626/13; Заявл.09.11.1993; В основу корисної моделі поставлене завданОпубл.27.09.1996. Способ определения лекарстня удосконалити спосіб визначення стійких до ривенной чувствительности микобактерий туберкуфампіцину М. tuberculosis, в якому шляхом ввелеза]. Однак, даний спосіб має також суттєвий дення в активатор росту мікобактерій недолік: термін дослідження матеріалу хворого туберкульозу рифампіцину досягається скороченскладає 7-10 тижнів. ня термінів визначення в дослідному матеріалі Відомий спосіб визначення стійких до антимістійких до рифампіцину мікобактерій туберкульозу. кобактеріальних препаратів М.tuberculosis шляхом Поставлене завдання вирішується тим, що у посіву діагностичного матеріалу на щільне яєчне способі визначення стійких до рифампіцину поживне середовище з антибактеріальним препаМ.tuberculosis, що включає висів дослідного матератом, який відрізняється тим, що осад з діагносріалу на щільне поживне середовище, інкубацію тичного матеріалу попередньо заливають рідким посіву з подальшим обліком результатів, згідно середовищем Школьнікової, здійснюють підрокорисної моделі, перед посівом дослідний матеріщення мікобактерій туберкульозу протягом 3-х діб ал інкубують при 37°С в активаторі росту з при 37ºС, потім середовище заміняють на свіже 2,0мкг/мл рифампіцину протягом 2 діб, а облік ресередовище Школьнікової, після чого виділяють зультатів проводять по наявності росту стійких до осад і засівають на щільне яєчне середовище рифампіцину М.tuberculosis. [див. З. №2003101783 RU, МКИ - 7G01N33/48 / Проведеними дослідженнями з використанням Государственное учреждение Якутский НИИ тубестандартного штаму М.tuberculosis H37Rv, ркулеза МЗ Республики Саха (Якутия). - З. M.tuberculosis (клінічних ізолятів від хворих на ту№2003101783/15; Заявл.22.01.2003; беркульоз легень) рифампіцинчутливих і рифампіОпубл.27.07.2004. Способ определения лекарстцинстійких у порівнянні з класичними методами венной чувствительности туберкулеза]. Застосупостановки тесту медикаментозної стійкості (провання цього способу дозволяє визначній прямим порцій і абсолютних концентрацій) встановлено, методом (тобто з патологічного матеріалу, наприщо при додаванні до активатора росту мікобактеклад, харкотиння) чутливість М.tuberculosis до рій ріфампіцину в концентрації 2,0 мкг/мл та інкупротитуберкульозних препаратів, але ж термін бації в ньому дослідного матеріалу протягом 2 діб дослідження загалом складає 31 добу. інгібується ріст чутливих до рифампіцину М. Відомий спосіб визначення медикаментозної tuberculosis, в результаті чого вони не ростуть на чутливості мікобактерій туберкульозу до рифампіпоживному середовищі. Це дозволяє скоротити цину шляхом посіву дослідної культури на щільне термін дослідження до 3-5 діб (як при прямому, так поживне середовище Льовенштайна-Єнсена з і при непрямому визначенні медикаментозної стіймедикаментозним препаратом, інкубації посівів і кості до рифампіцину). візуальної оцінки росту мікобактерій туберкульозу, Спосіб здійснюють таким чином. яку проводять по підрахунку колоній для визнаПісля отримання патологічного матеріалу з чення співвідношення (пропорції) між чутливими і метою деконтамінації та гомогенізації проводять стійкими особинами в популяції штаму його передпосівну обробку згідно загальноприйняМ.tuberculosis, який виділено від хворого на тубертих методик - кислотами, лугами або різними декульоз, до рифампіцину в "критичній" концентрації тергентами, центрифугують, отриманий осад для [див. Інструкція з бактеріологічної діагностики тупосіву на середовище обробляють активатором беркульозної інфекції / Ю.І. Фещенко, О.