Спосіб визначення аніонів хлору в слині та шлунковому соку

1. Спосіб визначення аніонів хлору в слині і шлунковому соку, що включає підготовку проби, її дослідження і оцінку результатів, який відрізняється тим, що пробу слини, шлункового соку центрифугують, фільтрують, фільтрат з'єднують з буферним розчином, а потім досліджувану рідину вводять в капіляр аппарата, на вхід якого подають високу напругу негативної полярності, проводять електрофоретичне виділення аніонів, виявлені аніони надходять на фотометричний детектор, їх реєструють на електрофореграмі у певній послідовності у вигляді піків над ізолінією, кількість ви U 2 (19) 1 3 взаємодіють з вугільною кислотою з формуванням карбонату натрію та соляної кислоти. Дослідження складу слини та шлункового соку, які мають важливе значення для функціонування органів травлення та всього організму, важливо як для оцінки функції органів, встановлення їх захворювань, так і розуміння механізмів їх розвитку. Дослідження шлункового соку практикуються широко, але зводяться в основному до визначення соляної кислоти та ферментів і рідко до визначення іонного складу. Слина у клінічних умовах досліджується недостатньо, її використовують в основному з науковою метою. Оскільки знання складу слини та шлункового соку має важливе значення для встановлення функцій органів, особливої актуальності набуває розробка методів дослідження їх складу. Способи визначення аніонів хлору відомі. Відомі способи визначення хлоридів ґрунтуються на дуже низької розчинності у воді хлориду срібла та ртуті. При їх використанні хлориди визначають титруванням нітратом ртуті в присутності халату, який змінює колір при комплексуванні з іонами Hg. Кінцеву точку визначають візуально за появленням блідо-блакитного кольору, притаманного для комплексу ртуті з діфенілкарбазоном [2]. Основний недолік цих методів - суб'єктивне визначення кінця титрування, оскільки інтенсивність забарвлення варіює в присутності білку і залежить від вмісту в пробі білірубіну, гемоглобіну і ліпідів. Відтворюваність методів обмежена здатністю дослідника оцінити забарвлення і точно визначити об'єм рідини, яка пішла на титрування. Спектрофотометричний метод заснований на заміщенні іоном СІ іону хлоранілату в солі ртуті. Колір, який утворюється вільним хлоранілатом, дозволяє колориметричне визначити концентрацію хлоридів. Найчастіше в практиці клініко-діаностичних лабораторій для визначення хлоридів використовують метод кількісного заміщення тіоцианату хлоридом у солях ртуті з послідуючим утворенням червоного комплексу тіоцианату заліза, вміст якого вимірюють калориметричне при довжині хвилі 525нм. Чутливість і лінійність методу можуть бути збільшені додаванням надлишків нітрату ртуті. Хлориди спочатку взаємодіють з вільними іонами Hg, утворюючи безбарвне з'єднання хлориду ртуті, а потім відбувається заміщення тіоцианатом іона хлорида з утворенням хромогену. Такий підхід не дозволяє визначати вміст хлоридів нижче за 80ммоль/л, Але значно підвищує чутливість у діагностичне значущому діапазоні 80-125ммоль/л. Реакція з тіоцианатом заліза чутлива до температури; для отримання точних результатів необхідно проводити термостатування, інакше реакція погано відтворюється навіть в умовах автоматизації [3]. Відомий спосіб, при якому для визначення хлоридів використовується амперометричне титрування [2], в ході якого іони Ag, які утворюються срібним електродом, реагують з хлоридами з утворенням нерозчинного хлориду срібла. Кінцеву точку визначають амперометрично за допомогою другої пари електродів, які специфічно вимірюють вільні іони Ag, які вивільнюються срібним електро 19721 4 дом, коли всі іони Сl зв'язані. Цей метод запропонований як референсний для визначення хлоридів. Практично вимірюють час, необхідний для титрування стандартного розчину хлоридів або зразку при постійному струмі. Концентрацію проби визначають за відношенням концентрац ія стандарту хлоридів час тритування стандарту концентрац ія зразку час