Спосіб одержання ферментних препаратів каталази flammulina velutipes (curt.: fr.) sing. i pleurotus ostreatus (jacq.: fr.) kumm.

Корисна модель відноситься до мікології та біотехнології і може бути використана на підприємствах мікробіологічної, фармацевтичної та інших галузей промисловості. Інтродукція продуцентів біологічно активних речовин в культуру, та розробка способів отримання на їх основі екологічно чистих харчових продуктів і БАР - актуальні питання розвитку біотехнології [2, 8]. Грибівництво традиційно орієнтовано на виробництво харчових, а в останні роки і кормових продуктів. Доведено, що ви щі базидіальні гриби є цінною сировиною для отримання біологічно активних речовин, придатних до застосування у різних галузях промисловості [9, 11-13]. Висока промислова застосовність та новизна роблять ці препарати і технології їх одержання патентоспроможними [2]. Ксилотроф зимовий опеньок Flammulina velutipes [Curt.: Fr.] Sing. має антибактеріальні, антивірусні, антифунгальні, протипухлинні, імуномодулюючі, гіпоглікемічні, тромболітичні властивості [3]. Встановлено, що за вмістом активних речовин протипухлинної дії ксилотроф глива звичайна Pleurotus ostreatus [Jacq.: Fr.] Kumm. стоїть на третьому місці після сіїтаке Lentinus edodes (Berk.) Sing. й опенька літнього Kuehneromyces mutabilis [Schff. ex Fr.] Sing. et A.H.Sm.; має антивірусну, анти фунгальну, радіопротекторну та імуномодулюючу дію, покращує роботу м'язів [3, 7]. Швидко розвивається їх штучне культивування, отже вони представляють інтерес як для грибівництва, так і для фармакологічної і харчової промисловостей. Фермент каталаза (1.11.1.6) широко розповсюджений у природі. Каталазна активність спостерігається у всі х організмів, за виключенням облігатних анаеробів. Сутність каталітичної дії каталази полягає в розкладанні пероксиду водню, що утворюється при дисмутації супероксидного аніону і при аеробному окисненні відновлених флавопротеїдів з виділенням молекулярного кисню. Каталаза відноситься до ферментів, що найбільш довго зберігають свою високу активність, майже не потребує енергії активації, швидкість реакції цього ферменту обмежується лише швидкістю дифузії субстрату до активного центру [4, 5]. Тому, каталаза поряд з іншими ензимами, у численних дослідах використовується як маркерний фермент, що адекватно відображає реакцію організмів на зміну умов (факторів) живильного чи навколишнього середовищ. З'ясовано, що каталаза разом з пероксидазами відіграють відповідну захисну роль антиоксидантної системи організму на несприятливі умови життєдіяльності і інфекції при утворенні токсичних сполук реакцій перекисного окиснення ліпідів [12]. Відомо спосіб отримання молокозсідального ферментного препарату, який передбачає поверхневе культивування продуцента Hirschioporus laricinus ВКЛМ F-263 на глюкозо-пептонному живильному середовищі до досягнення максимальної молокозсідальної активності культурального фільтрату, вилучення міцелію фільтруванням, осадження ферменту сірчанокислим амонієм при 55-80% насиченні та очистка діалізом проти дистильованої води і методом електрофорезу в паралельних пластинах поліакриламідного гелю [1]. Найбільш близький за технічною суттю і досяжності результату є спосіб отримання ферментних препаратів молокозсідальної дії, за яким вперше отримано та досліджено молокозсідальну і антиокисну активність 13 ферментних препаратів афілофорових грибів. Застосовували поверхневе культивування штамів-продуцентів Amyloporia lenis (Karst.) Bond. et Sing.; Chaetoporus ambiquus [Bres.] Bond. et Sing.; Corticium laeve Fr.; Fibuloporia mollusca (Pers.) Bond. et Sing.; Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv.; H ydnum ochraceum Pers.; Irpex lacteus (Fr.: Fr.) Fr.; Sparassis crispa (Fr.) Fr.; Tyromyces lacteus (Fr.) Murr.; T. re volutus (Bres.) Bond. et Sing.; T. undosus (Peck.) Murr. на глюкозо-пептонному живильному середовищі до досягнення максимальної молокозсідальної активності культурального фільтрату, вилучення міцелію фільтруванням, осадження ферменту сірчанокислим амонієм при 40-90% насиченні та очистку