Спосіб тестування загального рівня протромбіну та виявлення його функціонально неактивних форм у плазмі крові

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при диагностике нарушений в системе гемостаза, характеризующи хся колебаниями уровня протромбина и появлением в крови его функционально неактивных форм и фрагментов. Протромбин, являющий ся основным прокоагулянтом плазмы крови, представляет собой субстрат для образования тромбина в результате сложного каскада реакций, в кото рых участвуют фа кторы систе мы свертывания крови. Концентрация протромбина в крови подве ржена значительным колебаниям в зависимости от пола, возраста и состояния здоровья. Существенно изменяется уровень протромбина при заболеваниях различной этиологии (К-зависимых гиповитаминозах, при инфе кционных болезнях, заболеваниях печени), при приеме анти коагулянтов непрямого действия, проведении экстракорпоральных мето дов лечения (гемосорбция, плазмаферез) (в кн.: «Клиническая гемато логия», 1985, Буха рест, 1221 с.). Появление в кровото ке таких функционально неактивных форм протромбина, как декарбоксилированный протромбин и фрагменты протромбина (фрагмент 1+2 и протромбин 1) свидетельствует о наруше нии системы свертывания крови (Sakuragawa N., Takahashi K., Hoshiama M. Significance of a prothrombin assay method using Echis carinatus venom for diagnostic information in disseminated intravascular coagulation syndrome Thromb.Res, 1975, v.8 p.643-653). В зарубежной клинической диагностике используются иммунологические тесты, с помощью которых определяют фрагмент 1+2 и рассматривают его как маркер синдрома внутрисосудистого микро свертывания крови (ВСК). В о течественной клинической практике в настоящее время не суще ствует способов вы явления функционально неактивного протромбина в плазме крови. Способом – прототипом является тест «протромбиновое время», наше дший широкое применение в клинической практике. В этом тесте определяют время свертывания плазмы тромбопластином в присутствии ионов. ПИ 1 2 3 ЭИ Наличие претромбина 1 100 100 110 100 104 100 Нет Нет нет Пример 2. Время свертывания плазмы при той же постановке экамулинового те ста – 140 сек. Экамулиновый индекс – 86%. Время свертывания исследуемой плазмы в тесте «протромбиновое время» – 21 сек. Протромбиновый индекс исследуемой плазмы – 84%. Вывод: совпадение протромбинового и экамулинового идексов свидете льствует о том, что в исследуемой плазме не содержится фукционально неактивный протромбин, уро вень протромбина слегка снижен. Пример 3. Время свертывания плазмы при той же постановке экамулинового теста укорочено по сравнению с контрольным – 103 сек. Экамулиновый индекс исследуемой плазмы – 116%. Протромбиновое время сверты вания данной плазмы – 30 сек, протромбиновый индекс – 57%. Сокраще ние экамулинового времени свертывания может свидетельствовать как о повышенном уровне протромбина, так и о сочетании повышенного уровня протромбина с присутствием претромбина 1 или декарбоксилированного протромбина. Для выяснения этого вопроса сравнивают протромбиновый и экамулиновый индексы, используя чертеж. Для этого проводят перпендикуляр к оси ординат в точке, соответствующей протромбинованому индексу плазмы 57%, до пересечения с кривой 1. От то чки пересечения с кривой 1 опускают перпендикуляр к оси абсцисс и находят концентрацию функционально активного протромбина в данной плазме (64%). Затем от точки на оси ординат, соответствующей 116% ЭИ, проводят перпендикуляр и нахо дят точку его пересечения с продолжением Ca++и по его удлинению или укорочению судят об уменьше нии или увеличении уровня протромбина соответственно. С помощью это го теста можно определять уровень протромбина, однако, он не чувствителен к присутствию функционально неактивных фрагментов или декарбоксилированного протромбина. Результаты этого теста требуют тщате льной стандартизации, что связано с качеством используемых препаратов тромбопласти на (в кн.: «Нарушения реакций образования тромбина» //Под ред. Р.У.Колмена.-М.:Ме дицина, 1988 240 с.). Задачей насто яще го изобретения является разработка способа тестирования обще го уровня протромбина и выявления его функционально неакти вных форм, являющихся показателями ВСК-синдрома и/или витамин-К-зависимых гиповита минозов, а также повышение точности диагностики этих нарушений. Для решения поставленной задачи используют фе рмент-актива тор протромбина Экамулин. Экамулин, выделенный нами из яда эфы много чешуйча той, активирует, подобно Экарину, фе рменту из яда змеи эфы песчаной, протромбин в a-тромбин через стадию мезотромбина в реакции, не требующей присутствия ионов Ca++, фосфо липидов или других кофа кторов. По такому же механизму оба эти фермента активируют претромбин 1. Фермент обладает стабильностью, высокой специфи чностью к претромбину, при этом, не взаимодействуя с другими компонентами гемокоагуляции (Угарова Т.П., Платонова Т.Н., Соловьев Д.