Енантіоселективний спосіб отримання s-енантіомеру оптично активного ціангідрину

1. Энантиоселективный способ получения S-энантиомера оптически активного циангидрина взаимодействием соответствующего альдегида или метилкетона с донором цианогруппы общей формулы R 1 R 2 C(OH)(CN), где R1t R 2 - алкильный остаток, в присутствии фермента с выделением образовавшегося циангидрина из реакционной смеси, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве фермента используют Sоксинитриллиазу с активностью по меньшей мере 500, предпочтительно 500-2000 ME, и процесс ведут в среде разбавителя при рН 3-5. 2. Способ по п. 1 , о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве донора цианогруппы используют ацетонциангидрин. 3. Способ по любому из пп. 1 и 2, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве разбавителя используют водный разбавитель. 4. Способ по любому из пп. 1-3, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве S-оксинитриллиазы используют S-оксинитриллиазу из рода Hevea Brasiliensis или Sorghum bicolor. 5. Способ по любому из пп. 1-4, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что выделение и очистку циангидрина осуществляют хроматографированием. С > 00 Изобретение касается ферментного способа энантиоселективного получения оптически активных циангидринов из альдегида или несимметричного кетона и донора циангруппы при воздействии оксинитриллиазы. Циангидрины являются ценными продуктами для синтеза альфа-оксикислот, которые используются при получении биологически активных веществ, например, фармацевтических активных веществ, витаминов, а также пиретроидных соединений. В J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 6 9 9 2 6996 описан способ получения R-циангидринов реакцией обмена ароматических или алифатических альдегидов с ацетонцингидрином в присутствии D-оксинитрилазы. Чтобы получить обогащенный энантиомерами продукт, процесс необходимо проводить в присутствии органического, не смешивающегося с водой растворителя, так как один водный раствор приводит к рацемизации продукта. Заявителем неожиданно был найден энантиоселективный способ получения S О 26382 энантиомера оптически активного циангидрина, при котором образуются продукты с высокой оптической читотой и при котором не нужно использовать цианистоводородную кислоту и органический растворитель. S-циангидрины, произведенные от алифатических альдегидов, могут таким образом быть получены при помощи S-оксинитриллиазы. Предметом изобретения является энантиоселективный способ получения Sэнантиомера оптически активного циангидрина путем реакции обмена между альдегидом или несимметричным кетоном и донором цианогруппы, который отличается тем, что проводится реакция обмена между альдегидом или кетоном в разбавителе в присутствии S-оксинитриллиазы и донором цианогруппы, после чего осуществляется выделение образующегося циангидрина из реакционной смеси. 3 качестве исходных материалов в предложенном в изобретении способе используются альдегид или несимметричный кетон, донор цианогруппы, оксинитриллиаза и разбавитель. В качестве альдегида используют алифатические или ароматические альдегиды. В качестве кетона используют метилкетон. В качестве донора цианогруппы применяется циангидрин общей формулы R,R2C(OH)(CN), в которой R, и R2 независимо друг от друга означают алкильный остаток. Получение донора цианогруппы может осуществляться известными способами. В качестве оксинитриллиазы применяется S-оксинитриллиаза, например, из рода Sorghum bicolor и Hevea brasiliensis. Наиболее подходящей оказалась оксинитриллиаза из рода Hevea brasiliensis. Оксинитриллиаза может при этом использоваться в очищенном или в неочищенном виде, как сама по себе или в иммобилизированной форме. Подготовка и очистка оксинитриллиазы может осуществляться, например, осаждением с сульфатом аммония и последующей фильтрацией через гель, как это показано в работе D. Selmer et al., Physiologia Plantarum 75 (1989), 97-101. Способ согласно изобретению осуществляют в разбавителе. Особенно предпочтительным оказалось проводить реакцию обмена в водном разбавителе без добавок органических растворителей, которые сильно гасят активность фермента, причем, это неожиданно, не происходит рацемизации продукта. Однако предложен 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ный способ может также проводиться и в органическом разбавителе или в присутствии органического растворителя. Органиеский растворитель может при этом служить как сорастворитель в водной системе или как растворитель в двухфазовой системе, например, в мембранном реакторе. В качестве органических разбавителей могут использоваться алифатические или ароматические углеводороды, галогенированные в соответствующих случаях; спирты; простые эфиры; сложные эфиры. В качестве органического сорастворителя могут использоваться смешивающиеся с водой органические растворители, как например, спирты, а в качестве растворителей в составе двухфазовой системы- несмешивающиеся с водой органические