Амінокислотний склад ферментних препаратів пероксидаз штаму p-01 базидіоміцету pleurotus ostreatus (jacq.: fr.) kumm.

Амінокислотний склад ферментних препаратів пероксидаз штаму Р-01 базидіоміцету Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm., які містять фермент, який відрізняється тим, що як ферментом є пероксидази позаклітинного та внутрішньоклітинного походження і містять, відповідно, мг %: аланін 3,21 та 2,67 валін 3,78 та 3,93 лейцин 9,32 та 8,51 ПЕРОКСИДАЗ видається під відповідальність власника патенту 3 14943 4 Отже, зростаючий дефіцит тваринної сировини пролін 3,31 та 3,94; основного джерела промислових ензимів фенілаланін 9,20 та 9,73; обумовлює пошук нових продуцентів, зокрема метіонін 1,62 та 1,87; поміж базидіоміцетів, які б мали високі виробничі гліцин 3,93 та 2,79; властивості. серии 4,09 та 3,28; Відомі фізико-хімічні характеристики треонін 3,44 та 3,65; позаклітинних протеїназ культур базидіоміцетів цистеїн 1,07 та 0,29; Coriolus consors, С. hirsutus, C. versicolor, тирозин 8,76 та 9,09; Daedaleopsis styracina, Fomitopsis castaneae, F. аспарагінова кислота cytisina, F. pinicola, Irpex lacteus, Lenzites betulina, (аспарагін) 15,56 та 15,38; Pycnoporus coccineus, Schizophyllum commune, глутамінова кислота Trametes sanguineus, Coprinus macrorhizus, (глутамін) 13,11 та 12,40; Flammulina velutipes, Lentinus edodes, Russula лізин 8,12 та 9,73; decolorans. Однак, дослідження охоплюють аргінін 4,78 та 5,98; достатньо вузьку систематичну групу грибів, гістидин 3,04 та 3,35. надаються характеристики ферментних Пропонована корисна модель є нова, тому що препаратів різного ступеня очистки, не наводяться не відома з амінокислотного складу і вмісту білку дані з активності пероксидаз досліджених культур грибних ферментних препаратів пероксидаз, [3]. ферментативної активності та продуценту. Найбільш близький за технічною суттю і Приклад конкретного виконання 1. Штам гливи досяжності результату є амінокислотний склад звичайної Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. Pмолокозсідальних ферментних препаратів (ФП) 01 виділено за методом виділення чистих культур базидіальних ксилотрофів Corticium laeve Fr. базидіоміцетів [4] з природної популяції, з (штам Р-330); Chaetoporus ambiquus (Bres.) Bond. плодових тіл, які росли на пні тополі канадської et Sing. (B-062); Fibuloporia mollusca (Pers.) Bond. (Populus deltoides Marsh.) у екологічно et Sing. (A-020); Tyromyces lacteus (Fr.) Murr. (Aнебезпечному районі м. Донецька [5]. 027); Tyromyces revolutus (Bres.) Bond. et Sing. (AКультивування штаму P-01 базидіоміцету Pleurotus 025); Tyromyces undosus (Peck.) Murr. (C-070, Mostreatus проводять в колбах об'ємом 1 або 2 250); Irpex lacteus (Fr.: Fr.) Fr. (B-059, M-232, Mлітри. Колби містять 350 чи 700мл, відповідно, 253); Amiloporia lenis (Karst.) Bond. et Sing. (A-004); стерильного глюкозо-пептонного середовища Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv. (M-81) і Hydnum наступного складу, г/л: ochraceum Pers. (B-046). Штами грибів глюкоза 10,0; вирощували поверхнево на рідкому суслопептон 3,0; пептонному середовищі, що містило знехмілене КН2РО4 0,6; пивне сусло (4° по Балінгу) і ферментативний К2НРО4 0,4; пептон (3г/л) до максимальної молокозсідальної MgSО4 7Н2О 0,5; активності культурального фільтрату. Грибні CaCl2 0,05; ферментні препарати, які мали позаклітинне ZnSO4 7Н2О 0,001; походження, отримували шляхом фракціонування дистильована вода до 1л [7]. сульфатом амонію з культурального фільтрату. Інокулюм становить 5-10%. Культивування Кількісний вміст зв'язаних амінокислот і білка у проводять до максимальних значень молокозсідальних ФП визначали за допомогою пероксидазної активності культурального амінокислотного аналізатора моделі ААА-881, фільтрату і міцелію - протягом 15-20-ти діб в після їх кислотного гідролізу. Не наводяться дані з термостаті при температурі 27,5°С. активності пероксидаз досліджених культур [7]. Визначають ПА культурального