Біопрепарат для рослинництва

Изобретение относится к области биотехнологии сельскохозяйственной микробиологии, а именно к получению биопрепаратов, повышающих продуктивность сельскохозяйственных растений. Известны биопрепараты для растений, в которых бактерии (биологический агент, БА) иммобилизуются на твердом носителе (торф) пенопласт или заключаются в микрокапсулы, состоящие из органического или синтетического материала. Для изготовления биопрепаратов для растений на твердом носителе используется неэкологический энергоемкий способ стерилизации-облучения носителя g-лучами. Добыча такого носителя как торф приводит к истощению его запасов в природе и нарушению экологического равновесия в экосистемах. Использование пенопласта в качестве носителя БА загрязняет окружающую среду. Использование альгината натрия для микро-капсуляции БА экономически нерационально, так как этот продукт не производится в Украине и является дорогостоящими для закупки за рубежом. В приведенных для примера биопрепаратах действующим началом является только БА. Наиболее близким к предлагаемому изобретению является биопрепарат, в котором используют живые микробные культуры Азоспирилл, капсулированные в альгинатные шарики. Для изготовления препарата используют облученный на установке 60Со дозой 2,5 Мрад альгинат натрия (2% по объему) и живую жидкую культуру БА. Альгинатные шарики формируют, вводя в смесь наполнителя с культурой 0.1М раствор хлористого кальция. После этого шарики (=2 мм), содержащие БА, промываются стерильной водой и инокулируются в питательный бульон на 1-2 сут. подращивания БА и, соответственно, для повышения его титра в шариках. После этого шарики промываются и лиофилизируются при -70° С до полного высушивания. Сухие капсулы помещаются в стерильную посуду, содержащую силикагель. Обработка зерна шариками предусматривает использование их в количестве 4-5 штук/зерно. Недостатком этого препарата является то, что в процессе его изготовления используется два энергоемких процесса: облучение носителя и лиофилизация микробных шариков. Процесс изготовления препарата трудоемкий за счет большого количества операций. Препарат вносится с зерном в большом количестве (1:1). Внесение в почву Са2+, содержащихся в наполнителе, не всегда приводит к улучшению ее свойств. Действующим началом биопрепарата является только один его компонент БА. Кроме того, Азоспириллы недостаточно конкурентоспособны в естественной среде обитания. В литературе неизвестно совместное использование экзополисахаридов микробного происхождения с клетками бактерии для повышения продуктивности сельскохозяйственных растений, В основу изобретения поставлена задача создания биопрепарата для растениеводства, в котором высокая эффективность обеспечивается применением живых микробных культур в сочетании с экзосахаридом микробного происхождения. Поставленная задача решается тем, что в биопрепарат для растениеводства, включающий живые микробные культуры и наполнитель, согласно изобретению в качестве микробной культуры используется штамм Клебсиелла окситока ВН-13, а в качестве наполнителя экзополисахарид, продуцируемый Bacillus mucllaginosis при следующем соотношении компонентов, об.%: Заявляемый штамм Klebsiella oxytoca ВН-13 выделен из корней риса, собранного на чеках в окрестностях г. Ханой (СРВ). Штамм хранится в коллекции Института молекулярной биологии и генетики АН Украины под №26. Штамм идентифицирован по определителю Берги (т.1, с.464). При установлении отличительных признаков заявляемого штамма использовались стандартные микробиологические методы. Морфолого-культуральные признаки. Культура неспороносная, грамотрицательная, факультативный аэроб, имеет капсулу. Размеры клеток 1,09 × 0,1 мкм. Растет на средах следующего состава, г/л: Оптимальная температура роста +37°С, слабо растет при +5°С и 42°С. В жидких средах при оптимальной температуре роста дает титр 1,0-45×109 кл/мл. На агаризованной среде образует матовые колонии размером 2-3мм с ровными краями, выпуклые, неслизистые. Физиолого-биохимические свойства. Штамм ферментирует глюкозу, лактозу без образования