Спосіб оцінки ступеня демієлінізації аксонів при експериментальному алергічному енцефаломієліті

Спосіб оцінки ступеня демієлінізації аксонів при експериментальному алергічному енцефаломієліті, що включає наркотизацію тварини з наступним вилученням однієї з складових її імунної системи та власне оцінку ступеня демієлінізації аксо 3 17499 4 деструктивного автоімунітету, запальні процеси, а нанні та ресурсоємний, але й не цілком адекватно з другого боку - дегенеративні явища та утворення відображає ступінь демієлінізації аксонів. бляшок у вогнищах запалення у паренхимі ЦНС, Завдання, яке вирішує корисна модель, що неадекватних ступеню регенерації в умовах дефізаявляється, полягає в удосконаленні способу циту трофічних факторів та мієлінутворюючих кліоцінки ступеня демієлінізації аксонів в тканині ЦНС тин. при ЕАЕ за рахунок використання кількісної харакУ численних дослідженнях було показано, що теристики клону новоутворених антигенспецифічв репаративний процес включаються загальні поних лімфоцитів у лімфоїдному органі, яка більш передники всіх клітин нервової тканини - невральні об'єктивно відображає інтенсивність антигенспестовбурові клітини та прогеніторні клітини. Це й цифічної відповіді та впливає на баланс прозапазумовило застосування клітин незрілого мозку в льних та антизапальних цитокінів. лікуванні ЕАЕ. Значний інтерес до цього явища Технічний результат, що досягається корисзумовлюється також можливою екстраполяцією ною моделлю, буде полягати у оцінці ступеня деотриманих результатів на використання невральмієлінізації аксонів без застосування ресурсоємних стовбурових клітин та прогеніторних клітин у них технологій, у доступності методичного підходу, нейрохірургічному лікуванні хворих на PC. у отриманні більш достовірних результатів, які Критичним моментом при вивченні лікувальвіддзеркалюють сутність патологічного процесу. них ефектів компонентів незрілого мозку є кількісПоставлене завдання досягається тим, що у на оцінка впливу лікування на ступінь демієлінізавідомому способі оцінки ступеня демієлінізації ції аксонів. Традиційно про лікувальний ефект аксонів при ЕАЕ, який включає наркотизацію тванових фармакологічних препаратів при ЕАЕ сурини з наступним вилученням однієї з складових її дять, оцінюючи у балах клінічний стан піддослідної імунної системи та власне оцінку ступеня демієлітварини (поза та рухливість, м'язовий тонус кінцінізації аксонів, згідно корисної моделі, в якості вок, тонус хвоста, стан сфінктерів). Така оцінка у складової імунної системи використовують монодеякій мірі суб'єктивна, шкала обирається досліднуклеари селезінки, які після вилучення інкубують ником самостійно, суб'єктивно оцінюється м'язоу поживному середовищі в присутності дексону, вий тонус кінцівок та хвоста [1]. Крім того, при бапісля чого за допомогою вітального барвника (нальній оцінці клінічного стану тварини у дослідників приклад, трипанового синього, 0,1% розчин) вивиникають труднощі щодо застосування різних значають кількість кортизолрезистентних мононузразків ад'ювантів Фрейнда, які різняться кількісклеарів селезінки у відсотках, як питому вагу ним вмістом окремих інгредієнтів і індукують ЕАЕ з незабарвлених клітин після підрахунку 300 монорізним ступенем інтенсивності запального компонуклеарів, яка після множення на обчислений конента хвороби [2]. Цей та інші відомі способи оцінреляційний коефіцієнт 0,0064 дає показник ступеки ступеня демієлінізації аксонів при ЕАЕ більшою ня демієлінізації аксонів, при значенні якого від мірою оцінюють запальний компонент (біль, тро0,36 до 0,43 ступінь демієлінізації оцінюють як нифічні зміни, стан суглобу) патології, ніж