Спосіб капацитації сперми

Спосіб капацитації сперми, що включає розморожування сперми в середовищі Тіроде, відмивання від розріджувача, кріопротекторів та деструктивних елементів центрифугуванням в середовищі TALP, флотацію з 2-разовим центрифугуванням у тому ж середовищі протягом 10 хвилин при 1000 об/хв. після витримки у термостаті 3 12861 4 них в аналогічному режимі, а після видалення сулогічному режимі і після видалення супернатантів пернатантів піддають флотації в термостаті з напіддають флотації в термостаті і наступному ступним центрифугуванням об'єднаних в одній центрифугуванню об'єднаних в одній пробірці верпробірці верхніх шарів рідини з живими рухомими хніх шарів рідини з живими рухомими сперміями, сперміями, при цьому одержаний центрифугат з при цьому одержаний центрифугат з додаванням додаванням середовища TALP витримують в терсередовища TALP витримують в термостаті для мостаті для розправлення сперміїв протягом 10 розправлення сперміїв протягом 10 хвилин, хвилин, центрифугують і визначають концентрацію центрифугують в стандартонму режимі і визначасперміїв підрахунком в камері Горяєва. ють концентрацію сперми підрахунком в камері Збільшення об'єму середовища для відмиванГоряєва. ня сперми від еякуляту, розбавника, кріопротектоЗаявлений спосіб здійснюють наступним чирів та деструктивних елементів забезпечує більш ном: якісне очищення сперматозоїдів від мертвих клітин 1. До розмороженої сперми баранів (2 гранута їх уламків. ли) загальним об'ємом 0,440мл додавали 5мл Розділення одержаного центрифугату на 4 TALP і центрифугували 10 хвилин при 1000об/хв флотаційні об'єми здійснює більш повне очищення для відмивання сперміїв від розбавнику еякуляту, сперми від слаборухливих та нежиттєздатних спекріопротекторів та деструктиваних елементів. рміїв. Розправлення сперміїв забезпечення вне2. До центрифугату (1/3 об'єму V=2мл) додасенням проб у термостат на 10 хвилин після ють 4мл TALP і розділяють весь об'єм на 4 флотацентрифугування Визначення концентрації сперміційні об'єми - (V1=V2=V3=V4=1,5мл) і центрифугуїв в камері Горяєва дозволяє більш точно визнають в другий раз в аналогічному режимі. чити їх кількість та якість. 3. Супернатант видаляють, до центрифугату Отже, використанням зазначеного способу ка(1/3 об'єму V=0,5мл) додають 1мл середовища пацитації, модифікованого за рахунок удосконадля капацитації TALP і витримують у термостаті лення методичних прийомів, дозволяє отримати при 38,5 С 1 годину для флотації активних сперміфракцію сперми для in vitro запліднення, яка за їв під час якої відбувається їх капацитація. показниками рухливості й активності не поступа4. З кожної пробірки обережно відбирають ється нативній і містить до 90% живих сперміїв. верхній шар рідини (2/3 об'єму, тобто 1мл середоВідомості, що розкривають суть корисної мовища) з живими рухливими сперміями. делі. 5. Всі проби змішують в одній пробірці При проведенні патентно-інформаційного по(Vзаг=4мл) і центрифугують 10 хвилин при шуку заявником і авторами знайдено технічне рі1000об/хв. шення [Schneider C.S., Ellington J.E., Wright R.W.Jr. 6. До центрифугату 1мл додають 1мл TALP і Relationship between bull field fertility and in vitro витримують у термостаті при t=38,5 С з 5% СO2 10 embryo production using sperm preparation in vitro хвилин для "розправлення" сперміїв. embryo production using sperm preparation methods 7. Після цього в пробірку вносять ще 4мл TALP with and without somatic cell co-culture (Vзаг=6мл) і центрифугують 10 хвилин при //Theriogenology. -1999.