А. Журиросту в співвідношенні 1:1, в яке попередньо внело, М.Т. Клименко, П.С. Трофімова // Наказ МОЗ сено 2,0мкг/мл рифампіцину. Суспензію інкубують України №45. - Київ, 2002. - 118с.]. Облік результапри температурі 37,0±1,0°С протягом 2 діб. Пожитів проводять по відсотку або кількості колоній, що вне середовище готують безпосередньо перед виросли через 28 діб, а остаточний результат аназастосуванням. Для цього беруть 9,0г сухого серелізу видається через 42 дні. Загальний час дослідовища ВКГ, розмішують його в 100,0мл дистидження, включаючи первинну ізоляцію культури, льованої води, кип'ятять 2-3 хвилини до повного складає 2 і навіть 3 місяця [див. Ильина Т.Я., Жанрозплавлений агару, фільтрують через ватногиреев Т.М., Сидоренко О.А. Резистентность мимарлевий фільтр, розливають у відповідний посуд, кобактерий туберкулеза у впервые выявленных стерилізують при 120,0±1,0°С протягом 15 хвилин больных туберкулезом и при рецидивах заболевау автоклаві. Перед висівом патологічного матеріания // Пробл. туберкулеза. - 2003. - №5. - С.19-21]. лу до свіжо-приготованого середовища, охолоЗастосування цього способу дозволяє визнадженого до 40°С додають стерильні робочі розчичити непрямим методом резистентність ни кетоконазолу, інтраконазолу та гентаміцину у М.tuberculosis до протитуберкульозних препаратів, співвідношенні: 1:0,5, 1 на 1,0мл середовища відщо робить процес визначення стійкості дуже триповідно, після чого ретельно струшують суміш. валим. Слід відмітити, що для кожного живильного Далі в асептичних умовах середовище розливають середовища існують власні критерії стійкості: чутв стерильні чашки Петрі шаром 6,0-8,0мм. Готове ливі М.tuberculosis ростуть лише в певних для того поживне середовище жовтого кольору і повинно чи іншого препарату межах концентрації, а ті, що, відповідати рН7,2±0,2. Тому воду для його пригоростуть при більшому вмісті препарату в середотування треба брати з таким же рН. Після застивищі, є медикаментозностійкими. гання середовища негайно здійснюють посів за Таким чином, основним недоліком вищезгададопомогою шприца одноразового використання у них способів є тривале виконання. Це негативно дозі 1,5мл суспензії заздалегідь підготовленого 5 12189 6 патологічного матеріалу, обробленого активатолу до свіжоприготованого середовища, охолоджером росту. Засіяні чашки герметизують скотчем з ного до 40°С додаємо стерильні робочі розчини метою уникнення висихання середовища і, не пекетоконазолу, інтраконазолу та гентаміцину при ревертаючи, поміщають у термостат при темпераспіввідношенні концентрацій: 1:0,5:1 на 1,0мл сетурі 37,0±1,0°С для виявлення росту мікобактерій. редовища відповідно, після чого ретельно струшуДослідним шляхом встановлено, що при додаємо суміш. Далі в асептичних умовах середовище ванні до поживного середовища ВКГ кетоконазолу, розливаємо в стерильні чашки Петрі шаром 6,0інтраконазолу та гентаміцину у в співвідношенні 8,0мм. Готове середовище жовтого кольору і по1:0,5:1 на 1,0мл середовища відповідно інгібується винно відповідати рН7,2±0,2. Після застигання ріст нетуберкульозних видів мікроорганізмі в сісередовища негайно здійснюємо посів за допомомейства Actinonivcetaceae, в результаті чого вони гою шприца одноразового використання у дозі не ростуть на такому середовищі. Це дозволяє 1,5мл суспензії заздалегідь підготовленого патолопідвищити точність виділення мікроорганізмів саме гічного матеріалу, обробленого активатором роскомплексу М.tuberculosis/bovis, що в свою чергу, ту. Засіяні чашки герметизуємо скотчем з метою підвищує точність мікробіологічної діагностики уникнення висихання середовища і, не