Амінокислотний склад ферментних препаратів пероксидаз штаму 523 базидіоміцету lentinus edodes (berk.) sing.

Амінокислотний склад ферментних препаратів пероксидаз штаму 523 базидіоміцету Lentinus edodes (Berk.) Sing., які містять фермент, який відрізняється тим, що ферментом є пероксидази позаклітинного та внутрішньоклітинного походження, які містять в собі, відповідно мг %: аланін 6,88 та 6,74 валін 5,63 та 7,20 лейцин 8,74 та 8,91 ізолейцин 3,58 та 5,53 ПРЕПАРАТІВ видається під відповідальність власника патенту 3 ензимів обумовлює пошук нових продуцентів, зокрема поміж базидіоміцетів, які б мали високі виробничі властивості. Відомі фізико-хімічні характеристики позаклітинних протеїназ культур базидіоміцетів Coriolus consors, С. hirsutus, C. versicolor, Daedaleopsis styracina, Fomitopsis castaneae, F. cytisina, F. pinicola, Irpex lacteus, Lenzites betulina, Pycnoporus coccineus, Schizophyllum commune, Trametes sanguineus, Coprinus macrorhizus, Flammulina velutipes, Lentinus edodes, Russula decolorans. Однак, дослідження охоплюють достатньо вузьку систематичну групу грибів, надаються характеристики ферментних препаратів різного ступеня очистки, не наводяться дані з активності пероксидаз досліджених культур [2]. Найбільш близький за технічною суттю і досяжності результату є амінокислотний склад молокозсідальних ферментних препаратів (ФП) базидіальних ксилотрофів Corticium laeve Fr. (штам Р330); Chaetoporus ambiquus (Bres.) Bond. et Sing. (B-062); Fibuloporia mollusca (Pers.) Bond. et Sing. (A-020); Tyromyces lacteus (Fr.) Murr. (A-027); Tyromyces revolutus (Bres.) Bond. et Sing. (A-025); Tyromyces undosus (Peck.) Murr. (C-070, M-250); Irpex lacteus (Fr.: Fr.) Fr. (B-059, M-232, M-253); Amiloporia lenis (Karst.) Bond. et Sing. (A-004); Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv. (M-81) і Hydnum ochraceum Pers. (B-046). Штами грибів вирощували поверхнево на рідкому сусло-пептонному середовищі, що містило знехмілене пивне сусло (4° по Балінгу) і ферментативний пептон (3г/л) до максимальної молокозсідальної активності культурального фільтрату. Грибні ферментні препарати, які мали позаклітинне походження, отримували шляхом фракціонування сульфатом амонію з культурального фільтрату. Кількісний вміст зв'язаних амінокислот і білка у молокозсідальних ФП визначали за допомогою амінокислотного аналізатора моделі ААА-881, після їх кислотного гідролізу. Не наводяться дані з активності пероксидаз досліджених культур [7]. В основу корисної моделі покладено завдання встановлення амінокислотного складу ферментних препаратів пероксидаз штаму 523 базидіоміцету Lentinus edodes (Berk.) Sing., який відрізняється від прототипу ферментативною активністю, походженням ферменту, амінокислотним складом, продуцентом та дешевий у виробництві. Поставлене завдання вирішується тим, що встановлено амінокислотний склад ферментних препаратів пероксидаз штаму 523 базидіоміцету Lentinus edodes (Berk.) Sing., які містять фермент, згідно корисної моделі в якості ферменту є пероксидази позаклітинного та внутрішньоклітинного походження і містять в собі, відповідно мг %: аланін 6,88 та 6,74; валін 5,63 та 7,20; лейцин 8,74 та 8,91; ізолейцин 3,58 та 5,53; оксипролін 0,00 та 0,00; пролін 8,34 та 2,12; фенілаланін 6,47 та 5,08; метіонін 0,09 та 1,24; гліцин 7,79 та 5,01; 14941 4 серин 7,64 та 4,76; треонін 6,85 та 5,20; цистеїн 3,43 та 0,35; тирозин 5,58 та 4,10; аспарагінова кислота (аспарагін) 12,52 та 11,07; глутамінова кислота (глутамін) 8,78 та 15,74; лізин 4,35 та 9,05; аргінін 1,37 та 7,62; гістидин 1,96 та 0,28. Пропонована корисна модель є нова, тому що не відома з амінокислотного складу і вмісту білку грибних ферментних препаратів пероксидаз, ферментативної активності та продуценту. Приклад конкретного виконання 1. Штам 523 отримано з колекції культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України [4]. Культивування штаму 523 базидіоміцету Lentinus edodes (Berk.) Sing. проводять в колбах об'ємом 1 або 2 літри. Колби містять 350 чи 700 мл, відповідно, стерильного глюкозо-пептонного середовища наступного складу, г/л: глюкоза 10,0; пептон 3,0; КН2РO4 0,6; К2НРO4 0,4; 0,5; MgSO4 7H2O CaCl2 0,05; 0,001; ZnSO4 7H2O дистильована вода до 1л [7]. Інокулюм становить 5-10%. Культивування проводять до максимальних значень пероксидазної активності культурального фільтрату і міцелію - протягом 15-20-ти діб в термостаті при температурі 27,5°С. Визначають ПА культурального фільтрату, вегетативного міцелію і ферментного препарату (ФП) штаму 523 базидіоміцету Lentinus edodes (Berk.) Sing. за методом, який базується на вимірі за допомогою фотоелектроколориметра (наприклад, приладу КФК-2-УХЛ 4,2) інтенсивності забарвлення продукту окиснення о-діанізидину перекисом водню, який утворився при дії пероксидази. Одиниця пероксидази відповідає кількості ферменту, що каталізує перетворення 1мкмоля Н2О2 за одну хвилину в оптимальних умовах. Розрахунки проводять за формулою [3]: E V1 X p, E1 K V2 t де, X - активність ферменту пероксидази; Е екстинкція; V1 - об'єм забарвленої проби; V2 об'єм культурального фільтрату (КФ) або гомогенату міцелію (МГ); E1 - коефіцієнт мікромолярної екстинкції (0,0128); К - коефіцієнт для перерахунку з міліметрів у літри (1000); t - час інкубації (5хв.); р - коефіцієнт розведення культурального фільтрату чи ФП. Приклад конкретного виконання 2. Фракціонування пероксидаз проводять сульфатом амонію. Використовують цей метод завдяки великій розчинності у воді та стабілізуючій дії на білкову молекулу (NH4)2SO4 [4, 7]. Культуральну рідину відділяють від міцелію шляхом 5 фільтрування. Отриманий міцелій додатково підсушують на фільтрувальному папері і охолоджують до 0±1°С. Підготовлений міцелій гомогенізують шляхом розтирання з абразивним порошком у ступці за допомогою товкачика, суспендіюють охолодженою дистильованою водою в співвідношенні 1:20. Осад відділяють центрифугуванням на рефрижераторній центрифузі при 5±1°С, відцентровому прискоренні 2000g протягом 15 хвилин. Осадження білків по фракціям з гомогенату міцелію та культурального фільтрату здійснюють при 5±1°С шляхом поступового збільшення концентрації сульфату амонію. Відповідно до обраного насичення, у культуральний фільтрат чи супернатант додають сульфат амонію. Фракцію білку, яка утворила осад, відділяють центрифугуванням на рефрижераторній центрифузі при 5±1°С, відцентровому прискоренні 2000g протягом 15 хвилин. Наступним етапом проводять первинну очистку отриманої білкової фракції за допомогою діалізу проти охолодженої до 5±1°С дистильованої 14941 6 води протягом 24 годин. Прилад для діалізу містився в холодильнику Отримані розчини фракцій білків піддають подальшим дослідженням. Зокрема - ліофільній сушці, наприклад на приладі "Иней-3-2" та визначають пероксидазну активність ферментних препаратів, які мають вид порошку від світлокремового до світло-коричневого забарвлення, добре розчинні у воді. Пероксидазна активність ферментного препарату з культурального фільтрату штаму 523 базидіоміцету Lentinus edodes (Berk.) Sing. дорівнює ХКФ=2,18 10-2од/г; активність ФП міцеліальних пероксидаз дорівнює ХМГ=2,32 102 од/г. Приклад конкретного виконання 3. Амінокислотний склад ФП пероксидаз штаму 523 базидіоміцету Lentinus edodes (Berk.) Sing. та вміст білку у препараті визначають за допомогою амінокислотного аналізатора, наприклад моделі ААА-881, після кислотного гідролізу білків (табл.). Таблиця Вміст білку і амінокислотний склад ферментних препаратів пероксидаз штаму 523 базидіоміцету Lentinus edodes (Berk.) Sing. № з/п Амінокислота 1. Ала 2. Вал 3. Лей 4. Іле 5. О-про 6. Про 7. Фен 8. Мет 9. Глі 10. Сер 11. Тре 12. Цис 13. Тир 14. Асп 15. Глу 