фільтрату, В основу корисної моделі покладено завдання вегетативного міцелію і ферментного препарату встановлення амінокислотного складу (ФП) штаму P-01 Pleurotus ostreatus за методом, ферментних препаратів пероксидаз штаму Р-01 який базується на вимірі за допомогою базидіоміцету Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) фотоелектроколориметра (наприклад, приладу Kumm., який відрізняється від прототипу КФК-2-УХЛ 4,2) інтенсивності забарвлення ферментативною активністю, походженням продукту окиснення о-діанізидину перекисом ферменту, амінокислотним складом, продуцентом водню, який утворився при дії пероксидази. та дешевий у виробництві. Одиниця пероксидази відповідає кількості Поставлене завдання вирішується тим, що ферменту, що каталізує перетворення 1мкмоля встановлено амінокислотний склад ферментних Н2О2 за одну хвилину в оптимальних умовах. препаратів пероксидаз штаму Р-01 базидіоміцету Розрахунки проводять за формулою [4]: Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm., які містять E V1 X p, фермент, згідно корисної моделі в якості E1 K V2 t ферменту є пероксидази позаклітинного та де, X - активність ферменту пероксидази; Е внутрішньоклітинного походження і містять в собі, екстинкція; V1 - об'єм забарвленої проби; V2 відповідно мг %:об'єм культурального фільтрату (КФ) або аланін 3,21 та 2,67; гомогенату міцелію (МГ); Е1 - коефіцієнт валін 3,78 та 3,93 ; мікромолярної екстинкції (0,0128); К - коефіцієнт лейцин 9,32 та 8,51; для перерахунку з міліметрів у літри (1000); t - час ізолейцин 3,66 та 3,41; інкубації (5хв.); р - коефіцієнт розведення оксипролін 0,00 та 0,00; 5 14943 6 культурального фільтрату чи ФП. Прилад для діалізу містився в холодильнику. Приклад конкретного виконання 2. Отримані розчини фракцій білків піддають Фракціонування пероксидаз проводять сульфатом подальшим дослідженням. Зокрема - ліофільній амонію. Використовують цей метод завдяки сушці, наприклад на приладі "Иней-3-2" та великій розчинності у воді та стабілізуючій дії на визначають пероксидазну активність ферментних білкову молекулу (NH4)2SО4 [4, 7]. Культуральну препаратів, які мають вид порошку від світлорідину відділяють від міцелію шляхом кремового до світло-коричневого забарвлення, фільтрування. Отриманий міцелій додатково добре розчинні у воді. підсушують на фільтрувальному папері і Пероксидазна активність ферментного охолоджують до 0±1°С. Підготовлений міцелій препарату з культурального фільтрату штаму Р-01 гомогенізують шляхом розтирання з абразивним дорівнює ХКФ=1,70 10-2од/г; активність ФП порошком у ступці за допомогою товкачика, міцеліальних пероксидаз дорівнює ХМГ=1,61 102 суспендіюють охолодженою дистильованою водою од/г. в співвідношенні 1:20. Осад відділяють Приклад конкретного виконання 3. центрифугуванням на рефрижераторній Амінокислотний склад ФП пероксидаз штаму Р-01 центрифузі при 5±1°С, відцентровому прискоренні базидіоміцету Pleurotus ostreatus визначають за 2000g протягом 15 хвилин. Осадження білків по допомогою амінокислотного аналізатора, фракціям з гомогенату міцелію та культурального наприклад моделі ААА-881, після кислотного фільтрату здійснюють при 5±1°С шляхом гідролізу білків. Дані аналізу надано у таблиці, де поступового збільшення концентрації сульфату амінокислоти розташовані залежно від природи амонію у культуральному фільтраті до 40-60% радикалів (амфотерності) білкових молекул. насичення чи супернатанті - до 40-70%. Фракцію Таблиця, також, містить дані про вміст білка в ФП. білку, яка утворила осад, відділяють Дані подаються без зазначення похибки, оскільки центрифугуванням на рефрижераторній представляють точні результати амінокислотного центрифузі при 5+1°С, відцентровому прискоренні аналізу одного зразка ферментного препарату, 2000g протягом 15 хвилин. Наступним етапом отриманого з культурального фільтрату і одного - з проводять первинну очистку отриманої білкової міцелію штаму Р-01. фракції за допомогою діалізу проти охолодженої до 5±1°С