діалізом проти дистильованої води [9, 10]. В основу корисної моделі покладено завдання розробки способу одержання ферментних препаратів каталази Flammulina velutipes [Curt.: Fr.] Sing. і Pleurotus ostreatus [Jacq.: Fr.] Kumm., який відрізняється від найближчого аналогу визначенням рівня каталазної активності вегетативного міцелію, ступенем насиченості (NF4)2SО4 та продуцентами. Поставлене завдання вирішується тим, що спосіб одержання ферментних препаратів каталази Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. і Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. передбачає культивування продуцентів на глюкозо-пептонному живильному середовищі, згідно з корисною моделлю, до досягнення максимальної каталазної активності вегетативного міцелію, вилучення міцелію фільтруванням, його гомогенізацію, осадження ферменту суль фатом амонію при 60-80% насиченні гомогенату міцелію, очищення фракцій білків діалізом проти дистильованої води та ліофільну сушіння ферментних препаратів. Пропонований спосіб є новим тому, що він не відомий з рівня техніки, ферментного препарату та об'єкту продуцентів. Приклад конкретного виконання 1. Штами Flammulina velutipes [Curt.: Fr.] Sing. і Pleurotus ostreatus [Jacq.: Fr.] Kumm. отримано методом вилучення "тканинних" ізолятів із свіжезібраних плодових тіл [5]. Плодові тіла зимового опенька, штами Fv-1, Fv-7 і F-vv зібрані у екологічно забруднених районах м.Донецька. Гриб ріс на деревині мертвих чи ушкоджених листяних дерев Acer pseudoplatanus L. - штами Fv-1, Fv-7; штам F-vv виділено з плодових тіл, які росли на пні робінії Robinia pseudoacacia L. Плодові тіла гливи звичайної, штами Р-01 і Р-205 зібрані вздовж автомобільних трас м.Донецька, а також в дендрарії Донецького ботанічного саду ПАН України. Плодові тіла росли на пнях тополь: штами Р-01 і Р-11 - тополі канадської Populus deltoides Marsh., штам Р-205 - тополі самаркандської Populus bolleana Lauche. Чисті міцеліальні культури штамів підтримують у пробірках шля хом пересівів через 5-6 місяців на агаризоване знехмілене пивне сусло (4° по Баллінгу) або інші агаризовані живильні середовища [5]. Для визначення каталазної активності (КА) міцелію, штами вирощують на глюкозо-пептонному середовищі наступного складу, г/л: глюкоза 10,0 пептон ферментативний 3,0 КН2РO4 0,6 К2НРO4 0,4 MgSО4 ´7H2O 0,5 CaCl2 0,05 ZnSO4´7H2 O 0,001 дистильована вода до 1л [1], або знехміленому пивному суслі (4° по Баллінгу), яке містить 3г/л ферментативного пептону. Живильне середовище розливають в культиваційні колби та стерилізують в стерилізаторі при тиску 1,1±0,1кгс/см 2, температурі 121±1°С протягом 45 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації становить 5,5-5,8рН. Культури вирощують поверхнево в колбах Ерленмейера об'ємом 250мл, які містять по 50мл живильного середовища, при температурі 27,5±0,1°С. Інокулюмом є 10-15-ти денна культура гриба на агаризованому живильному середовищі. На 5, 10, 15, 20, 25-ту добу росту штамів визначають біомасу міцелію, зміну рН живильного середовища та рівень каталазної активності гомогенату міцелію (МГ) і культурального фільтрату. Ріст штамів оцінюють за накопиченням біомаси (абсолютно сухий міцелій) ваговим методом [5]. Каталазну активність визначають за методом, який заснований на здатності пероксиду водню утворювати з солями молібдену стійкий забарвлений комплекс. Інтенсивність забарвлення вимірюють на спектрофотометрі, на приклад СФ-26, при довжині хвилі 410нм супроти нульової проби з дистильованою водою. Каталазну активність розраховують за формулою [6]: Е=(Aк -Ад)×V×t×k×р (мкат/л), де Е - активність каталази (мкат л), Ак та Ад - екстинкція контрольної та дослідної проб, V - об'єм проби, що вносили (0,1мл), t - час інкубації (600с), k - коефіцієнт мілімолярної екстинкції пероксиду водню, що дорівнює 22,2×103мМ-1см -1, р - коефіцієнт розведення. Таблиця 1 Динаміка росту, рН живильного середовища та каталазної активності міцелію штамів Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. Штам Fv-1 Fv-7 F-vv Вік культури, доба 5 10 15 20 25 5 10 15 20 25 5 10 15 20 25 рН 4,83 4,33 