--V51. -N6. -P. 1085-1098], 1000об/хв. Супернатант видаляють. До центрифущо містить найбільшу кількість суттєвих ознак, гату, який є суспензія капацитованої сперми (1/3 спільних із заявленим рішенням розморожування об'єму V=2мл) додають 50мл середовища для сперми в середовищі Тіроде, відмивання від роззапліднення ооцитів (Vзаг=50мл) і визначають бавника, кріопротекторів та деструктивних елемеконцентрацію сперми у камері Горяєва. нтів центрифугуванням в середовищі TALP, флоПриклади конкретного використання способу. тацією дворазовим центрифугуванням в тому ж Для перевірки технології та підтвердження песередовищі протягом 10хв при 1000об/хв після реваги заявленого способу перед відомими нами витримки в термостаті протягом 1 години при темдосліджено вплив різних способів капацитації спепературі 38,5 С та визначення концентрації сперрми з визначенням їх ефективності. міїв. Дослід проведено в умовах лабораторії реОднак, наявність зазначених, спільних з найпродуктивної біотехнології Інституту біології тваближчим аналогом суттєвих ознак недостатньо рин УААН на розмороженій спермі баранів породи для одержання технічного результату, який забезсаффолк спермосховища Гряда. печує заявлений спосіб. Технічних рішень, які б за В якості контролю (аналог) використовували сукупністю ознак повністю співпадали з заявленим спосіб капацитації сперми за [Parrish I.J.et al 1986], технінним рішенням - не виявлено. Це дозволяє який полягає у послідовних процедурах: зробити висновок про відповідність заявленого 1. На розморожену сперму (2 гранули), змішатехнічного рішення критерію корисної моделі - "нону в одному об'ємі, зверху обережно нашаровувавизна". ли 1мл розчину для капацитації TALP (розчин ТіВ патентній і науково-технічній інформації не роде + 0,11мкг/мл Na-піруват + 0,06г/мл BSA (5-та знайдено технічних рішень, в яких були б описані фракція) + Са-лактату + 47мкг/мл гепарину). відомості про ознаки, що відрізняють заявлений 2. Проводили флотацію і капацитацію сперми спосіб від найближчого аналогу і забезпечують у термостаті протягом 1 години при t=38,5 C з 5% досягнення технічного результату: відмивання СО2 у повітрі. розмороженої сперми перед флотацією здійсню3. Верхній шар з живими сперміями (0,7мл, ють у великому (до 5мл) об'ємі середовища TALP, тобто 1/2 об'єму) відбирали мікродозатором, дорозділяють одержаний центрифугат на 4 флотадавали 4мл середовища TALP та центрифугували ційних об'ємі, центрифугують кожний з них в ана10 хвилин при 1000об/xв. Видаляли супернатант, 5 12861 6 додавали 5мл TALP і знову центрифугували при ментів, збільшенні об'єму флотаційного середо1000об/хв протягом 10 хвилин. вища у 4 рази за рахунок подрібнення проб: 4. Видаляли супернатант. До центрифугату, 1. До розмороженої сперми баранів (2 грануякий є суспензія капацитованої сперми (1/3 об'єму ли) загальним об'ємом 0,440мл додавали 5мл V=2мл) додають 50мл середовища для заплідненTALP і центрифугували 10 хвилин при 1000об/хв ня ооцитів (Vзаг=50мл) і визначають концентрацію для відмивання сперміїв від розбавнику еякуляту, сперми у камері Горяєва. кріопротекторів та деструктиваних елементів. Як найближчий аналог у 1-ій дослідній групі 2. До центрифугату (1/3 об'му V=2мл) додають використовували спосіб капацитації сперми за 4мл TALP і розділяють весь об'єм на 4 флотаційні [Schneider C.S., Ellington J.E., Wright R.W.Jr. об'єми (V1=V2=V3=V4=1,5мл) і центрифугують в Relationship between bull field fertility and in vitro другий раз в аналогічному режимі. embryo production using sperm preparation in vitro 3. Супернатант видаляють, до центрифугату embryo production using sperm preparation methods (1/3 об'му V=0,5мл) додають 1мл середовища для with and without somatic cell co-culture капацитації TALP і витримують у термостаті при //Theriogenology. -1999. -V51. -N6. -P. 1085-1098], 38,5 С 1 годину для флотації активних сперміїв під згідно p яким сперму обробляли по наступній схечас якої відбувається їх капацитація. мі: 4. З кожної пробірки обережно відбирають 1. Сперму (2 гранули) розморожували у тепверхній шар рідини (2/3 об'єму, тобто 1мл середолому середовищі Тіроде в одній центрифужній вища) з живими рухливими сперміями. пробірці, додавали 5мл середовища для капаци5. Всі проби змішують в одній пробірці тації TALP та центрифугували 10 хвилин при (Vзаг=4мл) і центрифугують 10 хвилин при 1000об/хв для відокремлення еякуляту від розбав1000об/хв. ника, кріопротекторів та деструктивних елементів. 