безпосезький, від 0,44 до 0,54 - як середній, а понад 0,55 редньо ступінь ураження оболонки аксону (демієвисокий. лінізації), який становить інтерес для дослідників в Відмінною особливістю способу, що заявляконтексті оцінки ефективності нових лікарських ється, є те, що при такому способі визначається препаратів. кількість кортизолрезистентних мононуклеарів. Найближчим аналогом (прототипом) способу Резистентність до кортизолу притаманна клону оцінки ступеня демієлінізації аксонів при ЕАЕ є новоутворених антигенспецифічних лімфоцитів і спосіб, при якому використовується визначення в об'єктивно відображає інтенсивність антигенспесироватці крові щурів автоантитіл до основного цифічної відповіді та алергізації, впливає на бабілка мієліну (ОБМ). Такий спосіб передбачає нарланс прозапальних та антизапальних цитокінів, котизацію тварини з наступним отриманням однієї визначаючи ступінь демієлінізації [6]. Це дозволяє з складових її імунної системи (периферичної крозначно спростити та об'єктивізувати оцінку ступеня ві), отримання сироватки крові, визначення методемієлінізації аксонів, що важливо для скринінгодом імуноферментного аналізу (ІФА) в сироватці вих досліджень. Кортизолрезистентні мононуклеакрові рівня автоантитіл до ОБМ [3], які є частиною ри при ЕАЕ є безпосередньою причиною демієлізагального пулу анти-ОБМ автоантитіл, та власне нізації аксонів, а їх кількість обумовлює ступінь оцінку ступеня демієлінізації аксонів за цим показдемієлінізації, відповідає їй, прямо корелює з веником. личиною співвідношення діаметру мієлінової обоОписаний спосіб дозволяє визначити кількість лонки до діаметру осьового циліндра у щурів з вільних автоантитіл в сироватці крові щурів з ЕАЕ. ЕАЕ за умови дотримання стандартів експерименЦей рівень віддзеркалює кількість вільних циркуту (вік, стать, генетичні особливості тварин, умови люючих автоантитіл до ОБМ, які утворюються за утримання та ін.). умови вогнищевої деструкції нервової системи. За відомими літературними даними такий споПроте однією з причин, які стримують використансіб оцінки демієлінізації аксонів при ЕАЕ невідоня цього способу і змушують більш прискіпливо мий. розглядати результати такого методу, є залежЗапропонований спосіб оцінки ступеня демієність кількісної величини цього показника від багалінізації здійснюється наступним чином. тьох факторів (проникність гематоенцефалічного Піддослідного щура наркотизують тіопенталом бар'єру, кількість вільного антигену в сироватці, вік натрію. Черевну порожнину щура розтинають, виі стать тварини, клас імуноглобулінів і т.п.) [2, 4, 5]. даляють селезінку. Фрагмент селезінки подрібнюОтже, спосіб-прототип не тільки складний у викоють та переносять до поживного середовища піс 5 17499 6 ля звільнення гомогенату від крупних фрагментів кованості ламел на тлі вираженого розповсюджефільтрацією. З отриманої суспензії вилучають моного міжламелярного набряку, а також часткове нонуклеари селезінки центрифугуванням (400g розщеплення ламел, в деяких випадках з набувпродовж 30 хвилин) у градієнті щільності фіколванням нехарактерної форми (хвилясті, спіралевєрографін (питома щільність 1,080), двічі відмиподібні, везикулярні утворення) (співвідношення вають центрифугуванням (400g впродовж 7 хвидіаметру мієлінової оболонки до діаметру осьоволин) у поживному середовищі, ресуспендують в го циліндра 0,46-0,55); повному поживному середовищі, визначають 3 ступінь - значне розволокнення і порушення щільність суспензії в камері Горяєва. Клітинність упорядкованості ламел на тлі розповсюдженого вираженого міжламелярного та периаксонального суспензії доводять до 2 106 в мл, вносять