перевертуберкульозу. таючи, поміщаємо у термостат при температурі Ріст колоній M.tuberculosis/bovis на агаризова37,0±1,0°С для виявлення росту мікобактерій. ному середовищі з кетоконазолом, інтраконазолом Ріст колоній M.tuberculosis/bovis на агаризовата гентаміцином з'являється на другу-третю, іноді ному середовищі з кетоконазолом, інтраконазолом четверту, добу лише тоді, коли вони являються та гентаміцином з'являється на другу-третю, іноді рифампіцинрезистентними, у вигляді жовтуватих четверту, добу лише тоді, коли вони являються непрозорих колоній. Ріст рифампіцинчутливих рифампіцинрезистентними, у вигляді жовтуватих видів М.tuberculosis інгібується в активаторі росту непрозорих колоній. Ріст рифампіцинчутливих з додаванням рифампіцину в концентрації видів М.tuberculosis інгібується в активаторі росту 2,0мкг/мл, в результаті чого вони не ростуть на з додаванням рифампіцину в концентрації агаризваному середовищі. Облік результатів про2,0мкг/мл, в результаті чого вони не ростуть на водять шляхом мікроскопії, яку здійснюютьпід агаризваному середовищі. Облік результатів проімерсійною системою світлового мікроскопу. У певодять шляхом мікроскопії, яку здійснюють під ршу добу М.tuberculosis мають вигляд кулеподібімерсійною системою світлового мікроскопу. У пених і овоїдних клітин, що переходять з часом у ршу добу М.tuberculosis мають вигляд кулеподібдиплококові і паличкоподібні форми, котрі в свою них і овоїдних клітин, що переходять з часом у чергу поступово переходять у колбоподібні клітидиплококові і паличкоподібні форми, котрі в свою ни. За Цілем-Нільсеном бактерії в цей час не зачергу поступово переходять у колбоподібні клітибарвлюються. Однак, добре забарвлюються просни. За Цілем-Нільсеном бактерії в цей час не затими методами - розведеним фуксином або воднобарвлюються. Однак, добре забарвлюються просспиртовим розчином метиленового синього. Податими методами - розведеним фуксином або воднольшу ідентифікацію культур М.tuberculosis здійсспиртовим розчином метиленового синього. Поданюють за загальноприйнятими методами згідно льшу ідентифікацію культур М.tuberculosis здійсНаказу МОЗ України №45 від 06.02.2002 року. нюють за загальноприйнятими методами згідно Наводимо конкретні приклади здійснення споНаказу МОЗ України №45 від 06.02.2002 року. собу. Приклад 2. Приклад 1. Готуємо бактеріальну суспензію культури Після отримання патологічного матеріалу з М.tuberculosis за стандартом каламутності 1 метою деконтамінації та гомогенізації проводимо McFarland, яку вносимо в стимулятор росту у співйого передпосівну обробку 10,0% розчином сірчавідношенні 1:1, в який попередньо внесено ної кислоти Для цього в дослідний матеріал дода2,0мкг/мл рифампіцину. Суспензію інкубуємо при ємо таку ж кількість 10,0% розчину сірчаної кислотемпературі 37,0±1,0°С протягом 2 діб. Агаризовати і ретельно струшуємо з бусами протягом 10 не середовище готуємо безпосередньо перед захвилин. Потім матеріал центрифугуємо. Термін стосуванням. Для цього беремо 9,0г сухого сереконтакту харкотиння з кислотою не повинен передовища ВКГ, розмішуємо його в 100,0мл вищувати 20 хвилин від початку обробки. Після дистильованої води, кип'ятим 2-3 хвилини до повцентрифугування кислоту зливаємо, до осаду доного розплавлення агару, фільтруємо через ватнодаємо ізотонічний розчин хлориду натрію, центри марлевий фільтр, розливаємо у відповідний посуд, фугуємо і надосад зливаємо, відмивая кислоту. стерилізуємо при 120,0±1,0°С протягом 15 хвилин До осаду додаємо активатор росту мікобактеу автоклаві. Перед висівом патологічного матеріарій в співвідношенні 1:1, в який попередньо внеселу до свіжоприготованого