6. До центрифугату 1мл додають 1мл TALP і 2. До центрифугату (2мл, тобто 1/3 об'єму) довитримують у термостаті при t=38,5 C з 5% СО2 10 давали 4мл свіжого TALP і проводили друге ценрхвилин для "розправлення" сперміїв. тифугування в аналогічному режимі. 7. Після цього в пробірку вносять ще 4мл TALP 3. Супернатант видаляли, а до центрифугату (Vзаг=6мл) і центрифугують 10 хвилин при (2мл, тобто 1/3 об'єму) додавали 1мл середовища 1000об/хв. Супернатант видаляють. До центрифудля капацитації TALP і витримували у термостаті 1 гату, який є суспензія капацитованої сперми (1/3 годину при t=38,5 C з 5% СО2 у повітрі для флотаоб'єму V=2мл) додають 50мл середовища для ції. запліднення ооцитів (Vзаг=50мл) і визначають 4. З пробірки обережно відбирали верхній шар концентрацію сперми підрахунком у камері Горяєрідини (2мл, тобто 2/3 об'єму) з живими рухливими ва. сперміями і центрифугували 10 хвилин при Результатами досліджень встановлено, що 1000об/хв. попереднє центрифугування, фракціонування за5. До центрифугату (0,7мл, тобто 1/3 об'єму) гального об'єму розмороженої сперми на 4 флотадодавали 1мл TALP і витримували 10 хвилин у ційні об'єми у 2-їй дослідній групі дозволяє здійстермостаті при t=38,5 C з 5% СO2 у повітрі для нити 2-разове центрифугування флотаційних проб "розправлення" сперміїв. та збільшити об'єм середовища для флотації і 6. Додавали 4мл TALP (Vзаг=6мл) і центрифукапацитації сперми. За рахунок цих методичних гували. Супернатант видаляли. До центрифугату, прийомів спермії скоріше і легше піднімаються у який є суспензія капацитованої сперми (1/3 об'єму верхні шари середовища, що забезпечує високий V=2мл) додають 50мл середовища для заплідненступінь очистки сперми і веде до-збільшення кільня ооцитів (Vзаг=50мл) і визначають концентрацію кості рухливих сперміїв (табл. 1). сперми у камері Горяєва. Порівняння результатів досліджень способів У 2-й дослідній групі (новий спосіб) сперму обкапацитації розмороженої сперми заявленого моробляли згідно модифікованої нами схеми капацифифікованого способу з традиційними способами тації, що полягала у 2-кратному попередньому свідчить про те, що найбільш ефективним виявиввідмиванні розмороженої сперми від розбавника ся заявлений спосіб капацитації сперми. еякуляту, кріопротекторів та деструктивних елеТаблиця 1 Результати капацитації розмороженої сперми баранів трьома способами, n=3. Групи Контрольна (аналог) Дослідна 1 (найближчий аналог) Дослідна 2 (новий спосіб) Дослід 1 3,175 Концентрація сперміїв в 1 мл (х 106) Дослід 2 Дослід 3 3,350 3,125 М m, n=3 3,220 0,077 4,067 3,750 4,300 4,039 0,193 4,575 4,562 4,575 4,571 0,006 Попереднє дворазове центрифугування розмороженої сперми з наступним розподілом загального об'єму на 4 флотаційних об'єми (2-га дос лідна група) дозволяє відокремити мертву сперму та клітинні уламки на початку обробки сперми до здійснення процедури флотації і проводити капа 7 12861 8 6 цитацію вже очищеної життєздатної сперми. Дво3,220 0,077х10 у контрольній до 4,571 0,006х106 разове центрифугування флотованої сперми піду 2-й дослідній (новий спосіб). вищує якість її очистки. Ці методичні прийоми дозволяють підвищити кількість живих сперміїв з Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601