Засіб оцінки імунологічного статусу тварин

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, преимущественно разделу клеточной иммунологии. Цель изобретения - повышение точности оценки иммунологического статуса различных видов животных в норме и патологии. Для этого наряду с оценкой 8-88 трансформационных свойств культивируемых монануклеарных клеток крови животного осуществляют определение их фагоцитарной активности, а оценку проводят по совокупности трансформационных и фагоцитарных показателей лейкоцитов.Способ включает операции: отбор проб крови, выделение из нее лейкоцитов, культивирование их на питательной среде с сывороткой в культуральном флаконе . на покровном стекле, извлечение покровного стекла, его фиксацию, окраску, мнкроскотшрование, оценку иммунологического статуса. Новым является введение в культуральный флакон за 40-45 мин до окончания инкубации суспензии инактивированного стафилококка в количестве 200-220 млн микробных тел на 1,0х к 10 -1,2-10 ЛЄЙКОЦВТОВ с дополнительной оценкой статуса по фагоцитарной активности лейкоцитов. 6 табл. 1 1378578 Изобретение относится к ветеринартрансформированных и нетрансформироной иммунологии и может быть испольванных мононуклеаров по формуле зовано для оценки активности системы 200% мононуклеарных фагоцитов, Р = Целью изобретения является повышение точности оценки иммунологичесгде Р фагоцитарный показатель; кого статуса животных. Т количество фагоцитирующих Способ осуществляется следующим мононуклеаров; образом, 10 D - количество нефагоцитирующих Пробу крови животного (3-5 м л ) , мононуклеаров; отобранную с добавлением гепарина, в) фагоцитарное число по формуле отстаивают 1-1,5 ч при комнатной температуре. Слой клеток белой крови отсасывают пипеткой, трижды отмывают ^5 средой 199, а затем концентрацию лейкоцитов доводят средой 199 с 15% где Q - фагоцитарное число; х бычьей сыворотки до 1,0-10 - 1 , 2 S - суммарное число фагоцитирое «10 клеток/мл. На дно культурального ванных кокков; флакона помещают покровное стекло и 20 L - количество фагоцитов, в вносят 3-4 мл взвеси клеток белой которых подсчитывали фагоцикрови. Флаконы инкубируют 24 ч при тированные кокки. D 37 C. За 40-45 мин до окончания инПолученные результаты обрабатыкубации во флакон вносят суспензию вают статистически. Для этой цели инактивированного стафилококка из 25 удобен метод Монцевичуте-Эрингене. расчета 200-220 млн микробных тел на Существенность интервалов значе1,0-10 -1,2*10 клеток. По окончании ний параметров предлагаемого спосоинкубации покровные стекла с при-ба подтверждена в специально провекрепившимися клетками извлекают,подденных трех сериях опытов. Б этих сушивают на лабораторном столе 1530 опытах (см. табл.1-3) использовали 20 мин, фиксируют в метаноле или образцы крови от одной и той же групхолодном ацетоне 7-10 мин, повторно пы животных (19 голов поросят 7— высушивают и окрашивают по Романовсдневного возраста) с тем, чтобы разкому . После подсушивания покровные личия результатов определялись исстекла монтируют с помощью кедрового ключительно различиями значений пара35 бальзама на предметных стеклах клеметров выполнения способа. точным слоем вниз. Изучение полученСерия опытов I. ных цитологических препаратов ведут Из данных, представленных в в обычном светооптическом микроскопе табл.1, следует, что выполнению при увеличении объектива 90х (иммер40 способа удовлетворяет внесение стасия) и окуляра 7-12,5х. Трансформафилококка в количестве 200-220 млн ционную активность моионуклеаров микробных тел на 1.0-10 клеток. оценивают, подсчитывая соотношение Меньшие количества кокков (160нетрансформированных клеток и макро180 млн) не обеспечивают достаточфагов. После подсчета 100-200 клеток ного контакта клеток с ними, что про45 определяют