4,28 4,98 5,65 5,15 4,62 4,38 4,75 6,38 5,35 5,02 4,72 5,72 6,43 Біомаса, г/л 1,42±0,20 3,29±0,12 3,66±0,28 3,17±0,15 2,30±0,09 0,13±0,04 3,14±0,32 4,52±0,16 4,69±0,18 4,16±0,53 0,10±0,04 1,67±0,25 3,45±0,12 3,27±0,22 3,86±0,11 КАМГ, мкат/л×103 828,06±121,37 546,12±33,52 1305,36±131,19 1178,82±52,86 1365,30±24,01 245,08±70,57 792,54±37,98 1198,80±88,16 1236,54±147,86 1385,28±58,06 550,56±84,16 710,40±16,01 1285,38±66,15 1185,48±81,02 1125,54±53,28 Динаміка накопичення біомаси дослідними штамами гриба Flammulina velutipes, кислотності культуральної рідини та каталазної активності міцелію під час ферментації наведені у таблиці 1. КА культурального фільтрату не зафіксовано. Вірогідно високий рівень КА МГ спостерігається в 15-25-ти добовому віці культур. У таблиці 2 представлені дані накопичення біомаси, зміни кислотності культуральної рідини та каталазної активності штамів Pleurotus ostreatus під час 25-ти денної ферментації. Таблиця 2 Динаміка росту, рН живильного середовища та каталазної активності міцелію штамів Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. Штам P-01 P-11 P-205 Вік культури, доба 5 10 15 20 25 5 10 15 20 25 5 рН 5,77 5,65 4,35 4,37 4,47 5,90 5,65 4,05 4,20 5,42 6,54 Біомаса,г/л 0,35±0,02 2,55±0,07 4,75±0,04 4,65±0,10 3,75±0,04 0,37±0,10 2,12±0,20 4,31±0,30 4,14±0,18 3,84±0,06 0,04±0,01 КАМГ, мкат/л×103 2377,62±11,53 2524,14±24,01 2690,64±6,66 2317,68±16,15 2082,36±27,01 2086,80±11,75 3123,64±24,01 3023,64±24,01 10 15 20 25 6,53 4,99 5,46 5,95 2,13±0,13 4,01±0,20 4,01±0,11 3,15±0,08 2064,60±30,76 2064,60±7,69 3163,50±17,62 2977,02±11,53 Дані табл.2 свідчать про те, що досліджені штами гливи звичайної мають найвищий рівень КА міцелію штаму Р-01 в віці 15-20-ти діб, штамів Р-11 і Р-205-20-25-ти діб. Каталазну активність 5-ти добового міцелію і культурального фільтрату не зафіксовано. Приклад конкретного виконання 2. Спосіб отримання ферментного препарату каталази штаму F-vv зимового опенька Flammulina velutipes відповідно до заявленого рішення здійснюють наступним чином. Поверхневе вирощування штаму F-vv F. velutipes проводять в колбах об'ємом 1 або 2 літри. Колби містять 350 чи 700мл, відповідно, стерильного глюкозо-пептонного середовища. Інокулюм становить 5-10%. Культивування проводять протягом 15 діб в термостаті при температурі 27,5°С. Фракціонування ендогенних ферментів проводять сульфатом амонію. Використовують цей метод завдяки великій розчинності у воді та стабілізуючій дії на білкову молекулу (NH4)2SO 4 [4]. Осадження білків по фракціям з гомогенату міцелію здійснюють шляхом поступового збільшення концентрації сульфату амонію: 40, 50, ..., 100%. Гомогенат міцелію готують наступним чином. Температуру культуральної рідини доводять до 5±1°С. Міцелій відділяють від культуральної рідини шляхом фільтрування на тришаровій марлі. Отриманий міцелій додатково підсушують на фільтрувальному папері і охолоджують до 0±1°С. Підготовлений міцелій гомогенізують шляхом розтирання з абразивним порошком у ступці за допомогою товкачика, суспендірують охолодженою дистильованою водою в співвідношенні 1:20. Осад відділяють центрифугуванням на рефрижераторній центрифузі при 5±1°С, відцентровому прискоренні 2000g протягом 15 хвилин. Відповідно до обраного насичення, у супернатант додають сульфат амонію. Фракцію білку, яка утворила осад, відділяють центрифугуванням на рефрижераторній центрифузі при 5±1°С, відцентровому прискоренні 2000g протягом 15 хвилин. Наступним етапом проводять первинне очищення отриманої білкової фракції за допомогою діалізу проти охолодженої до 5±1°С дистильованої води протягом 24 годин. Прилад для діалізу містився в холодильнику. Як напівпроникну мембрану використовують целофанову плівку з порами, які пропускають речовини молекулярною масою до М=7000-10000. Таким чином, сульфат амонію та низькомолекулярні сполуки переходять в розчинник -дистильовану воду, а білки - в водорозчинну фазу. Для прискорення дифузії, розчинник декілька раз замінюють до повного очищення розчину білків від сульфату амонію. Завдяки осмосу, молекули розчинника призводять до часткового