середовища, охолоджено 2,0мкг/мл рифампіцину. Суспензію інкубуємо ного до 40°С додаємо стерильні робочі розчини при температурі 37,0±1,0°С протягом 2 діб. Агарикетоконазолу, інтраконазолу та гентаміцину при зоване середовище готуємо безпосередньо перед співвідношенні концентрацій: 1:0,5:1 на 1,0мл сезастосуванням. Для цього беремо 9,0г сухого середовища відповідно, після чого ретельно струшуредовища ВКГ, розмішуємо кого в 100,0мл дистиємо суміш. Далі в асептичних умовах середовище льованої води, кип'ятим 2-3 хвилини до повного розливаємо в стерильні чашки Петрі шаром 6,0розплавлення агару, фільтруємо через ватно8,0мм. Готове середовище жовтого кольору і помарлевий фільтр, розливаємо у відповідний посуд, винно відповідати рН7,2±0,2. Після застигання стерилізуємо при 120,0±1,0°С протягом 15 хвилин середовища негайно здійснюємо посів за допомоу автоклаві. Перед висівом патологічного матеріагою шприца одноразового використання у дозі 7 12189 8 1,5мл суспензії заздалегідь підготовленого патолопроведено 183 дослідження; непрямим методом гічного матеріалу, обробленого активатором роспри використанні попередньо отриманих чистих ту. Засіяні чашки герметизуємо скотчем з метою культур M.tuberculosis проведено 54 дослідження у уникнення висихання середовища і, не переверпорівнянні з класичними методами постановки таючи, поміщаємо у термостат при температурі тесту медикаментозної стійкості до рифампіцину 37,0±1,0°С для виявленн я росту мікобактерій. (пропорцій і абсолютних концентрацій) (237 досліРіст колоній M-tuberculosis/bovis на агаризоваджень), які показали, що ріст рифампіцинчутливих ному середовищі з кетоконазолом, інтраконазолом видів М.tuberculosis інгібується в активаторі росту та гентаміцином з'являється на другу-третю, іноді з додаванням рифампіцину в концентрації четверту, добу лише тоді, коли вони являються 2,0мкг/мл, в результаті чого вони не ростуть на рифампіцинрезистентними, у вигляді жовтуватих агаризваному середовищі. непрозорих колонії і Ріст рифампіцинчутливих виТаким чином, перевагою способу, що проподів М.tuberculosis інгібується в активаторі росту з нується, є скорочення терміну визначення стійких додаванням рифампіцину в концентрації до рифампіцину М.tuberculosis до 3-5 діб (як при 2,0мкг/мл, в результаті чого вони не ростуть на прямому, так і непрямому методі дослідження). Це агаризованому середовищі. Облік результатів має велике практичне значення в зв'язку з ростом проводять шляхом мікроскопії, яку здійснюють під захворюваності на туберкульоз та погіршенням імерсійною системою світлового мікроскопу. У пеепідеміологічної ситуації з туберкульозу в нашій ршу добу М.tuberculosis мають вигляд кулеподібдержаві. них і овоїдних клітин, що переходять з часом у Спосіб, що пропонується, може знайти широке диплококові і паличкоподібні форми, котрі в свою застосування в бактеріологічних лабораторіях чергу поступово переходять у колбоподібні клітипротитуберкульозних закладів і є розробкою найни. За Цілем-Нільсеном бактерії в цей час не забільш інформативної прискореної діагностичної барвлюються. Однак, добре забарвлюються простехнології, спрямованої на виявлення медикаментими методами - розведеним фуксином або воднотозної стійкості M.tuberculosis до хіміотерапевтичспиртовим розчином метиленового синього. ного препарату рифампіцину з використанням суЗапропонованим способом визначення стійких часних фенотипічних підходів у вивченні біології до рифампіцину М.tuberculosis прямим методом - з рифампіцинрезистеитних штамів M.tuberculosis. діагностичного матеріалу (харкотиння) хворих, Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601