является увеличением фагоцитарного а) показатель макрофдгальной показателя при повышении концентратрансформации мононуклеаров (ПМТМ) ции суспензии стафилококка, а также по формуле низким фагоцитарным числом. Применение больших количеств кокков (24050 300 млн) нецелесообразно, так как • К= M+N не повышает процент фагоцитирующих клеток, неэкономично, а также затрудгде К - ПМТМ; няет учет реакции (избыток кокков М - количество микрофагов; ухудшает возможности индентификации N - количество нетрансформиро55 клеток, резко повышает ошибку при ванных мононуклеаров (моноопределении фагоцитарного числа), цитов и лимфоцитов); б) фагоцитарный показатель - колиРезультаты экспериментов серии I чество фагоцитирующих клеток на 100 позволяют считать допустимым коли З 1 378578 чеством вносимых стафилококков 200-220 млн микробных тел, оптимальным - 200 млн микробных тел. Серия опытов II. Из приведенных в табл.2 данных видно, что хорошие результаты обеспечивает продолжительность инкубации клеток со стафилококком в пределах 40-45 мин. Меньшая продолжительность не обеспечивает достаточно полного захвата и поглощения кокков, а большая приводит к снижению фагоцитарных показателей в результате переваривания поглощенных микроорганизмов. Таким образом, оптимальное время инкубации согласно приведенным экспериментальным данным составляет 4045 мин. Серия опытов III. Из представленных в табл.3 данных следует, что лучшие результаты обесе печивает использование 1,0*10 — 1,2»10 клеток при внесении 200 млн микробных тел инактивированных стафилококков и продолжительности инкубации 45 мин. При меньшем количестве клеток не идет реакция трансформации и соответственно невозможна фагоцитарная характеристика макрофагов. При большем количестве клеток снижаются фагоцитарные показатели, требуются большие объемы проб крови, возникает перерасход сред, сыворотки, повышаются трудозатраты. Таким образом, допустимое количество клеток составляет 1,0 "ID -1,2-10 , опти мальное - 1 , 0 '10 б . П р и м е р 1. Сравнительная оценка иммунологического статуса двухмесячных поросят, полученных и выращиваемых по различной технологии. Исследовали пробы крови от животных в двух группах: I группа - 11 голов - промышленная технология воспроизводства и выращивания молодняка свиней; II группа - 11 голов - выгульное содержание в- летних лагерях, рацион с добавлением сочных кормов. После отбора крови (3 мл) от каждого животного из каждой пробы получали суспензию лейкоцитов с содержанием клеток 1,0 І0 лейкоцитов в 1 мл. В культуральные флаконы с помещенными на дно покровными стеклами вносили по 3 мл суспензии лейкоцитов. Флаконы с клетками инкуби . ^Q 15 2Q 25 OQ 35 лп .. " ' 4 ровали в термостате при 37°С 24 ч. За 45 мин до окончания инкубации в каждый флакон вносили суспензию инактивированного стафилококка - по 600 млн микробных тел на 1 флакон (из расчета 200 млн микробных тел на 1,0'10 клеток). По окончании инкубации покровные стекла с клетками высушивали, фиксировали в метанопе, окрашивали по Романовскому и при микроскопическом исследовании определяли показатель макрофагальной трансформации мононуклеаров (ПМТМ), фагоцитарный показатель и фагоцитарное число (см. табл.4). Представленные дачные свидетельствуют о более высоком иммунологическом статусе у животных второй груп'пы, что позволяет ограничить объем 'необходимых ветеринарных мероприятий в связи с более низким у этих животных риском инфекционных заболеваний, а также рекомендовать их для селекционной и племенной работы. П р и м е р 2, Сравнительная оценка иммунологического статуса поросят-отъемышей, получавших и не получавших препарат витамина А. Исследовали пробы крови от животных в двух группах: I группа - 37 голов поросят-отъемышей, не получавших препарат витамина А; II