Спосіб консервування гепатоцитів

Изобретение относится к криобиологии. Цель изобретения - повышение морфофункциональкой сохранности г е патоцитов. Гепатоциты суспендируют в с р е д е , содержащей с а х а р о з у , хлористый калий, КН 2 Р0 4 s NaiHPOJf, д и т и о трентол, ЭДТА, хлористый магний и альбумин. Клетки печени инкубируют в глицерине, переносят в контейнеры и замораживают путем погружения в порошок цинка. 1 т а б л . t 1412039 Изобретение относится к биологии , и медицине и может быть испольэова- * но для консервирования клеток, выделенных из тканей. Цель изобретения - повышение мор~ фофункциональной сохранности г е п а т о цитов. П р и м е р . Гепатоциты получают ИЭ ПечеНИ беЛЫХ беСПОрОДНЫХ КрЫС Macсой 200-250 г (цитология 1975 Т 17 № 5 с . 545-551). Количество полученных клеток подсчитывают в камере Гор я е в а . На 1 мл изолированных клеток печени приходится 1,0-1,2 мг белка. Рабочая концентрация клеток при з а мораживании 1 млн в 1 мл среды с у с пендирования. . ' .: Гепатоциты суспендируют в среде, содержащей 250 м сахарозы, 5 м М М 20 КС1, 0,4 м КН 2 Р0 4 , 0,4 м ЫагНРОф, М М 2 м дитиотрентола, 2 м ЭДТА, 0,8 м М М М МйС1 г , 1 альбумина, рН 7 , 4 . % Клетки печени инкубируют в течение 10 мин в растворе 3%-ного глицерина, 25 затем переносят в контейнеры из алюминиевой фольги и замораживают си скоростью 1.6000-16500в/мин путем погружения в порошок цинка, предварительно охлажденный жо -196 С. . 30 Отогревают на водяной бане при +37°С. зависимо от скорости) и при замора- . живании со скоростью 1500-2000 /мин • в присутствии криопротектора ( н е з а висимо от его вида), почти все клетки были окрашены в синий цвет, имели р а з мытые контуры с недостаточно контурированными ядрами. Большинство клеток имели разрьш клеточной мембраны. Скорость эндогенного дыхания (V ? H f t ) определяют полярографически (H.A.Krebs et a l . I s o l a t e d l i n e a r c e l l s in experimental m a t e r i a l . I n . ' R e g u l a t i o n of Hepatic Metabolism. Acad. P r e s s , 1974, P. 724-750). Инкубационная смесь объемом 1,0 мп содержит среду суспендирования следующего состава клетки: 1 мг белка и 200 мкм 2,4-динитрофенол (ДНФ). В нативных гепатоцитах под действием Д Ф Н у энд увеличивается в 1,8-1,9 р а з а . При замораживании гепатоцитов со скоростью 16000-16500"/мин без криопротектора добавление Д Ф к отогреН тым клеткам практически не стимулирует их дыхание (отношение ^Днт : ^нд '" = 1,1±0,1), в то время, как в замороженных с глицерином отношение = 1 V A : V ^ A HJ >53±0,05. Б случае з а мораживания с Д С это отношение сосМО тавляет 1,2±0,1. Сопряженность дыхания и окислительного фосфорилирования а замороженных без криопротектора и • отогретых гепатоцитах значительно снижается по сравнению с нативными (см. таблицу). При этом по сравнению с прототипом скорость эндогенного дыхания сохраняется на более высоком уровне (выше на 27%), а отношение ЧИНФ '^ви^ в прототипе на 28% ниже, чем в предлагаемом. Использование более медленных,-скоростей замораживания (1500-2000 /мин) неэффективно (см. таблицу). В этом случае ни один из используемых криопротекторов не оказывает защитного эффекта на сохранение основных биоэнергетических показателей гепатоцитов. Уровень эндогенного дыхания при замораживании |со скоростью 1500-2000 /мин снижает-' ся на 47%. ' '. ' , • Отношение VAHcp :V3HA значительно снижается и равно 1,0±0,1 (в конт- . • • роле 1,8±0,15). Митохондрии таких гепатоцитов разобщены. Для сравнения гепатоциты замораживают до -196°С со скоростью: 1. 16000-1б500°/мин без криопро- 35 тектора и с криопротектором 3%-ного ДМСО. 2. 1500-2000°7мин (погружение в азот) с 3%-ным глицерином. 40 3. 8000-10000°/мин погружение^,контейнеров в предварительно охлажденный до -196°С порошок окиси алюминия ( А 1 г 0 3 ) в присутствии 3%-ного глицерина и без него. 4. Многоэтапно в среде с 10%-ным 45 Д С и в среде с 3%-ным глицерином. МО Морфологический анализ суспензии гепатоцитов проводят методом окрашивания 0,2%-ным раствором трипанового синего ( P . O . S e g l e n , I n h i b i t o r of 50 p r o t e i n d e g r a d a t i o n formed during i n c u b a t i o n of i s o l a t e d r a t h e p a t o c y t e s in a c e l l c u l t u r e medium, - Exp. C e l l . Res, 1977, v . 174, p . 