Штам s-віруса картоплі для одержання діагностичних сироваток

Изобретение относится к фитовирусологии, в частности к иммунодиагностике ви русных заболеваний картофеля. Цель изобретения - получение штамма S-вируса картофеля, обладающего высокой антигенной активностью, обеспечивающего получение диагностических сывороток с высоким титром антител и отличающихся высокой специфичностью и активностью, Для этого выделяют из растений сорта Воротынский ранний штамм S-вируса картофеля с последующим получением чистых линий при заражении растений томата сорта Невский и чилийских томатов высокими разведениями сока листьев пораженных растений картофеля. Штамм депонирован в ВИЗР под № 15. Он способен накапливаться в инфицированных растениях в высокой концентрации. Штамм обеспечивает получение нв кроликах специфической сыворотки к S-вирусу картофеля с титром 1:4096-1:8192. С сл Изобретение относится к области фитовирусологии, в частности к иммунодиагностике вирусных заболеваний картофеля. Целью изобретения является получение штамма S-вируса картофеля, обладающего высокой антигенной активностью, обеспечивающего получение диагностических сывороток с высоким титром антител и отличающихся высокой специфичностью и активностью. Штамм депонирован во Всесоюзном институте защиты растений Госагропрома СССР под номером 15. Штамм назван S-4. Морфологические и физические свойства. Штамм S-вируса картофеля S-4 ВИЗР f\fe 15 имеет нитевидные частицы размером 260-10x12-13 нм, Температурная точка инактивации вируса - 60°С, точка предельного разведения сока - -10"2 -10"3, длительность сохранения инфекционности в соке при20-22°СЗ-4дня. В клетках инфицированных растений картофеля и томатов вирус локализуется в виде диффузно рассеянных частиц и в виде скоплений различной формы, отмечена тесная связь вирусных частиц с хлоропластами. На растениях картофеля различных сортов штамм S-вируса картофеля S-4 вызывает слабое изгибание черешков листьев книзу по главной жилке. На растениях томата (dycoperslcon csculentum MILL) штамм не вызывает симптомов, накапливаясь в высокой концентра о ON 01 1571065 ции , Томаты сорта Невский используют в концентрации в листьях среднего яруса качестве накопителя вируса через 3-4 мед. после инокуляции. Штамм не Штамм вызывает системно оголяющий оказывает угнетающего действия на растенекроз на растениях мари стенной ния томат а, что позволяет получить большое (Chenopodium murale L) и мари Киноа (С. 5 количество зеленой массы при высокой конdutnoa Wild), характерное закручивание лицентрации вируса. стьев чилийских томатов (Lycopersicon П р и м е р 1. Использование штамма S-4 chilense Dun,) 'снизу по главной жилке, проВИЗР № 15 для сыворотки к S-вирусу картосветление жилок, сопровождающееся появфеля, лением некротических черных пятен на 10 Листья томатов, инфицированных листьях паслена полегающего (Solarium штаммом S-4, собирают, охлаждают в холоdemissum Lindl.). дильнике, измельчают на мясорубке, вирус Лучшими растениями-индикаторами экстрагируют в рабочем буферном раствоштамма S-вируса картофеля S-4, наиболее ре, обладающем стабилизирующими свойстабильно проявляющими в ответ на зара- 15 ствами (0,05 М натрий лимоннокислый жение выраженную системную реакцию, явтрехзамещенный, 0,007 М трилон Б. 0,2% ляются чилийские томаты и марьстенная. сульфита натрия). Инфекционный сок осветШтамм S-вируса картофеля S-4 ВИЗР № ляют путем кратковременного (5-6 мин) 15 легко передается способом механичеэмульгирования с охлажденным хлорофорской инокуляции. Для приготовления иноку- 20 мом и низкоскоростного центрифугироваляции листья пораженных растений ния а течение 20 мин при 3500 об/мин. растирают в фарфоровой ступке с добавлеДальнейшую очистку вируса проводят пунием 0,1 М фосфатного или цитратного бутем гель-фильтрации на хроматографичеферного раствора рН 7,4 в пропорции 11 ских колонках, заполненных гелями на 1:10. Полученную вируссодержэщую сус- 25 декстрановой основе (молселекты Г-50 и пензию наносят на листья заражаемого расДЭАЭ-50). Концентрируют вирус 3,1 % лолитения с помощью паролонового тампона этиленгликолем (ПЭГ 