Амінокислотний склад ферментних препаратів пероксидаз штаму f-vv базидіоміцету flammulina velutipes (curt.:fr.) sing.

Амінокислотний склад ферментних препаратів пероксидаз штаму F-vv базидіоміцету Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing., які містять фермент, який відрізняється тим, що ферментом є пероксидази позаклітинного та внутрішньоклітинного походження, які містять в собі, відповідно, мг %: аланін 2,32 та 2,15 валін 5,34 та 4,06 лейцин 8,87 та 8,91 ізолейцин 5,56 та 6,25 ПЕРОКСИДАЗ видається під відповідальність власника патенту 3 14942 4 нак, дослідження охоплюють достатньо вузьку Пропонована корисна модель є нова, тому що систематичну групу грибів, надаються характерине відома з амінокислотного складу і вмісту білку стики ферментних препаратів різного ступеня очигрибних ферментних препаратів пероксидаз, стки, не наводяться дані з активності пероксидаз ферментативної активності та продуценту. досліджених культур [3]. Приклад конкретного виконання 1. Штам F-vv Найбільш близький за технічною суттю і досязимового опенька Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) жності результату є амінокислотний склад молокоSing. виділено за методом виділення чистих кульзсідальних ферментних препаратів (ФП) базидіатур базидіоміцетів з природної популяції, з плодольних ксилотрофів Corticium laeve Fr. (штам Рвих тіл, які росли на пні робінії [Robinia 330); Chaetoporus ambiquus (Bres.) Bond. et Sing. pseudoacacia L.] біля автомобільної траси м. До(B-062); Fibuloporia mollusca (Pers.) Bond. et Sing. нецька [4, 5]. Культивування штаму F-vv F. (A-020); Tyromyces lacteus (Fr.) Murr. (A-027); Tyvelutipes проводять в колбах об'ємом 1 або 2 romyces revolutus (Bres.) Bond. et Sing. (A-025); літри. Колби містять 350 чи 700мл, відповідно, Tyromyces undosus (Peck.) Murr. (C-070, M-250); стерильного глюкозо-пептонного середовища наIrpex lacteus (Fr.: Fr.) Fr, (B-059, M-232, M-253); ступного складу, г/ л: Amiloporia lenis (Karst.) Bond. et Sing. (A-004); Hirглюкоза 10,0; schioporus laricinus (Karst.) Ryv. (M-81) і Hydnum пептон 3,0; ochraceum Pers. (B-046). Штами грибів вирощуваКН2РО4 0,6; ли поверхнево на рідкому сусло-пептонному К2НРО4 0,4; середовищі, що містило знехмілене пивне сусло MgSО4х7Н2О 0,5; (4° по Балінгу) і ферментативний пептон (3г/ л) до СаСl2 0,05; максимальної молокозсідальної активності культуZnSО4 х 7Н2О 0,001; рального фільтрату. Грибні ферментні препарати, дистильована вода до 1 л [7]. які мали позаклітинне походження, отримували Інокулюм становить 5-10%. Культивування шляхом фракціонування сульфатом амонію з проводять до максимальних значень культурального фільтрату. Кількісний вміст пероксидазної активності культурального зв'язаних амінокислот і білка у молокозсідальних фільтрату і міцелію - протягом 15-20-ти діб в ФП визначали за допомогою амінокислотного термостаті при температурі 27,5°С. аналізатора моделі ААА-881, після їх кислотного Визначають ПА культурального фільтрату, вегідролізу. Не наводяться дані з активності перокгетативного міцелію і ферментного препарату (ФП) сидаз досліджених культур [7]. штаму F-vv Flammulina velutipes за методом, який В основу корисної моделі покладено завдання базується на вимірі за допомогою фотоелектроковстановлення амінокислотного складу ферментлориметра (наприклад, приладу КФК-2-УХЛ 4,2) них препаратів пероксидаз штаму F-vv базидіоміінтенсивності забарвлення продукту окиснення оцету Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing., який діанізидину перекисом водню, який утворився при відрізняється від прототипу ферментативною акдії пероксидази. Одиниця пероксидази відповідає тивністю, походженням ферменту, амінокислотним кількості ферменту, що каталізує перетворення складом, продуцентом та дешевий у виробництві. 