дистильованої води протягом 24 годин. Таблиця Вміст білку і амінокислотний склад ферментних препаратів пероксидаз штаму Р-01 базидіоміцету Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. № з/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Амінокислота Ала Вал Лей Іле О-про Про Фен Мет Глі Сер Тре Цис Тир Асп Глу Ліз Арг Гіс % білка в ФП Отже, на відміну від результатів аналізу амінокислотного складу ФП прототипу у складі білків пероксидаз штаму Р-01 гливи звичайної не виявлено оксипролін (О-про) з групи неполярних, гідрофобних амінокислот. Вміст в препаратах гліцину (Глі) з полярних, гідрофільних амінокислот, пояснюється, скоріше всього, внесенням у Вміст амінокислот, мг % ФПКФ 3,21 3,78 9,32 3,66 0,00 3,31 9,20 1,62 3,93 4,09 3,44 1,07 8,76 15,56 13,11 8,12 4,78 3,04 37,8145 ФПМГ 2,67 3,93 8,51 3,41 0,00 3,94 9,73 1,87 2,79 3,28 3,65 0,29 9,09 15,38 12,40 9,73 5,98 3,35 42,4115 живильне середовище ферментативного пептону, що має у складі до 2,22% цієї амінокислоти від вмісту азоту. Високий вміст негативно заряджених аспарагінової (Асп) і глутамінової (Глу) амінокислот у ферментних білках може свідчити про їх кислу природу. Але це припущення вірне в тому разі, коли в білках вони не знаходяться у 7 14943 8 вигляді глутаміну і аспарагіну, що при кислотному №3. - С.192-201. гідролізі довести не можливо. Побічним 3. Денисова Н.П. Протеолитические ферменты показником переваги у структурі білків ФП кислих базидиальных грибов, таксономические и амінокислот може бути те, що 0,1%-ні водні экологические аспекты их изучения: Автореф. ... розчини ферментних препаратів виявили низький дис. д-ра биол. наук. - Л., 1991. - 31с. рівень рН, так цей показник для ФПКФ дорівнював 4. Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. 5,38; а ФПМГ - 5,80. Вміст у досліджених білках Методы экспериментальной микологии. основних, позитивно заряджених амінокислот Справочник. - К.: Наук. думка, 1982. - 550с. аргініну (Арг) та гістидину (Гіс) є значно нижчим, 5. Патент 46461А України. Штам соматичних ніж попередніх і не може суттєво впливати на структур їстівного базидіоміцета Pleurotus природу протеїну. Вміст білку в міцеліальному ostreatus (Jacg.: Fr.) Kumm. P-01 - продуцента препараті незначно вищій за такий у ФП, плодових тіл і міцелію з антиокисними отриманого з культурального фільтрату. властивостями / Федотов О.В., Вовк Н.В. Заявка Таким чином, отримані грибні ферментні №2001075193, від 20.07.01, кл. 7 C12N 1/14, A01G препарати пероксидаз ендо- і екзогенного 1/04, Бюл. №5, від 15.05.02. походження штаму Р-01 базидіоміцету Pleurotus 6. Соломко Э.Ф., Дудка И.А. Перспективы ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm., які мають использования высших базидиомицетов в індивідуальні характеристики вмісту амінокислот і микробиологической промышленности // білка. Встановлено кількісне співвідношення ВНИИСЭНТИ: Обзорная информация. Сер. 3. - М., амінокислот ФП пероксидаз, яке свідчить про їх 1985. - 48с. кислу природу. Відпрацьований спосіб отримання 7. Федотов О.В. Активні продуценти та визначений склад ферментних препаратів молокозгортаючих ферментів серед гіменоміцетів, пероксидаз штаму Р-01 базидіоміцету P. ostreatus їх біологічні особливості та перспективи відкривають перспективи їх використання у застосування: Автореф. дис. ... к-та біол. наук. - К., харчовій і фармацевтичній промисловостях. 1995, - 20с. (прототип). Джерела інформації: 8. Eriksson K.-E., Blanchette R.A., Ander P. 1. Билай В.И. Основы общей микологии. - К.: Microbial and enzymatic degradation of wood and Вища школа, 1980. - 360с. wood components. Berlin, Heidelberg: Springier2. Бухало А. С., Соломко Е.Ф., Митропольска Verlag, 1990. Н.Ю. Базидіальні макроміцети з лікарськими 9. Tardif A. La Mycotherapie ou Les proprietes властивостями // Укр. ботан. журн. - 1996. - 53, Medicinales des Champignons. - Paris, 2000. - 167p. Комп’ютерна верстка Л. Купенко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601