розведення дослідного розчину білків. Операції проводять окремо для кожної фракції білків. Отримані розчини фракцій білків піддають подальшим дослідженням. Зокрема - ліофільному сушінню, наприклад на приладі "Иней-3-2" та визначають каталазну активність ферментних препаратів, які мають вид порошку від світло-сірого до світло-кремового забарвлення, добре розчинні у воді. Не виявлена каталазна активність в білках, що були виділені при концентрації сульфату амонію до 60% та вище 80%. Активність каталази наявна у фракції білків ферментного препарату, що був виділений при 60-80% насиченні гомогенату міцелію сульфатом амонію. Каталазна активність ферментного препарату штаму F-vv Flammulina velutipes [Curt.: Fr.] Sing. дорівнює EМГ=12,8×106мкат/г. Приклад конкретного виконання 3. Здійснюють як приклад 2, але ферментний препарат каталази виділяють з вегетативного міцелію штаму Р-01 гливи звичайної Pleurotus ostreatus. Одержані ферментні препарати мають вид порошку від світло-сірого до світло-кремового забарвлення, добре розчинні у воді. Не виявлено каталазну активність у фракціях білків, що були осаджені з супернатанту при концентрації сульфату амонію до 60% і вище 80%. Встановлено каталазну активність у фракції білків ферментного препарату, що був виділений при 60-80% насиченні гомогенату міцелію (NH4)2SO4. Каталазна активність ферментного препарату штаму Р-01 Pleurotus ostreatus [Jacq.: Fr.] Kumm. дорівнює EМГ=9,7×106мкат/г. Таким чином, отримані результати показали, що спосіб одержання ферментного препарату каталази зимового гриба Flammulina velutipes [Curt.: Fr.] Sing. і гливи звичайної Pleurotus ostreatus [Jacq.: Fr.] Kumm. з вегетативного міцелію є новим та придатним для застосування в лабораторних дослідженнях та промисловому виробництві. Джерела інформації: 1. Авторське свідоцтво СРСР. Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата / Бойко М.И., Негруцкий С.Ф., Мирошниченко Т.В. №1395672 від 29.08.1986, м.кл. A01C12N9/58, публ.15.05.1988, бюл. №18. 2. Белова Н.В., Ефремова И.Я. Препараты из высших грибов - объект патентно-правовой охраны // Микология и фитопатология. - 1992. - 26, вып.4. - С.321-324. 3. Бухало А.С., Соломко Е.Ф., Ми тропольская Н.Ю. Базидіальні макроміцети з лікарськими властивостями // Укр. ботан. журн. - 1996. - 53, №3. - С.192-201. 4. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир. 1991. - 290с. 5. Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. Методы экспериментальной микологии. Справочник. - К.: Наук. думка, 1982. - 550с. 6. Патент 39243А України. Спосіб визначення каталазної активності базидіоміцетів / Федотов О.В., Гавриленко Г.В. Заявка №2000116560, від 21.11.00, кл. 7 C12N9/58, Бюл. №5, від 15.06.01. 7. Патент 46461А України. Штам соматичних структур їстівного базидіоміцета Pleurotus ostreatus (Jacg.: Fr.) Kumm. P-01 - продуцента плодових тіл і міцелію з антиокисними властивостями / Федотов О.В., Вовк Н.В. Заявка №2001075193, від 20.07.01, кл. 7 C12N1/14, A01G1/04, Бюл. №5, від 15.05.02. 8. Соломко Э.Ф., Дудка И.А. Перспективы использования высших базидиомицетов в микробиологической промышленности // ВНИСЭТИ: Обзорная информация, сер. 3. - М., 1985. - 48с. 9. Федотов О.В. Активні продуценти молокозгортаючих ферментів серед гіменоміцетів, їх біологічні особливості та перспективи застосування: Автореф. дис. ... к-та біол. наук. - К., 1995, - 20с. 10. Федотов О.В. Молокозсідальна і антиокисна активність ферментних препаратів штамів афілофорових грибів // Збірник наукових праць Луганського державного аграрного університету. - Луганськ: ЛДАУ, 2001. - №9 (21). Сер. "Біологічні науки". - С.136-141. (прототип). 11. Eriksson K.-E., Blanchette R.A., Ander P. Microbial and enzymatic degradation of wood and wood components. Berlin, Heidelberg: Springier-Verlag, 1990. 12. Sgherri C.L.M., Maffei M., Na vari - Izzo F. Antio xidative enzymes in wheat subjected to increasing water deficit and rewatering // J. Plant Ph ysiol. - 2000. - 157, N 3. - P.273-279. 13. Tardif A. La Mycotherapie ou Les proprietes Medicinales des Champignons. - Paris, 2000. - 167p.