1мкмоля Н2О2 за одну хвилину в оптимальних Поставлене завдання вирішується тим, що умовах. Розрахунки проводять за формулою [4]: встановлено амінокислотний склад ферментних V1 p, препаратів пероксидаз штаму F-vv базидіоміцету V2 t 1 Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing., які містять де, Х - активність ферменту пероксидази; Е фермент, згідно корисної моделі в якості ферменекстинкція; V1 - об'єм забарвленої проби; V2 ту є пероксидази позаклітинного та внутрішньокліоб'єм культурального фільтрату (КФ) або гомогетинного походження і містять в собі, відповідно мг нату міцелію (МГ); E1 - коефіцієнт мікромолярної %: екстинкції (0,0128); К - коефіцієнт для перерахунку аланін 2,32 та 2,15; з міліметрів у літри (1000); t - час інкубації (5хв.); рвалін 5,34 та 4,06; коефіцієнт розведення культурального фільтрату лейцин 8,87 та 8,91; чи ФП. ізолейцин 5,56 та 6,25; Приклад конкретного виконання 2. Виділення оксипролін 0,00 та 0,00; пероксидаз проводять шляхом осадження пролін 2,93 та 4,60; білкових молекул сульфатом амонію. Використофенілаланін 10,03 та 4,93; вують цей метод завдяки великій розчинності у метіонін 5,57 та 2,07; воді та стабілізуючій дії на білкову молекулу гліцин 4,80 та 7,01; (NH4)2SO4 [4, 7]. Культуральну рідину відділяють серин 3,53 та 3,00; від міцелію шляхом фільтрування. Отриманий треонін 3,00 та 3,99; міцелій додатково підсушують на цистеїн 1,37 та 1,45; фільтрувальному папері і охолоджують до 0±1°С. тирозин 9,72 та 7,84; Підготовлений міцелій гомогенізують шляхом розаспарагінова кислота тирання з абразивним порошком у ступці за допо(аспарагін) 12,70 та 14,08; могою товкачика, суспендіюють охолодженою дисглутамінова кислота тильованою водою в співвідношенні 1:20. Осад (глутамін) 10,76 та 12,39; відділяють центрифугуванням на лізин 6,86 та 8,58; рефрижераторній центрифузі при 5±1°С, аргінін 4,04 та 5,74; відцентровому прискоренні 2000 g протягом 15 гістидин 2,60 та 2,95. 5 14942 6 хвилин. Осадження білків по фракціям з гомогенадобре розчинні у воді. ту міцелію та культурального фільтрату Пероксидазна активність ферментного препаздійснюють при 5±1°С шляхом додавання сульфарату з культурального фільтрату штаму F-vv доріту амонію до 40-70% та 40-60% насичення внює ХКФ = 2,4 10-2од/г; активність ФП міцеліальвідповідно. Фракцію білку, яка утворила осад, них пероксидаз дорівнює ХМГ = 4,6 10-2од/г. відділяють центрифугуванням на Приклад конкретного виконання 3. Вміст білку і рефрижераторній центрифузі при 5±1°С, амінокислотний склад ФП пероксидаз штаму F-vv відцентровому прискоренні 2000 g протягом 15 базидіоміцету Flammulina velutipes визначають за хвилин. Наступним етапом проводять первинну допомогою амінокислотного аналізатора, наприкочистку отриманої білкової фракції за допомогою лад моделі ААА-881, після кислотного гідролізу діалізу проти охолодженої до 5±1°С дистильованої білків. Дані з вмісту білка в ФП і аналізу надано у води протягом 24 годин. Прилад для діалізу таблиці, де амінокислоти розташовані залежно від містився в холодильнику природи радикалів (амфотерності) білкових молеОтримані розчини фракцій білків піддають покул. Дані подаються без зазначення похибки, дальшим дослідженням. Зокрема - ліофільній оскільки представляють точні результати сушці, наприклад на приладі "Иней-3-2" та визнаамінокислотного аналізу одного зразка ферментчають пероксидазну активність ферментних ного препарату пероксидаз з культурального препаратів, які мають вид порошку від світлофільтрату і одного - з міцелію. кремового до світло-коричневого забарвлення, Таблиця Вміст білку і амінокислотний склад ферментних препаратів пероксидаз штаму F-vv базидіоміцету Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. № з/ п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Амінокислота Ала Вал Лей Іле О-про Про Фен Мет Глі Сер Тре Цис Тир Асп Глу Ліз Арг Гіс % білка в ФП Отже, отримані ферментні препарати відрізняються за вмістом білка, якого більше в препараті з міцелію. З групи неполярних, гідрофобних амінокислот на увагу заслуговує оксипролін (О-про), який на відміну від ФП прототипу не виявлено у складі білків пероксидаз штаму F-vv зимового опенька. Вміст в ФП гліцину (Глі) з полярних, гідрофільних амінокислот, пояснюється, скоріше всього, внесенням у живильне середовище ферментативного пептону, що має у складі до 2,22% цієї амінокислоти від вмісту азоту. Високий вміст негативно заряджених аспарагінової (Асп) і глутамінової (Глу) амінокислот у ферментних білках може свідчити про їх кислу природу. Але це припущення вірне в тому разі, коли в білках вони не знаходять Вміст амінокислот, мг % ФПКФ 2,32 5,34 8,87 5,56 0,00 2,93 10,03 5,57 4,80 3,53 3,00 1,37 9,72 12,70 10,76 6,86 4,04 2,60 39,6309 ФПМГ 2,15 4,06 8,91 6,25 0,00 4,60 4,93 2,07 7,01 3,00 3,99 1,45 7,84 14,08 12,39 8,58 5,74 2,95 50,4938 ся у вигляді глутаміну і аспарагіну, що при кислотному гідролізі довести не можливо. Побічним показником переваги у структурі білків ФП кислих амінокислот може бути те, що 0,1%-ні водні розчини ферментних препаратів виявили низький рівень рН, так цей показник для ФП ко дорівнював 5,75; а ФП мг - 5,80. Вміст у досліджених білках основних, позитивно заряджених амінокислот аргініну (Арг) та гістидину (Гіс) є значно нижчим, ніж попередніх і не може суттєво впливати на природу протеїну. Таким чином, грибні ферментні препарати позаклітинних та міцеліальних пероксидаз штаму Fvv базидіоміцету Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. мають індивідуальні характеристики вмісту білка та склад амінокислот, що свідчить про їх ки 7 14942 8 слу природу. Застосований дешевий спосіб отриструктур їстівного базидіоміцета Flammulina мання та визначений склад ферментних препараvelutipes (Curt.: Fr.) Sing. F-vv - продуцента плодотів пероксидаз F-vv базидіоміцету Flammulina вих тіл і міцелію з антиокисними властивостями / velutipes відкривають перспективи їх використання Федотов О.В., Горяшник Ю.В. Заявка на підприємствах мікробіологічної, фармацевтич№2003020945, від 04.02.2003, кл. 7C12N1/14, ної та інших галузей промисловості. A01G1/04, Бюл. №2, від 16.02.04. Джерела інформації, які використані при 6. Соломко Э.Ф., Дудка И.А. Перспективы исукладанні заявки пользования высших базидиомицетов в микро1. Билай В.И. Основы общей микологии. - К.: биологической промышленности // ВНИИСЭНТИ: Вища школа, 1980. - 360с. Обзорная информация. Сер. 3. - М., 1985. - 48с. 2. Бухало А. С., Соломко Е.Ф., Митрополъская 7. Федотов О.В. Активні продуценти молокозН.Ю. Базидіальні макроміцети з лікарськими власгортаючих ферментів серед гіменоміцетів, їх біотивостями // Укр. ботан. журн. - 1996. - 53, № 3. логічні особливості та перспективи застосування: С. 192-201. Автореф. дис. ... к-та біол. наук. - К., 1995, - 20с. 3. Денисова Н.П. Протеолитические ферменты (прототип) базидиальных грибов, таксономические и экологи8. Eriksson K.-E., Blanchette R.A., Ander P. Miческие аспекты их изучения: Автореф. ... дис. д-ра crobial and enzymatic degradation of wood and wood биол. наук. - Л., 1991. -31с. components. Berlin, Heidelberg: Springier-Verlag, 4. Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. 1990. Методы экспериментальной микологии. Справоч9. TardifA. La Mycotherapie ou Les proprietes ник. - К.: Наук. думка, 1982. - 550с. Medicinales des Champignons. -Paris, 2000. - 167p. 5. Патент 64129 А України. Штам соматичних Комп’ютерна верстка Л. Купенко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601