4 6 9 - 4 7 4 ) . Анализ показал, что после замора- 55 живания предлагаемым способом 90-95% Наиболее высокий уровень эндогенгептацитов имели хорошо очерченную ного дыхания (4,4*0,05) гепатоцитов, ! неокрашенную протоплазму и ядро. При в митохондриях которых процессы окис; замораживании без криопротектора ( н е - ления сопряжены с фосфорилированием, ' 4 2039 гепатоцитов при многоэтапном замораотмечается при замораживании со с к о живании в среде с Д С (прототип) МО ростью 16000-16500 /мин в присутствии не определяется, так как эта прог3%-ного глицерина. _ рамма и вид криопротектора менее эфПри выборе оптимальных концентрафективны и по данным измерения э н ций глицерина при сверхбыстрых с к о догенного дыхания отношения Улмф^^д. ростях замораживания или дифференциПри обосновании выбора концентраации влияния сверхбыстрых скоростей ции криопротектора используют глицеиспользуют более чувствительный метод - метод определения изменения Ю рин в концентрациях от 1 до 4Z. После мембранного потенциала гепатоцитов. отогрева гепатоцитов, замороженных со (Морозова Г.И. Добрецов Г.Е. и д р . скоростью 16000-16500°/мин, максимум Флуоресценция Д М в живой клетке. С интенсивности свечения флуоресцентЦитология, 1981, т . XXIII, К 8, > ного красителя ДСМ отмечается при с. 916-923). 15 использовании глицерина в концентраОпределение флуоресцентных характеции 1-3%. Замораживание в среде без ристик и интенсивности свечения краглицерина сопровождается значительсителя позволяет одновременно судить ным снижением потенциала. о структурной и функциональной дезорИспользование 3%-ного Д С (криоМО ганизации клетки и ее компонентов, 20 протектор, использованный в прототитак как флуоресценция и ее интенсивпе) неэффективно.'' исследованный параность в различных клеточных компоненметр снижен по сравнению с замораживатах различна. Интенсивность свечения нием со скоростью 16000-16500°/мин, красителя регистрируют на пюминисцент-^ в среде с Зл-ным глицерином - в ном микроскопе Л М М возбуждая ее Ю А , 25 1,6 р а з а . и регистрируя с помощью фотометриТаким образом, использование ческой приставки фМЭЛ-1. 1-3%-ного глицерина при скорости замоИнтенсивность флуоресценции крараживания 16000-16500°/мин позволяет сителя регистрируют на спектрофлуосохранить мембранный потенциал на риметре MPF-2A " H i t a c h i " . 30 уровне контроля и считать эти концентДля обоснования скорости заморарации, вид криопротектора и скорость живания гепатоциты замораживают с замораживания наиболее оптимальными, различными скоростями в среде без так как использование глицерина в конкриопротектора и в присутствии 3%-ноцентрации 4-5% и больше не оказываго глицерина. ет уже при этой скорости заморажива35 При замораживании гептоцитов с ния дополнительно криозащитного эфразличными скоростями в среде без фекта (см. таблицу). криопротектора (1500-2000°/мин; 8000Учитывая, что более высокие кон10000°/мин; 16000-16500*/мин) ни центрации глицерина могут оказывать один из использованных режимов не токсическое действие на структуры обеспечивает достаточной для нормаль- 40 клетки и тре буют отмыва ния 1—3%-ная • ного функционирования клеток величиконцентрация глицерина при данных ны мембранного потенциала. Этот параскоростях замораживания является опметр снижает в ряду 1600-16500> 8000тимальной. 10000> 1500-2000°/мин, т . е . наиболее Получение более высоких скоростей эффективна скорость 16000-16500°/мин. 45 замораживания в настоящее время пракПри замораживании клеток печени тически не осуществимо. в среде с 3%-ным глицерином по р а з Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я личным программам получены следующие Способ консервирования гепатоцитов данные: использование 3%-ного глицепутем замораживания в присутствии 50 рина эффективно лишь при скорости глицерина, о т л и ч а ю щ и й с я замораживания 16000-16500°/мин. В тем, ч т о , с цепью повышения морфов э том случае замораживание гептацитов функциональной сохранности гепатоципо многоэтапной программе (прототип) т о в , замораживание осуществляют со в среде с 32-ным глицерином неэффекскоростью 16000-16500°/мин путем погтивно. Интенсивность свечения краси- 55 ружения в порошок цинка, предваритетеля в замороженно-отогретых гепатольно охлажденный до температуры жидцитах в 3 раза ниже, чем в предлагакого а з о т а , а глицерин берут в к о я емом способе. Мембранный потенциал іцентрации 1-3%. 5 1412039 6 Дыхание и окислительное фосформлууро^анке в гепатоцитах, .замороженных с различной скоростью (показатели дыхания, мМ, О. мин" мг" белка) Скорости замораживания • Условия эксперимента 1500-2000°/мин V Контроль (незамороженные) 4,70+ 1,8110,15 4 , 1 * 0,2 Замораживание с глицерином 16000-16500в/мин многоэтапно (прототип) V *V 1;6+0,1 " " Гу Ту"" ~ 4,7+0,2 ' 1,8*0,15 0,1 4,4+0,05 1,53+0,05 р