А., Актива тор протромбина из яда эфы песчаной (Echis multisguamatus) // ДАН УССР, серия Б, 1989, №6, с.7579). (13) Нет Нет нет 14580 86 61 56 (11) 84 56 51 C2 Наличие претромбина 1 UA 1 2 3 ЭИ (19) ПИ Ме дицинский результат достигается при разработке способа тестирования общего уровня протромбина и выявления его функционально неактивных форм в плазме крови, включающе го смешивание реагентаактиватора, раствора хлорида кальция и исследуемой плазмы, определение времени свертывания плазмы, и вычисление индекса плазмы по отноше нию времени свертывания донорской к времени свертывания исследуемой плазмы, отличающегося тем, что параллельно с протромбиновым индексом определяют экамулиновый индекс по времени свертывания плазмы новым ферментом-активато ром протромбина Экамулином, сравнивают протромбиновый и экамулиновый индексы плазмы и при их совпадении судят об отсутствии функционально неактивных форм протромбина, а при экамулиновом индексе выше протромбинового количественно определяют уровень функционально неактивных форм протромбина, являющихся показателем ВСК-синдрома и/или витамин-К-зависимых гиповитаминозов. Так при экамулиновом и протромбиновом индексах, со ответствующих 100%, делают заключение о том, что уровень протромбина нормальный и функционально неактивных форм протромбина в плазме больного нет; при повышенном экамулиновом индексе и нормальном или сниженном протромбиновом индексе делают заключение о том, что уровень протромбина снижен, в плазме присутствуют функционально неакти вные формы протромбина, концентрацию которых можно определить по калибровочным кривым (см. чертеж, кривые 4, 5. 6). Чем выше разница между экамулиновым и протромбиновым индексами, тем больше уровень функционально неактивных форм протромбина содержится в исследуемой плазме. Для правильной интерпретации полученных в экамулиновом тесте данных используют соответствующие модельные системы: для моделирования плазм с разным уровнем содержания протромбина донорскую плазму разбавляют 3% раствором фибриногена. Для моделирования плазм, содержащих претромбин 1, в плазмы с ранее смоделированными разными уровнями протромбина вносят претромбин 1. Для количественной характеристики активности Экамулина предлагается использовать экариновые единицы: одна единица – это количество фе рмента в 1мл, которое сверты вает равный объем оксалатной человеческой плазмы, разбавленной 1:1, за 20±2 сек. при 370С. Таблица 1. Зависимость времени свертывания плазмы от количества вносимого в тест фе рмента Количеств о экамулина, ед. Время св ертывания донорской плазмы, сек. Время св ертывания донорской плазмы с экзогенным претромбином 1 (0,004мг/мл), сек Отличие от контроля 7,8 ´ 10-5 2,6 ´ 10-5 1,3 ´ 10-5 0,73 ´ 10-5 67±2 63±1 92±3 84±2 115±3 86±3 132±2 100±3 4 (5,97%) 8 (8,7%) 29 (25,2%) 32 (24,2%) ПИ, ЄИ. % Содержание протромбина в плазме, % Кривые (1) и (2) – зави симость ПИ от уровня протромбина в модельной плазме без претромбина 1 в концентрации 0.0036 мг/мл соответственно. Кривые (3), (4), (5) и (6) – зависимость ЭИ от уровня протромбина в модельной плазме без претромбина 1 и при добавлении претромбина 1 в концентрации 0.0012, 0.0024 и 0.0036 мг/мл соответственно. Приведенные данные, указывают на то, что оптимальное время свертывания в тесте соста вляет 120±2 секунд. При выборе такого времени разница между вре менем свертывания донорской плазмы и плазмы, содержащей претромбин 1, составляет досто верную и легко регистрируемую ве личину – 30 секунд, что составляет 25% от контроля. При уменьшении контрольного времени свертывания снижается точность результатов те ста. В модельных плазмах определяют экамулиновое (ЭВ) и протромбиновое время (ПВ) свертывания и вычисляют протромбиновый (ПИ) и экамулиновый (ЭИ) индексы плазмы по формуле: ПИ (ЭИ) в %= А/В ´ 100, где А – время свертывания в тесте плазмы донора, В – время свертывания исследуемой плазмы. На чертеже (кривая 1) видно, что ПИ менее чувствителен к колебанию уровня протромбина в плазме и совершенно не чувствителен к наличию в плазме претромбина 1 (кривая 2), в отличие от ЭИ (кривые 3, 4, 5, 6). Приведенные на рисунке кривые 3-6 могут быть использованы для количественного определения уровня протромбина в плазме в тесте «экамулиновое время». Кривые 4, 5, 6 получены при внесении различных количеств претромбина 1, соответствующи х 0,0012; 0,0024; 0,0036 мг/мл плазмы к образцам разведенных фи бриногеном плазм, содержащих различные количества протромбина. Сущность способа показана на примерах. Пример 1 (контроль, донор). В стеклянную коническую пробирку вносят 0,1 мл 0,025 М раствора CaCl2, 0,1 мл раствора фермента Экамулина, содержаще го 1,3´10-5 единиц, и 0,1 мл исследуемой плазмы. Раствор тща тельно перемешивают и помещают в водяной термостат, нагретый до 370С. Постоянно встряхивая пробирку, засекают время свертывания плазмы в тесте. Параллельно определяют протромбиновый индекс исследуемой плазмы. Для этого смешивают в пробирке 0,1 мл тромбопластина, 0,1 мл 0,025 М раствора CaCl2, и икубируют 1 минуту при 370С, затем вносят 0,1 мл исследуемой плазмы. Постоянно встряхи вая пробирку, засекают время свертывания в протромбиновом тесте. Время свертывания донорской плазмы в экамулиновом тесте 120 сек. Экамулиновый индекс – 100%. Время свертывания донорской плазмы в протромбиновом тесте 17 сек. Протромбиновый индекс – 100%. Вывод: в плазме данного человека содержится нормальное количество протромбина и отсутствует претромбин 1.