тритування зразку Методологічно титрування обмежено швидкістю перенесення іонів Ag від електроду в розчин. Час, необхідний для визначення кінцевої точки, коли всі іони Сl зв'язані, залежить від інтенсивності перемішування розчину і швидкості утворення іонів Ag. При дуже високій концентрації хлоридів (400ммоль/л) об'єм утвореного преципітату впливає на перенесення іонів і утруднює визначення. Брудні електроди призводять до низької відтворюваності результатів; їх рекомендовано чистити хлоридом амонію в розчиненій азотній кислоті післякожного титрування. В останні роки в клініко-лабораторній практиці все ширше застосовуються методи іонометричного визначення аніонів хлору [4], які складаються з вимірювання електрохімічного потенціалу іоноселективного електроду, зануреного у досліджуваний розчин. Електрична схема потенціометра вбирає в себе електрод порівняння (потенціал якого відомий) та індикаторний (іоноселективний) електрод, потенціал якого вимірюється. Значення потенціалу індикаторного електроду дозволяють судити про активність присутніх у розчині іонів. Іоноселективні аналізатори - малогабаритні, настільного розташування прилади, які дозволяють встановлювати рівень вільних, не зв'язаних з. білком, а, отже, функціонально активних іонів. До кількості найвідоміших аналізаторів такого типу - іономерів відноситься аналізатор іонного складу біологічних рідин родини "Easylite" фірми "Медика" та ін. Цей спосіб прийнятий за найближчий аналог. Застосування цього способу обмежено складністю придбання імпортної апаратури, яка дорого коштує. В основу рішення, що заявляється, поставлена задача розробити спосіб визначення аніонів хлору в слині та шлунковому соку, який забезпечував би простоту і точність визначення за допомогою доступних приладів. Поставлена задача досягається тим, що в способі визначення вмісту аніонів хлору в біологічних рідинах шляхом капілярного електрофорезу, при якому розділення і міграція елементів біологічної рідини відбувається під впливом електричного поля, а реєстрація результатів дослідження відбувається на електрофореграмі. Спосіб визначення аніонів хлору в слині, шлунковому соку, що заявляється, здійснюють шляхом капілярного електрофорезу за допомогою прибору типу "Капель 103Р", що випускає фірма "Люмекс" м.Санкт-Петербург. Спосіб вбирає низку послідовних етапів: відбір і підготовка проби досліджуваної рідини, підготовку прибору, введення досліджуваної рідини в капіляр, розділення компонентів проби, виявлення та реєстрацію процесу на електрофореграмі, обробку результатів дослідження. 5 Забір слини або шлункового соку для дослідження здійснюють відомими заходами. Пробу досліджуваної рідини в об'ємі 5мл розміщують в пробірку Епендорфа, центрифугують протягом 5 хвилин зі швидкістю 6000обертів/хв, а потім фільтрують через целюлозно-ацетатний фільтр. Капіляр прибору перед дослідженням промивають протягом 5 хвилин розчинами: хлороводневої кислоти, дистильованої води, розчином натрію гідроксиду, робочим буферним розчином. Для ідентифікації аніонів використовують буферні розчини: перший складається із суміші оксиду хрому (VІ), діетаноламіну, дистильованої води, цетилтриметиламонію броміду, взятих у співвідношенні 2,0:4,0:2,0:2,0(см3) відповідно; другий отримують розбавленням першого буферного розчину водою дистильованою у співвідношенні 1:10. Між вимірюваннями капіляр промивають по 5 хвилин дистильованою водою і буферним розчином. Перед вимірюванням в пробірку за допомогою дозатора вносять 300мкл досліджуваної рідини і 300мкл хроматного буферного розчину (2), їх перемішують. Пробірку з цими розчинами встановлюють на вході капіляру, другу пробірку з буферним розчином (1) встановлюють на виході капіляру. Перемикач приладу встановлюють в режим "Введення проби". Введення проби виконують під тиском 30мБар, протягом 10с (при ефективній довжині капіляра - 50см). По закінченню введення проби перемикач приладу встановлюють в режимі "Аналіз". До вхідного кінця капіляру