Спосіб визначення глікозування імуноглобулінів

Спосіб визначення глікозування імуноглобулінів, який включає проведення адсорбції імуноглобулінів в імуноферментному планшеті, подальшу промивку планшета фосфатним буфером, що міс 3 26221 лених продуктів реакції вимірюють за допомогою мікрофотоколориметру. Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення глікозування імуноглобулінів, який включає проведення адсорбції імуноглобулінів в імуноферментному планшеті, подальшу промивку планшета фосфатним буфером, що містить твін і бичачий сироватковий альбумін, з подальшим додаванням в лунки розчину лектинів рослин і внесенням субстрату, згідно корисної моделі, адсорбцію імуноглобулінів проводять при температурі 37°С протягом однієї години, промивку лунок планшета проводять 200мкл фосфатного буфера, що містить 3,75мг/мл бичачого сироваткового альбуміну в 0,025% твіну 20, причому в лунки додають 100мкл лектину, кон'югованого пероксидазою. Між сукупністю основних ознак способу, який пропонується, і технічним результатом, який може бути досягнутий, виявляється наступний причинно-наслідковий зв'язок: проведення адсорбції імуноглобулінів в кількості 200мкл при температурі 37°С протягом однієї години дозволяє значно скоротити час аналізу, посадочна концентрація імуноглобуліну G в концентрації 1мкг/мл виявляється найбільш оптимальною для виявлення вірогідної різниці в ступені глікозування контрольних і патологічних IgG; здійснення промивки лунок планшета проводять 200мкл фосфатного буфера, що містить 3,75мг/мл бичачого сироваткового альбуміну в 0,025% твіну 20, що дозволяє досягти високого ступеня гідрофобної взаємодії реагентів з поверхнею твердої фази і забезпечує повне перекриття всіх вільних валентностей лунки, про що свідчать низькі значення екстинкції в контрольних лунках; подальше додавання в лунки лектину, кон'югованого пероксидазою, в об'ємі 100мкл дозволяє значно збільшити чутливість лектиноферментного аналізу, оскільки виключає можливу сорбцію молекул лектину на незайняті імуноглобуліном ділянки лунок. Спосіб полягає в наступному. У лунки імуноферментного планшета вносять розчин досліджуваного імуноглобуліну G в концентрації 1мкг/мл в 0,05 М Na-бікарбонатному буфері, рН 9,2 по 100мкл в лунку. У контрольні лунки вносять 100мкл того ж буферного розчину. Тривалість інкубації імуноглобулінів при температурі 37°С складає одну годину. Після ретельної промивки водою проводять триразову, по 10 хвилин кожного разу, промивку лунок планшета 200мкл розчину, що містить 3,75мг/мл бичачого сироваткового альбуміну BSA, Serva, Німеччина в 4 PBST PBS, що містить 0,025% твіну 20 - Serva, Німеччина: BSA + PBST. Таким чином, лунки промивають від імуноглобулінів, що не зв'язалися, і одночасно проводять блокування вільних валентностей планшета. На наступному етапі вносять по 50мкл розчину лектину гороху, кон'югованого з пероксидазою хріну - Лектінотест, Україна, в підібраному робочому розведенні в 0,003 М фосфатному буфері з 0,14 М NaCl і 0,003 М КСl, рН 7,4. Інкубацію лектину проводять протягом 1 години при температурі 37°С. Після стандартної промивки BSA + PBST в лунки вносять по 100мкл субстратної суміші: 0,2мМ ABTS (2,2'-азино-ди-[3етил-бензтиазолинсульфонат (6)]) в 0,05 М Naцитратному буферному розчині, рН 4,0, що містить 0,01% перекис водню. Результат враховують на спектрофотометрі Multiskan (Titertek, Фінляндія) при довжині хвилі 405нм. При цьому розглядають тільки дані тих рядів, в яких контрольні лунки демонстрували мінімальну оптичну щільність - від 0,03 до 0,085. Відомості, які підтверджують можливість використання способу. За допомогою запропонованого способу на прикладі лектину гороху було досліджено манозілування парапротеїнів класу G. Аналіз легких ланцюгів парапротеїнів в групі хворих з IgGмієломою показав, що 17 хворих цей патологічний імуноглобулін відносився до класу IgG-k, а у 12-ти - IgG-l. На фіг. 1 показані результати аналізу взаємодії досліджуваних парапротеїнів IgG з лектином гороху. Частина парапротеїнів - сірі стовпчики - демонструють вищу в порівнянні з контролем - білий стовпчик - екстинкцію цієї взаємодії, інша частина парапротеїнів - нижчу. На фіг. 2 показані результати взаємодії з лектином гороху сироваткового поліклонального IgG хворих з Ig A-мієломою. У таблиці 1 і таблиці 2 представленi дані лектиноферментного аналізу: взаємодія лектину гороха з IgG здорових людей - усереднене значення прийнято за 100% та IgG хворих на множинну мієлому. У таблиці 3 представлена статистична вірогідність одержаних даних - взаємодія різних лектинів з парапротеїнами в лектиноферментому аналізі: ↑ і ↓ - підвищення та зниження екстинкції порівняно з контролем. Виявлено в більшості випадків вірогідне в порівнянні з контрольною групою зниження екстинкції подібної взаємодії. Таблиця 1 IgG здорових людей Раз 100% Гол Злы Тих 134±7,4%* Примітка: * -р