15000) в присутствии после предварительного опудривания их 0,25 М хлористого нэтрия. После выдержимелкозернистым карборундом. вания вирусного антигена в холодильнике 1 Эффективность передачи на томаты 30 ч проводят центрифугирование в течение 20 сорта Невский 100%. мин при 4000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 0,1 исходного объема физиологичеПередача штамма с пораженных растеским раствором. На всех этапах очистки ний картофеля на растения чилийских томаналичие вируса контролируют серологичетов персиковой тлей (Mysodes percicae Suls.) 14,1 - 27%, крушинниковой тлей 35 ским методом. Иммунизацию проводят по схеме: 2 (Aphisnasturtii Kalt.) 11,1%. При осуществлевнутримышечных инъекции по 2,5 мл с иннии передачи тлями насекомых, собранных тервалом 1 нед и 4 внутривенные инъекции со здоровых растений, подсаживают на пос интервалом 1 день по 1, З, З, З мл антигена. раженные растения картофеля на 24 ч, затем переносят на молодые растения 40 Кровь отбирают на 7-й, 9-й и 11-й день после чилийских томатов, выращиваемые под изопоследнего введения антигена. ляторами, которые через 24 - 48 ч, обрабаПолучают сыворотку крови по общепритывают инсектицидом. нятой методике. Штамм поддерживают в клубнях картоПосле получения сыворотки определяфеля сорта Приекульский ранний. Зимой 45 ют ее титр и специфичность отдельно по растения картофеля выращивают в теплице, кроликам с гомологичными и гетерологичобеспечивая изолированные условия. ными (X, М, Y, F) вирусами картофеля, а Для поддержания штамма используют также с растительным соком, полученным также заражение растений чилийских томатов и последующее ускорение из боковых 50 из здоровых растений картофеля и томатов. Для определения серологического родства побегов. готовят разведения моноштаммовых сывоВ течение 3 мес. штамм можно сохрароток от 1:2 до 1:4096 и ставят реакции с нять в лиофилизированном соке листьев поантигенами исследуемых штаммов. После раженных растений картофеля. 55 определения титра делают рабочее развеШтамм в растениях томата сорта Недение сывороток. Приготовленные таким вский накапливается в высокой концентраобразом сыворотки испытывают для выявции: значение титра вируса 1:64- 1:128, что ления S-вируса картофеля в штаммовых расв 2-4 раза выше по сравнению с контролем тениях и растениях картофеля различных (производственным штаммом). 8 растениях сортов. томата вирус накапливается в максималь 1571065 6 Проводят серологический анализ проб Полученные сыворотки имеют следуюлистьев, собранных на посадках картофеля щий титр: к штамму S-4- 1 8191, к производ7 сортов Невский, Гатчинский. Мавка, Зарественному штамму - 1:1024 во, Приекульский рамний, Луговский. ПоАнтисыворотки, полученные к штамму 5 раженность материала, поданным серолоS-4 и к производственному штамму, при гического анализа, составляет: при испольразведении 1:4 не реагируют с соком здорозовании сыворотки, приготовленной к вых растений картофеля и томатов, а также производственному штамму S-вируса карс гетерологичными вирусами картофеля, т.е. тофеля 20,0% сыворотки, приготовленной к являются высоко специфичными. 10 штамму S-4- 28,0%. П р и м е р 3. В производственных услоТаким образом, использование в качевиях по схеме, описанной в примере 1, простве антигена штамма S-4 ВИЗР № 15 поводят получение антигена, иммунизацию зволило получить антисыворотку к S-вирусу кроликов, получение диагностической сывокартофеля, отличающуюся более высоким титром по сравнению с приготовленной к 15 ротки. С использованием штамма S-4 ВИЗР N? 15 можно приготовить серии высокоспепроизводственному штамму S-вируса карцифичной диагностической сыворотки к Sтофеля. вирусу картофеля с титром 1:4096- 1:8192. П р и м е р 2. Исследуют выявляемость S-вируса картофеля сыворотками, полученФормула изобретения ными к штамму S-4 и производственному 20 Штамм S-вируса картофеля ВИЗР № 15 штамму S-вируса картофеля. для получения диагностических сывороток. Редактор О.Спесивых Составитель С.Светлышев Техред М.Моргентал Корректор Н.Ревская Заказ 1487 Тираж 482 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101