дексон набряку, з частковим розщепленням ламел і набу(кінцева концентрація 1000мкг/л), інкубують 18 ванням ними нехарактерної форми (хвилясті, спігодин при температурі 37°С у 5% СО2. Після цього ралеподібні, везикулярні утворення), а іноді навіть за допомогою вітального барвника (трипановий повне розщеплення і лізис (відсутність) мієлінових синій, 0,1% розчин) визначають кількість кортизооболонок (співвідношення діаметру мієлінової лрезистентних мононуклеарів селезінки у відсотоболонки до діаметру осьового циліндра понад ках, як питому вагу незабарвлених клітин після 0,55). підрахунку 300 мононуклеарів. Далі, згідно кількосРозрахунок співвідношення діаметру мієліноті кортизолрезистентних мононуклеарів із викорисвої оболонки до діаметру осьового циліндра аксотанням обчисленого нами коефіцієнту (кореляційна та виділення ступенів деміелінізації об'єктивно ний коефіцієнт розраховано на основі наявності відображає ступінь ураження тканини ЦНС при прямої кореляції між співвідношенням діаметру ЕАЕ у щурів (руйнування оболонок аксонів, набряк мієлінової оболонки до діаметру осьового циліндта розволокнення мієлінових ламел), що дозволяє ра у щурів з ЕАЕ та рівнем кортизолрезистентних кількісно охарактеризувати ступінь демієлінізації мононуклеарів селезінки) розраховують показник аксонів. ступеня демілінізації аксонів, при значенні якого Така оцінка ступеня демієлінізації аксонів без від 0,36 до 0,43 ступінь демілінізації оцінюють як використання електронної мікроскопії та морфонизький, від 0,44 до 0,54 - як середній, а понад метрії, а опосередковано, з урахуванням інтенсив0,55 - високий, як показано у таблиці 1: ності антигенспецифічної відповіді, може слугувати дешевим інструментом для більш швидкого Таблиця 1 скринінгу засобів лікування PC, дефіцит яких наразі гостро відчувається. Співвідношення діаметру Ступінь демієлініКонкретний приклад втілення. мієлінової оболонки до дізації аксонів Білим безпородним щурам розводки віварію аметру осьового циліндра Інституту нейрохірургії АМН України у подушечки Норма 0,15-0,35 лап вводили енцефалітогенну емульсію [1]. У різні 1-й ступінь 0,36-0,43 строки ЕАЕ забивали щурів, отримували селезінку, 2-й ступінь 0,44-0,54 визначали вміст кортизолрезистентних мононук3-й ступінь 0,55-0,67 леарів селезінки. Щур №1 (клінічна ступінь тяжкості ЕАЕ 2 бали, Таким чином, пропонується більш об'єк35 доба, лікування трансплантацією клітин фетативний спосіб оцінки ступеня тяжкості ЕАЕ у щурів, льної нервової тканини) вміст кортизолрезистента саме шляхом співставлення клінічного стану них мононуклеарів - 54%. Розрахунок: щурів з ЕАЕ і ступеня демієлінізації аксонів за до54 0,0064=0,346 помогою використання електронної мікроскопії. Величина того ж показника, отримана за доСтупінь демієлінізації аксона - це описова харакпомогою складного електронно-мікроскопічного теристика стану мієлінової оболонки, яку можна дослідження та морфометрії, майже співпадає з отримати тільки при використанні електронної мікобчисленою за запропонованим способом і станороскопії, а морфометрія дозволяє кількісно оцінити вить 0,349. Демієлінізацію аксонів згідно таблиці 1 результати електронограм (співвідношення діамеоцінюємо як демієлізацію 1-го ступеня. Отже, стутру мієлінової оболонки до діаметру осьового ципінь демієлінізації аксонів не співпадає з клінічним ліндра). На електронно-мікроскопічному рівні у ступенем тяжкості ЕАЕ, показуючи більш об'єктивзразках тканини спинного мозку здорової тварини но ступінь руйнування мієлінової оболонки аксонів мієлінова оболонка характеризується щільним під дією антигенспеціфічних чинників. приляганням ламел без порушень