растворители, как например, алифатические или ароматические углеводороды, галогенированные при необходимости, а также простые и сложные эфиры. В качестве водного разбавителя используется вода, водный солевой или водный буферный раствор. Предпочтение отдается водному буферному раствору и особенно такому, который содержит цитрат натрия. Величина рН должна при этом быть нижа 7, предпочтительнее от 3 до 5. На 1 г альдегида или несимметричного кетона добавляют примерно от 150 до 300 г разбавителя и оксинитриллиазу в количестве по меньшей мере 500, предпочтительно от 500 до 2000 ME активности. На моль используемой альдегидной или кетонной группы используется не менее 1 моль, а предпочтительнее от 1 до 2 моль донора цианогруппы. Процесс проводят путем встряхивания или перемешивания реакционной смеси при температуре примерно от 0 до температуры дезактивирования оксинитриллиазы, предпочтительнее при температуре от 20 до 30°С. При этом цианогруппа донора переходит к атому карбонильного углерода используемого альдегида или кетона и образуется преимущественно S-энантиомер оптически активного циангидрина, соответствующего используемому альдегиду или кетону. За ходом реакции следят методом газовой хроматографии. После окончания реакции образовавшийся циангидрин экстрагируют из реакционной смеси при помощи органического растворите-ля, который не смешивается с водой, например, лифатическими или ароматическими, при необходимости галогенированными углеводородами, такими как пентан, гексан, бензол, толуол, 26382 метиленхлорид, хлороформ, хлорбензолы, простыми эфирами, такими как диэтиловым эфиром, диизопропиловым эфиром или сложными эфирами, например, этиловым эфиром уксусной кислоты или смесями таких растворителей. Если чистота экстрагированного продукта недостаточна, то затем может следовать операция очистки. Очистка может осуществляться каким-либо известным способом, но лучше всего ее проводить методом хроматографии. В соответствии с предпочтительной формой осуществления производят встряхивание при комнатной температуре смеси из примерно 100 мг альдегида в водном буферном растворе в количестве от 15 до 30 г с рН равной примерно 4, содержащем цитрат натрия, вместе с 2 молями ацетонциангидрина на каждый моль используемой альдегидной или кетонной группы и оксинитриллиазой из Hevea Brasiliensis активностью 200 ME. За ходом реакции следят методом газовой хроматографии. После окончания реакции реакционуню смесь экстрагируют метиленхлоридом, органическую фазу высушивают и упаривают. Последующую очистку остатка можно осуществлять методом колоночной хроматографии. П р и м е р 1. 100 мг капрональдегида (1 ммоль) растворяют в 20 мл 0,1 молярного цитратного буфера с величиной рН равной 4, к раствору добавляют 1 г ферментного неочищенного изолята с активностью 100 ME на грамм в виде высушенного лиофильной сушкой порошка, полученного в соответствий с методом D. Selmar et al., Physiologica Plantarum 75 (1989), 9 7 - 1 0 1 , и 168 мг ацетонциангидрина (2 ммоль), и встряхивают смесь в устройстве для встряхивания в течение 2 часов при комнатной температуре. За ходом реакции следят с помощью газовой хроматографии. После окончания реакции трехкратно экстрагируют по 25 мл метиленхлорида. Органические фазы объеди 5 10 15 20 25 30 35 40 45 няют, сушат над сульфатом натрия и растворитель отгоняют в роторном испарителе. При этом получают 114 мг, что составляет 9 0 % от теоретического выхода, Sкапрональдегидциангидрина с чистотой энантиомера 84%. П р и м е р 2. Осуществляют взаимодействие между 80 мг бензальдегида (0,75 ммоль) и 128 мг ацетонциангидрина (1,5 ммоль), как это описано в примере 1, в 15 мл 0,1 молярного цитратного буфера (рН 4) и 1 г описанного в примере 1 ферментного изолята. При этом получают 45 мг, что составляет 4 5 % от теоретического выхода, Sбензальдегидциангидрина с чистотой энантиомера 94%. Определение оптической чистоты образующихся альдегидциангидринов осуществляют газохроматографическим методом на капиллярной колонке через метилкарбонат в соответствии с методом J.W.Westley et al., J.Org. Chem. 33 (1968), 3978-3980. Определение оптической чистоты кетонциангидринов осуществляют газохроматографическим методом на хиральнои разделительной фазе в соответствии с методом V.Schuig et al., Aug. Chemie 102 (1990), 969-986. П р и м е р 3. 100 мг метилпропилкетона (1,16 ммоль) растворяют в 15 мл 0,1 молярного цитратного буфера с зна* чением рН 4, смешивают с 0,6 неочищенного ферментного изолята с активностью 100 ME на грамм в виде высушенного при вымораживании порошка (получен по D. Selmar и др. Physiologica Plantarum 75, 1989, 97-101) и с 198 мг ацетонциангидрина (2,32 ммоль) и встряхивают 2 ч при комнатной температуре. Реакцию контролируют с помощью газовой хроматографии. После установления равновесия газохроматографический анализ показан 4 0 % метилпропилкетонциангидрина с энантиомерной чистотой 6 1 % . Упорядник Техред М. Келемеш Коректор М.Самборська Замовлення 504 Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101