Спосіб виділення аніонних фосфоліпідів

Изобретение относится к химии природных соединений, а именно к способам получения индивидуальных фосфо HV\ кІ V, липидов, может быть применено в изучении структуры и функций клеточных мембран и для приготовления липосомальных препаратов, Биологически активных эмульсий, антигенных препаратов для диагностики сифилиса. Цель изобретения - повышение чистоты и выхода продукта достигается тем,что используют адсорбент, позволяющий сочетать ионообменную и афинную хроматографию и подбирают растворители для элюирования. Для этого разделяли смеси фосфолнгшдов из мора крупного рога. Свежий мозг гомогенизируют в системе хлороформ - этанол (It!), остаток экстрагируют в той же системе (2:1). Полученный суммарный экстракт, содержащий фосфолипиды, адсорбируют на колонке с макропористым силикагелем, содержащим неомицил или L-лизин. Для элюирующих систем используют растворы формиата аммония в системе хлороформ - метанол - вода (1:2:0,4) или систему, содержащую хлороформ метанол - муравьиную кислоту в соотношении 1:2. (Л to 00 СО 1 1284981 роформ - метанол - вода (1:2:0,А) Изобретение относится к химии приДли удаления с колонки остатков муродных соединении, конкретно к спосоравьиной кислоты, затем 120 мл 0,02 М бам получения индивидуальных фосфораствора формиата аммония. Полученлипидов, и может быть использовано ная фракция содержит 0,0225 г монопри изучении структуры и функций клефосфоинозитида, выход 99% от исходточных мембран, а также для пригоного содержания, чистота I00%. После товления лилосомальных препаратов, этого через колонку пропускают 120 мл биологически активных эмульсий, ан0,1 М раствора формиата аммония. Потигенных препаратов для диагностики лученная фракция содержит 0,0034 г 10 сифилиса. кардиолипииа, выход 99% от исходного Целью изобретения является повысодержания, чистота 100%. Далее чешение чистоты и выхода продукта. рез колонку пропускают 120 мл 0,4 М Цель достигается за счет испольраствора формиата аммония. Получензуемого адсорбента, позволяющего со четать элементы афинной и ионообмеи- 15 ная фракция содержит 0,0032 г дифосной хроматографии, и подбора систем фоииозитида, выход 99% от исходного растворителей для элюирования. содержания, чистота 100%. В заключение колонку промывают 120 мл 1 М П р и м е р 1 , Разделение сме'си раствора формиата аммония. Полученфосфолипидов из моэга крупного рога20 ная фракция содержит 0,0034 г тритого скота. фосфоинозитида, выход 99% от исходноСвежий мозг (10 г) гомогенизируют го содержания, чистота 100%, в 200 мл системы хлороформ-метанол П р и м е р 2. Разделение смеси (1:1), а остаток повторно экстрагируют 200 мл системы хлороформ - ме- 25 моно-, ди- и трифосфоинозитидов, выделенных из мозга крыс. танол (2:1) . Полученный суммарный Образцы моно-, ди- и трифосфоиноэкстракт, содержащий 0,43 г фосфозитидов растворяют в 10 мл системы липидов, наносят на колонку с. макхлороформ - метанол (1:1) и полученропористым сшшкагелем МПС-1000-ВГХ, ный раствор, содержащий 0,09 г сумсодержащим неомицин, присоединенный 30 марных фосфолипидов, наносят на коизвестным способом. Объем адсорбенлонку с макропористым силикагелем та 20 мл. ШС - 1000-ВГХ, содержащим неомиДля приготовления элюирушщих цин, присоединенный известным спососистем используют растворы формиата бом. Объем адсорбента 5 мл. аммония в системе хлороформ - ме35 Для приготовления элюирующих систанол - вода (1:2:0,4). тем используют растворы формиата амПосле нанесения смеси фосфолипимония в системе хлороформ - метанол дов через колонку пропускают 60 мл вода ( 1 : 2 : 0 , 4 ) . системы хлороформ - метанол (1:1). По еде нанесения смеси фосфолипиПолученная фракция содержит 0,181 г нейтральных липидов. Затем через ко- 40 дов через колонку пропускают 15 мл системы хлороформ - метанол ( 1 : 1 ) лонку пропускают 60 мл системы хлодля удаления следов нейтральных лироформ - метанол (1:2), Полученная пидов, фосфатидилхолина и фосфатидилфракция содержит следы нейтральных этаноламина и 15 мл системы хлоролипидов, а также 0,146 г смеси, фосфатидилхолина и фосфатидилэтанолами- 45 форм - метанол - муравьиная кислота ( 1 : 2 : 0 , 0 5 ) для удаления следов фосна. После этого колонку промывают фатидной кислоты и фосфатидилсерина. 120 мл системы хлороформ - метанол Далее колонку промывали 10 мл системуравьиная кислота (1:2:0,1). Полумы хлороформ - метанол - вода ( 1 : 2 : ченная фракция содержит 0,0045 г фос50 : 0 , 4 ) для удаления с колонки остатфатидной кислоты, выход 99% от исков муравьиной кислоты, затем 30 мл ходного содержания, чистота 100%. 0,01 М раствора формиата аммония. ПоЗатем колонку промывают 120 мл сислученная фракция содержит 0,03 г мотемы хлороформ - метанол - муравьинофосфозктида, выход 99% от исходноная кислота (1:2:0,2). Полученная Фракция содержит 0,081 г фосфатидил- 55 го содержания, чистота 100%. Затем колонку промывали 30 мл 0,4 М р а с т серина, выход 99% от исходного совора формиата аммония. Полученная держания, чистота 100%. Далее кофракция содержит 0,029 г дифосфоьшолонку промывают 40 мл системы хло 1284981 зитида, выход 99% от исходного, чисные и цвиттерионные липиды (фосфатитота І 00%. Б заключение колонку продилхолин, фосфатндилэтаноламин и их мывают 30 мл 1 М фосфора формиата лизопроизводные}. После этого 30 мл аммония. Полученная фракция содержит смеси хлороформ - метанол - муравь0,03 г трифосфоинозитида, выход 99% иная кислота (J:2:0,2) вымывают фосот исходного, чистота і 00%. фатидилсерин. Затем колонку промывают 10 мл системы хлороформ - метанолП р и м е р 3. Выделение монофосвода (.1:2:0,4) для удаления с колонки фоинозитида из пекарских дрожжей. остатков муравьиной кислоты и в заСуммарный липидный хлороформно-метанольный (1:1) экстракт, содержащий 10 ключение 30 мл 0,05 М раствора формиата аммония в системе хлороформ = около 0,5 г липидов, полученный из метанол - вода (1:2:0,4). Полученная пекарских дрожжей известным спософракция содержит 0,033 г кардиолипибом, наносят на колонку с макропорисна, выход 99%, чистота 100%, тым силикагелем МПС - 1000-ВГХ, содержащим неомицин, присоединенный из- Ї5 П р и м е р 5. Выделение кардиовестным способом. Объем адсорбента липииа из сердечной мышцы крупного 5 мл. рогатого скота. После нанесения смеси фосфолипиРаствор суммарных фосфолипидов дов через колонку пропускают по 30 мл сердечной мышцы в системе хлороформ системы хлороформ - метанол (3:1) и 20 метанол (1:1), полученный как описа30 мл системы хлороформ - метанол но в примере 4, наносят на колонку (1:2). Полученные фракции содержат с макропористым силикагелем МПС0,44 г нейтральных и цвиттерионных 1000-ВГХ, содержащим L-лизин, присолипидов (фосфатидилхолин, фосфатидилединенный известным способом. Объем 25 адсорбента 5 мл. этаноламин и их лизопроизводные). После этого колонку промывают 30 мл После нанесения смеси фосфолиписистемы хлороформ - метанол - мурадов через колонку пропускают 30 мл вьиная кислота (И 2:0,2), получая системы хлороформ - метанол (1:1) 0,01 г фосфатидилсерина. Затем колони 30 мл системы хлороформ - метанол ку промывают 10 мл системы хлороформ - • 0 р ; 2 ) . Полученные фракции содержат 3 метанол - вода (1:2:0,4) для удаленейтральные и цвиттерионные фосфония с колонки остатков муравьиной липиды (фосфатидилхолин, фосфатидилкислоты и в заключение 30 мл 0,01 М этаноламин и их лкзопрокзводные), раствора формиата аммония в системе После этого системой хлороформ - мехлороформ - метанол - вода (1:2:0,4). 