підводять пробірку з буферним розчином (1) і джерело електричного струму напругою 17кВ негативної полярності та проводять аналіз протягом 10 хвилин. Розділення компонентів суміші рідини відбувається за рахунок розходження швидкостей їх міграції в капілярі, що знаходяться під впливом електричного поля. Компоненти, що розділяються, виходять з різними швидкостями і фіксуються автоматично за допомогою фотометричного детектора на довжині хвилі 254нм на електрофореграмі, яка уявляє собою набір добре виражених позитивних піків, що піднімаються над базовою лінією. Отримані аналітичні сигнали у вигляді позитивних піків на електрофореграмі використовують для ідентифікації та кількісного визначення. Ідентифікацію проводять шляхом порівняння отриманих та табличних даних. Концентрацію аніона в пробі визначають за величиною площини піків цього аніона і калібрувальної кривої. Після завершення аналізу прибор переводять у режим "Промивання капіляру". Виконання способу, що заявляється, ілюструється конкретним прикладом. Приклад 1 Хворий К., 52 роки. Надійшов до клініки для обстеження і лікування з приводу скарг на біль в верхній половині живота, яка посилюється через 1-1,5 години після їжі, іноді нічний біль, періодичну 19721 6 нудоту. При фібродуоденоскопії виявлена виразка з локалізацією у дванадцятипалій кишці. 07.06.06 проведено забір слини і шлункового соку відомими заходами. Отримано 45мл слини і 60мл шлункового соку. Із загальної кількості отриманих секретів у сухі пробірки типу Епендорфа додали по 5мл. Рідину центрифугували протягом 5хв при швидкості 6000об/хв. Надосадову рідину фільтрували через целюлозно-ацетатний фільтр. Капіляр прибору "Капель 103Р" промили розчинами, вказаними вище. Перед вимірюванням в окремі пробірки помістили дозатором по 300мкл слини та шлункового соку, додали по 300мл хроматного буферу (2), рідини перемішали. Пробірку з досліджуваним секретом встановили на вході капіляра, на виході капіляра встановили пробірку з буферним розчином (1). Перемикач приладу встановили в режим "Введення проби" і зробили заповнення капіляра під тиском 30мБар протягом 10с. По закінченні введення досліджуваного секрету на вхід капіляру підвели пробірку з буферним розчином (1), прилад перевели у режим "Аналіз". До входу капіляра подають напругу 17кВ негативної полярності та проводять аналіз протягом 10 хвилин. Процес виділення іона хлору відображається на фотометричному детекторі, а потім реєструється у вигляді піка на електрофореграмі. Див. Фіг.1 "Електрофореграма слини", Фіг.2 "Електрофореграма шлункового соку". Визначили площину піка аніона хлору в слині і шлунковому соку. Встановлено, що кількість хлору в слині складає 0,59г/дм3, в шлун3 ковому соку - 5,05г/дм . Спосіб визначення аніонів хлору в слині і щлунковому соку, що заявляється, використаний в умовах лабораторії ДП "Дніпростандартметрологія". Всього виконано 30 аналізів дослідження слини та 30 аналізів дослідження шлунковому соку, отриманих у людей з захворюваннями органів травлення і здорових осіб. Спосіб, що заявляється, може виконуватися в умовах звичайної лабораторії або іншого приміщення при кімнатній температурі, звичайному атмосферному тиску і вологості. Спосіб забезпечує високу точність дослідження, високу чутливість розпізнання компонентів, швидкість визначення, для якого необхідна мала кількість проби. Спосіб збирання слини та шлункового соку простий, доступний не обтяжливий і безпечний для людини. Перелік використаних джерел. 1. Руководство по клинической лабораторной диагностике / Под ред. М.А. Базариновой и В.Т. Морозовой. - Т.3. - С.225-227. 2. Титов В.Н., Творогова М.Г. Хлориды плазмы крови // Клинич. лабор. диагностика. - 1996. - №3. С.7-10. 3. De Yong E., Goldshidt Н. // din. Chem. - 1980. - Vol.26. - P.1233-1234. 4. Калашников В.С. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика. Справочник. - 2003. С.268-269. 7 Комп’ютерна верстка А. Рябко 19721 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601