16. Ліз 17. Арг 18. Гіс % білка в ФП Дані таблиці подаються без зазначення похибки, оскільки представляють точні результати амінокислотного аналізу одного зразка ферментного препарату, отриманого з культурального фільтрату і одного - з міцелію. Амінокислоти розташовані залежно від природи радикалів (амфотерності) білкових молекул. З групи неполярних, гідрофобних амінокислот на увагу заслуговує оксипролін (О-про), який на відміну від ФП прототипу не виявлено у складі білків пероксидаз штаму 523 сіїтаке. Вміст в ФП гліцину (Глі) з полярних, гідрофільних амінокислот, пояснюється, скоріше всього, внесенням у живильне середовище ферментативного пептону, що має у складі до Вміст амінокислот, мг % ФПКФ 6,88 5,63 8,74 3,58 0,00 8,34 6,47 0,09 7,79 7,64 6,85 3,43 5,58 12,52 8,78 4,35 1,37 1,96 20,0547 ФПМГ 6,74 7,20 8,91 5,53 0,00 2,12 5,08 1,24 5,01 4,76 5,20 0,35 4,10 11,07 15,74 9,05 7,62 0,28 39,7189 2,22% цієї амінокислоти від вмісту азоту. Високий вміст негативно заряджених аспарагінової (Асп) і глутамінової (Глу) амінокислот у ферментних білках може свідчити про їх кислу природу. Але це припущення вірне в тому разі, коли в білках вони не знаходяться у вигляді глутаміну і аспарагіну, що при кислотному гідролізі довести не можливо. Побічним показником переваги у структурі білків ФП кислих амінокислот може бути те, що 0,1%-ні водні розчини ферментних препаратів виявили низький рівень рН, так цей показник для ФПКФ дорівнював 4,85; а ФПМГ - 5,10. Вміст у досліджених білках основних, позитивно заряджених амінокислот аргініну (Арг) та гістидину (Гіс) є 7 14941 значно нижчим, ніж попередніх і не може суттєво впливати на природу протеїну. Незначний вміст білка в ФП штаму 523 сіїтаке, скоріше за все пояснюється наявністю в них високополімерних полісахаридів. Таким чином, отримані грибні ферментні препарати пероксидаз ендо- і екзогенного походження штаму 523 базидіоміцету Lentinus edodes (Berk.) Sing., які мають індивідуальні характеристики вмісту амінокислот і білка. Встановлено кількісне співвідношення амінокислот ФП пероксидаз, яке свідчить про їх кислу природу. Відпрацьований спосіб отримання та визначений склад ферментних препаратів пероксидаз штаму 523 базидіоміцету Lentinus edodes (Berk.) Sing. відкривають перспективи їх використання у харчовій і фармацевтичній промисловостях. Джерела інформації: 1. Бухало А.С., Соломко Е.Ф., Митропольска Н.Ю. Базидіальні макроміцети з лікарськими властивостями // Укр. ботан. журн. - 1996. - 53, №3. С.192-201. 2. Денисова Н.П. Протеолитические ферменты базидиальных грибов, таксономические и экологические аспекты их изучения: Автореф. ... дис. д-ра биол. наук. - Л., 1991. - 31с. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 8 3. Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. Методы экспериментальной микологии. Справочник. - К.: Наук. думка, 1982. - 550с. 4. Каталог культур шапинкових грибів (ІВК) / А.С. Бухало, Н.Ю. Митропольська - К.: Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, 2001. 40с. 5. Соломко Э.Ф., Дудка И.А. Перспективы использования высших базидиомицетов в микробиологической промышленности // ВНИИСЭНТИ: Обзорная информация. Сер. 3. - М., 1985. - 48с. 6. Федотов О.В. Вміст продуктів перекисного окислювання ліпідів в міцелії грибів родів Pleurotus (Fr.) Kumm. та Lentinus (Berk.) Sing. / Збірник наукових праць Луганського національного аграрного університету. - Луганськ: ЛНАУ, 2003. - №22 (34). Сер. "Біологічні науки". - С.79-81. 7. Федотов О.В. Активні продуценти молокозгортаючих ферментів серед гіменоміцетів, їх біологічні особливості та перспективи застосування: Автореф. дис. ... к-та біол. наук. - К., 1995, 20с. (прототип). 8. Tardif A. La Mycotherapie ou Les proprietes Medicinales des Champignons. - Paris, 2000. - 167p. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601