Спосіб біохімічної ідентифікації збудників карантинних хвороб рослин – бурої бактеріальної гнилі картоплі ralstonia solanacearum (smith), бактеріального опіку плодових erwinia amulovora (burrill) winslow et al.

Спосіб біохімічної ідентифікації збудників карантинних хвороб рослин - бурої бактеріальної 3 19184 4 рвалі pН 3,5-10. Таким чином патогени ідентифіпредметне скельце; для того, щоб спори вийшли з куються за їх білковим спектром. Результати, що пікнід, потрібно декілька разів злегка натиснути досягаються внаслідок цього, є більш точним, ніж препарувальною голкою на покривне скельце, при проведенні інших способів та способівспостерігаючи емісію стилоспор у вигляді прототипу. шлейфу. 1. Запропонований спосіб дозволяє визначити Для кращого візуального виявлення пікноспор збудників бурої бактеріальної гнилі картоплі, бакгриба застосовували метод прижиттєвого забарвтеріального опіку плодових та фомопсису соняшлення патогена з використанням 2,5н розчину йонику за значно коротший термін часу (3 доби). ду в калії йодистому, - одного з класичних барвни2. Для його проведення застосовуються споків, що використовуються в гістологічній практиці луки, які не є коштовними. для різноманітних тестів. Він забарвлює амілоїд, 3. Даний спосіб не вимагає високо специфічцелюлозу, хітин, крохмаль, каротин, сахариди, ного обладнання. глікоген; його використовують як окислюючий 4. Суттєвою відмінністю нового способу є те, агент та усунення артефактів, що виникають при що ізоелектрофокусуванням білків збудників хвофіксації тканин деякими солями, тощо. роб вдається точніше і швидше визначити видову Йод забарвлює пікноспори в інтенсивний коприналежність виділених ізолятів. ричневий колір впродовж 5-10 секунд, надлишок Отже, спосіб, що заявляється, відповідає крирідини з-під покривного скельця видаляють смужтерію корисної моделі "новизна" та "суттєві відкою фільтрувального паперу, препарат проглядаміни". ють під мікроскопом (рис.3, додаток 3). Приклад 1 Приклад 4 Серед виділених ізолятів-збудників бактеріаДля біохімічної ідентифікації даних карантинльних хвороб картоплі виявляли такі, що за морних об'єктів з зразків виділяли білки шляхом розфологічними ознаками (ріст на селективних серетирання на холоді у фарфоровій ступці, центрифудовищах (наприклад, середовище Кельмана), гували протягом 10 хвилин при 8000об./хв. [7, 8]. колонії гладкі, світлі, опалесцентні, маслянистої При цьому білки виділяються в супернатант, а суконсистенції, які з часом набувають коричневого міші випадають в осад, який видаляють. Суперназабарвлення) відповідали збуднику бурої бактерітант використовували для ізоелектрофокусування альної гнилі картоплі - Ralstonia solanacearum [1,2]. білків у поліакриламідному гелі (Т-5%, С-3%) з Приклад 2 амфолітом діапазону рН3,5-10 [7]. Білкові спектри Для лабораторного дослідження збудника баквиявляли за допомогою барвника Кумассі блю Gтеріального опіку плодових Erwinia amylovora від250. Для цього спочатку відмивали амфоліти субирають зразки рослинного матеріалу з явними мішшю: трихлороцтова кислота: етанол: вода проявами хвороби, з яких за загальноприйнятою (10:25:65) і забарвлювали 0,05% Кумассі блю Gметодикою виділяють бактеріальні культури. З 250 в суміші: трихлороцтова кислота: етанол: вода виділеними ізолятами проводять такі досліди: (10:25:65). Відмивку від надлишку барвника провивчення морфології колоній на картопляному водили цією ж сумішшю. Білкові компоненти розагарі та спеціальних поживних середовищах (сераховували за допомогою комп'ютерної програми, редовище Кінга В, середовище Кадо і Гаскет, серозробленої Російським Інститутом фітопатології і редовище Кросса і Гудмана) [3]; вдосконаленої на УкрНДСКР. визначення патогенності бактерій на тестВ результаті проведених досліджень білковий рослинах (реакція надчутливості на листках тютюспектр збудника бурої бактеріальної гнилі картоплі ну, тест Уайта на недостиглих плодах груші) [2]; - Ralstonia solanacearum (Smith.) складається з 28 мікроскопічне дослідження препаратів бактебілкових компонентів (рис.4, додаток 4). Білковий рій, фарбованих за Грамом та з фарбуванням спектр кільцевої гнилі картоплі (збудник Clavibacter джгутиків [1,4]; michiganensis subsp. sepedonicus) складається з дослідження обміну речовин та продуктів жит37 білкових компонентів (рис.5, додаток 5). У