упорядкованосЩур №2 (клінічна ступінь тяжкості ЕАЕ 3 бали, ті та без міжламелярного та периаксонального 21 доба, лікування трансплантацією клітин фетанабряку (співвідношення діаметру мієлінової обольної нервової тканини) вміст кортизолрезистентлонки до діаметру осьового циліндра 0,15-0,35). них мононуклеарів - 60%. Розрахунок: Клінічна маніфестація патологічних змін у мієліні60 0,0064=0,384. зованих аксонах виявляється як ушкодження мієВеличина того ж показника, отримана за долінової оболонки. Описово ці ушкодження можна помогою електронно-мікроскопічного дослідження характеризувати наступними ступенями: та морфометрії, становить 0,381. Демієлінізацію 1 ступінь - незначне розволокнення ламел на аксонів згідно таблиці 1 оцінюємо як демієлізацію тлі локального помірного міжламелярного набряку 1-го ступеня. Отже, і в цьому випадку ступінь демі(співвідношення діаметру мієлінової оболонки до єлінізації аксонів не співпадає з клінічним ступедіаметру осьового циліндра 0,36-0,45). нем тяжкості ЕАЕ. Клінічний ступінь тяжкості біль2 ступінь - розволокнення і порушення упоряд 7 17499 8 шою мірою відображає супутні явища ЕАЕ, такі як морфометрії. біль, артрит і набряк, тоді як запропонований споСписок літератури сіб об'єктивно показує саме ступінь руйнування 1. Цимбалюк B.I., Маркова О.В., Лісяний M.I., мієлінової оболонки аксонів під дією антигенспеПічкур Л.Д., Носов А.Т., Семенова В.М., Васлович цифічних чинників. В.В., Касяненко Ю.А., Вотякова І.А., Василовская Щур №3 (клінічний ступінь тяжкості ЕАЕ 3,5 С.В. Показники імунного статусу та ознаки ремієлібали, 21 доба, лікування трансплантацією клітин нізації нервів у щурів з експериментальним алергіфетальної нервової тканини) вміст кортизолрезисчним енцефаломієлітом при трансплантації ембрітентних мононуклеарів - 78%. Розрахунок: ональної нервової тканини //Трансплантологія 2005.- том 8.- №1.- с.72-78. 78 0,0064=0,499. 2. Вершигора А.В. Основы иммунологии. Величина того ж показника, отриманого за до//Киев.- «Вища школа».- 1980.-504с. помогою електронно-мікроскопічного дослідження 3. Лісяний M.I., Любич Л.Д., Маркова О.В., та морфометрії, складає 0,502. Демієлінізацію акБєльська Л.М. Дослідження гуморальних аутоімусонів згідно таблиці 1 оцінюємо як демієлізацію 2нних реакцій до нейроспецифічних білків у разі го ступеня. В цьому випадку визначений досить експериментального алергічного енцефаломієліту високий ступінь демієлінізації аксонів співпадає з на етапах патогенезу та імуно-корекції алогенною клінічним ступенем тяжкості ЕАЕ (параліч задніх нервовою тканиною //Фізіол. Журн.- 2002.-Т.48, кінцівок, параліч хвоста, порушення функції тазо№1. C.15-24. вих органів за типом нетримання). 4. Позур В.К. Імуногенетика. Практикум. -Київ. Таким чином, запропоновано спосіб оцінки -2000.- 264с. демієлінізації аксонів при ЕАЕ у щурів після ліку5. Hanson L.A., Soderstrom R., Friman V., Hahnвання клітинами фетальної нервової тканини, який Zoric M., Czerkinsky C., Quiding M., et al. Update on дозволяє по імунологічному показнику кількісно Iga and IgG subclass deficiency //Progress in Immune охарактеризувати ступінь демієлінізації аксонів. Deficiency III Edited by H.M. Chapel, R.J. Levinsky, Цей спосіб у порівнянні з прототипом є більш проA.D.B. Webster, London-New York. -1991. -338p. стим і доступним у виконанні для дослідників, 6. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и менш ресурсоємний, більш адекватно і об'єктивно аллергология. //МИА, Москва, -2003.- 603с. характеризує ступінь демієлінізації аксонів, що підтверджено даними електронної мікроскопії та Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601