газа, сбраживает глюкозу, галактозу, фруктозу, маннозу, мальтозу, сахарозу, раффинозу, дульцит, сорбит, не сбраживает сорбозу, мелицитозу. Восстанавливает нитраты в нитриты, не разжижает желатин. Образует индол. Усваивает сукцинат, тартрат, цитрат. Оксидазоотрицательный. Обладает лизиндекарбоксилазой. Усваивает азот атмосферы в анаэробных условиях. Азотфиксирующая активность 1,53 мМС2Н4/мг белка/ч. Выделяет ауксины. Обладает фунгицидной активностью. Признаки штамма устойчивы. Штамм непатогенен и нетоксичен. Хранится на мясопептонном агаре. Пересевается раз в год. Получение экзополисахарида муцилана. Бактерии Вас.mucllaginosis в качестве инокулята используют 4-суточную культуру, выращенную при 30° С на плотной питательной среде А-27 следующего состава, %: сахароза 2,0; Na2РO4 - 0,1; MgSO4 - 0,05; стекло 0,1; мел - 0,01, FeCl3 - 10 капель 10% раствора, агар-агар - 30. Затем клетки смывают жидкой питательной средой А-27 и засевают в колбы емкостью 500 мл, содержащие 200 мл питательной среды аналогичного состава. Доза посевного материала составляет 0,200,25 объемных процентов. Инкубируют при 25°С на качалках в течение 36 ч. Затем клетки отделяют путем 40минутного центрифугирования при 17000. Полисахарид осаждают 3-кратным объемом этилового спирта и высушивают при температуре 40-45° С. Получение препарата. Экзополисахарид муцилан смешивают с биомассой в соотношении 58,4:41,06 и высушивают в асептических условиях при температуре 36°С. Сухой препарат хранится в полиэтиленовых мешках. Динамика содержания живых бактерий в препарате представлена в табл.1. Положительный эффект различных концентраций биопрепарата тестировался на проростках ржи. Для этого семена стерилизовали с поверхности и обрабатывали растворами биопрепарата различных концентраций. Результаты определения наиболее эффективной действующей концентрации представлены в табл.2. Заявляемый биопрепарат используется для обработки семян с/х растений перед посевом и рассады перед посадкой. Для этого готовится- 0,25% раствор препарата на водопроводной воде для обработки семян или 0,1% раствор для обработки рассады. Эффективность рабочих концентраций биопрепарата проверена в вегетационных и полевых опытах на территории Киевской и Одесской областей. Испытания биопрепарата проводили по общепринятым правилам постановки и учета результатов вегетационных и полевых опытов. Результаты испытаний представлены в таблицах 3-5. Как видно из представленных данных биопрепарат дает достоверную прибавку к урожаю гречихи, кукурузы, томатов. При этом полученная продукция - экологически чистая, выращенная без использования протравителей семян и химических средств защиты растений, при экономии азотных удобрений. Выживаемость К. oxytoca BH-13 на корнях ячменя тестировали в микроделяночном полевом опыте по разработанной нами методике. Для этого бактерия маркируется признаком биолюминесценции для обнаружения ее в природной экосистеме по способности излучать видимый свет. Исследования по способности K.oxytoca BH-13 их колонизовать корни ячменя проводились с мая по сентябрь 1992 года на протяжении вегетационного периода растения. Как показали результаты, плотность колонизации бактерий корней составила 106 кл/мг в мае и снизилась до 103 кл/мг в сентябре. Количество колонизованных растений снижалось на протяжении исследуемого периода с 100% до 15%. Таким образом, приведенные выше данные о заявляемом биопрепарате свидетельствуют о следующих его достоинствах: 1) дешевое средство для повышения продуктивности сельскохозяйственных растений без использования протравителей семян и других химсредств защиты растений и азотных удобрений; 2) органичное сочетание живой микробной культуры, поставляющей растению биологический азот, фитогормоны, антимикробные вещества и экзополисахарида муцилана, обладающего биологической активностью, которая проявляется в стимуляции роста растения; 3)технологичность изготовления как отдельных компонентов биопрепарата, так и его самого; 4) экологическая чистота производства препарата и сельскохозяйственной продукции, полученной при его использовании.