35 танол - муравьиная кислота (1:2:0,2) вымывают фракцию, содержащую фосфаПолученная фракция содержит 0,05 г тидилсерин. Затем колонку промывают монофосфоинозитида, выход 99% от ис10 мл системы хлороформ - метанол ходного содержания, чистота 100%. вода (1:2:0,4) для удаления с колонП р и м е р 4. Выделение кардиоки остатков муравьиной кислоты и в липина из сердечной мышцы крупного заключение 30 мл 0,02 М раствора форрогатого скота. миата аммония в системе хлороформ Сердечную мышцу (80 г) гомогениметанол - вода (1:2:0,4). Полученная зируют с 600 мл ацетона, а остаток фракция содержит 0,033 г кардиолипидважды экстрагируют 600 мл метанола. 45 на, выход 99%, чистота 100%. Метанольный экстракт, содержащий П р и м е р 6. Выделение кардио"0,4 г суммарных фосфолипидов, упалипина из сердечной мышцы крупного ривают, остаток растворяют в системе рогатого скота. хлороформ - метанол (1:1), отфильтРаствор суммарных фосфолипидов ровывают и наносят на колонку 'со сфе50 сердечной мышцы з системе хлороформроном Р-300 (оксиэтилметакри^атный метанол (1 х 1) , полученный как описагель); содержащим неомицин, присоедино в примере 4, наносят на колонку ненный известным способом. Объем адс аминосилохромом 350/80. Объем адсорбента 5 мл. сорбента 5 мл. После нанесения смеси фосфолипи55 дов через колонку пропускают 30 мл После нанесения смеси фосфолиписмеси хлороформ - метанол (1:1) и дов через колонку пропускают 30 мл 30 мл смеси хлороформ - метанол (1:2), системы хлороформ - метанол (1:1) и вымывая фракции, содержащие нейтраль30 мл системы хлороформ - метанол 28498! (1:2), Полученные фракции содержат НЄЙТраЛЬНЬїе !і ного содержания в ткани, чистота ЦВИТТСрИОННЫе ЛНПИДЬі (фосфатидилхолин, фосфатидилэтанолФ о р м у л и з о б р е т е н и я амин и их лизопроизводные). После этого 30 мл системы хлороформ - меСпособ выделения анионных фосфотанол - муравьиная кислота (1:2:0,2) липидов путем хроматографирования вымывают фосфатидилсерин. Затем коэкстрактов природного сырья на тверлонку промывают 10 мл системы хлородых носителях с использованием для форм - метанолвода (1:2:0,4) для элюирования систем на основе хлороудаления с колонки остатков муравьформа и метанола, о т л и ч а ю щ и й иной кислоты и в заключение 30 мл с я тем, что, с целью повышения вы0,1 М раствора формиата аммония в хода и чистоты продукта, экстракт, системе хлороформ - метанол - вода содержащий смесь фосфолипидов, нано(1:2:0,4). Полученная фракция содерсят на колонку с аминосилохромом или жит 0,033 г кардиолипина, выход 99% 15 макропористым силикагелем, модифициот исходного содержания, чистота рованным неомицином или L-лизином, 100%. а элюацию осуществляют системой, содержащей хлороформ - метанол - мураПредлагаемый способ позволяет вывьиную кислоту в объемном соотношеделить из сложных смесей фосфоли20 нии 1:2:(0,05-0,2), или системой, пидов за одну стадию индивидуальсодержащей 0,01-1 М раствор формианые анионные фосфолипиды с выходом та аммония в смеси растворителей 99% и чистотой 100%, тогда как по хлороформ - метанол - вода в объемизвестному способу выход анионных ном соотношении 1:2:0,4. фосфолипидов составляет 90% от исход Редактор Н. Гунько Составитель А. Переверзева Техред А.Кравчук Корректоре. Шекмар Заказ 7557/26 Тираж 347 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская н а б . , д . 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г . Ужгород, ул. Проектная, 4