витєдіяльності бактерій (реакція Фогес-Проскауера, падку збудника бурої бактеріальної гнилі картоплі визначення сірководню, аміаку та індолу, вивчення спостерігається збільшення кількості білкових сахаролітичних та редукуючих властивостей баккомпонентів у інтервалі рН 4-6 в порівнянні з кільтерій та ін.). Висновок про видову приналежність цевою гниллю картоплі. У кислих білків (рН 3,5-6,0) бактерій робиться на основі величина екстинкції досягає 0,85-1,0 у збудникаузагальнення одержаних даних та порівняння бурої гнилі, у збудника кільцевої гнилі - 0,35-1,0. з властивостями типових Для збудника бурої бактеріальної гнилі картоплі штамів (рис.2, додаток 2). характерні лужні білкові компоненти з інтервалом Приклад 3 рН 8,8-9,7, які відсутні в білковому спектрі збудниВиділення збудника фомопсису соняшнику ка кільцевої гнилі. Phomopsis helianthi проводять за допомогою тонДля збудника кільцевої гнилі картоплі характеких зрізів некротизованої тканини в місцях найбірні нейтральні білкові компоненти, розташовані в льшого скупчення пікнід [5, 6]. Зрізи готують бритінтервалі рН 6,4-6,7, які відсутні у Ralstonia вою чи скальпелем і препарувальною голкою solanacearum. Тобто, ці компоненти є маркерами переносять на предметне скельце у краплю дисдля даних хвороб картоплі. тильованої води, тонкою піпеткою вводять краплю Білковий спектр збудника бактеріального опіку барвника і накривають покривним скельцем. Доплодових Erwinia amylovora представлений 37 зрілі пікніди теж можна легко відділити від рослинкомпонентами, (рис.6, додаток 6). Величина ексної тканини і, аналогічним чином перенести на 5 19184 6 тинкції досягає 0,655. Кількість кислих білкових рофокусуванні білків зразків даних хвороб сільськомпонентів складає когосподарських рослин. II. Для кислих білків (рН 3,5-6) величина екстиДжерела інформації: нкції досягає Е=0,655, кількість білка складає 1. Руководство для изучения бактериальных 4,8144%. Для нейтральних білків (рН 6-7,5) кільболезней растений. / Под ред. Израильского В.П. кість компонентів досягає 10. Величина екстинкції М.: Колос, 1968. - С.252-310 досягає 0,59, кількість білка - 4,8442%. Для лужних 2. Кирай 3., Клемент 3., Шоймоши Ф., Верещ білків (рН 7,5-10) кількість компонентів - 16, велиИ. Методы фитопатологии - М.: Колос, 1974. чина екстинкції Е=0,573, кількість білка - 9,125%. С.97-111 Білковий спектр збудника фомопсису соняш3. Виявлення, діагностика та локалізація бакнику Phomopsis helianthi представлений 39 компотеріального опіку плодових Erwinia amylovora. нентами, (рис.7, додаток 7). Екстинкція досягає Тимчасові методичні вказівки / Садляк A.M. та ін. Е=0,900. Кількість кислих білкових компонентів (рН К., 2000. - 11с. 3,5-6) складає 14. Величина екстинкції для кислих 4. Бельтюкова К.И., Матышевская М.С., Кулибілків (рН 3,5-6) 0,900. Кількість білка складає ковская М.Д., Сидоренко С.С. Методы исследова9,3538%. Нейтральні білки представлені 14 білкония возбудителей бактериальных болезней расвими фракціями. Для них характерна величина тений - К.: Наукова думка, 1968. - С.164-172 екстинкції Е=0,450 і кількість білка - 4,23%. Лужні 5. Якуткин В.И., Якуткина Т.А., Симон А.Н. білки (рН 7,5-10) представлені 15 компонентами, Идентификация возбудителя фомопсиса подсолмаксимальне значення екстинкції досягає Е=0,320, нечника и методы его учета (методические рекокількість білка складає 2,4328%. мендации) - Санкт-Петербург, 1991. - 19с. Таким чином, для кожного збудника карантин6. Деревенко О.С., Андрійчук Т.О. Виявлення них хвороб даним методом був отриманий свій збудника фомопсису в агроценозах та вантажах. специфічний білковий спектр. Чернівці, 2000. - 12с. Запропонований біохімічний спосіб ідентифі7. Ригетти Т. Изоэлектрическое фокусировакації збудників карантинних хвороб бурої бактеріние. Теория, методы, применение. - М.: Мир, 1986. альної гнилі картоплі Ralstonia solanacearum - 360с. (Smith), бактеріального опіку плодових Erwinia 8. Троицкий И.Г. Изоэлектрическое фокусироamylovora (Burrill) Winslowet al, фомопсису соняшвание белков в самоорганизующихся и искусстнику Phomopsis helianthi підтверджує експерименвенных рН градиентах. - К.: Наукова думка, 1984. тальна перевірка, яка здійснювалась при ізоелект280с. 7 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 19184 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601