группа - 41 голова поросятотъемышей из того же сектора и того же хозяйства, получавших витамин А в дозе 6600 ед. в сутки в течение 10 дней. От каждого животного отбирали по 3 мл крови и из каждой пробы готовили суспензию лейкоцитов, содержавшую 1,2>10б клеток в 1 мл. Б Культуральные флаконы с помещенными на дно покровными стеклами вносили по 3 мл суспензии лейкоцитов. Флаконы с клетками инкубировали в термостате при 37 С 24 ч. За 40 мин до окончания инкубации в каждый флакон вносили по 660 млн микробных тел инактивированного стафилококка (из расчета 220 млн микробных тел на 1,2 '10 клеток). По окончании инкубации покровные стекла с клетками извлекали, подсушивали, фиксировали в метаноле, окрашивали по Романовскому и при микроскопическом исследовании определяли показатель макрофагальной трансформации мононуклеаров 5 1378578 СПМТМ), фагоцитарный показатель и фагоцитарное число (см. табл.5). В результате проведенного опыта установлено, что иммунологический статус поросят-отъемышей, получавших препарат витамина А, значительно выше за счет большей активности по фагоцитарным показателям их мононуклеарных клеток. 10 П р и м е р 3. Сравнительная оценка иммунологического статуса кроликов породы "шиншилла" и беспородных животных. Исследовали пробы крови от жи15 вотных в двух группах: I группа - 9 голов - кролики породы "шиншилла" 6-месячного возраста; II группа - 9 голов - беспородные кролики того же возраста. 20 От каждого животного отбирали по 3 мл крови и из каждой пробы готовили суспензию лейкоцитову содержавшую 1,1'10 клеток в 1 мл. В культуральные флаконы с помещенными на дно пок- 25 ровными стеклами вносили по 3 мл суспензии лейкоцитов. Флаконы с клетками инкубировали в термостате при 37 С 24 ч. За 40 мин до окончания инкубации в каждый флакон вносили по 30 630 млн микробных тел инактивирован— ного стафилококка (из расчета 210 млн микробных тел на 1,1'10 клеток). По окончании инкубации покровные стекла с клетками извлекали, подсушивали, 35 фиксировали в метаноле, окрашивали по Романовскому и при микроскбпичес ком исследовании определяли показатель макрофагальной трансформации мононуклеаров (ІШТМ), фагоцитарный показатель и фагоцитарное число (см. табл.6). Из представленных данных следует, что при отсутствии статистически "достоверных отличий по ПМТМ иммунологический статус беспородных животных следует оценить как несомненно более высокий на основании существенных и статистически достоверных различий средних фагоцитарного показателя и фагоцитарного числа. Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Способ оценки иммунологического статуса животных, включающий отбор проб крови, выделение из нее лейкоцитов, культивирование их в питательной среде с сывороткой на покровном стекле с последующим извлечением покровного стекла» его фиксациеи,окраской, микроскопированием и оценкой статуса по количеству трансформированных макрофагов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, за 4045 мин до окончания культивирования в среду вводят суспензию ииактивированного стафилококка в количестве 200-220 млн микробных тел на 1,0110 1,2'10 лейкоцитов, а оценку дополнительно проводят по фагоцитарной активности лейкоцитов. Т а б л и ц а Определение оптимального количества вводимого инактивированного стафилококка (количество 6 ' клеток 1,0-10 ; продолжительность инкубации 45 мин) Количество микробных тел, млн Результаты пмтм,% 1 Фагоцитарный показатель, 1 Фагоцитарное число 160 35 19,1*2,2 3,9±0 ,5 180 3317*4,1 24,4+2,8 4,7+0 ,4 200 34,744,0 30,5*3,3 6,8±0 ,7 220 35,0іЗ,8 31,213,8 7,1±0 ,8 1 378578 8 Продолжение табл.1 Количество микробных тел, мдн Результаты ПМТМ,% Фагоцитарный Показатель, Фагоцитарное число 240 32,9*3,6 31,9±4,1 11,0+4,8 300 33,1*3,5 32,6+4,7 Учет невозможен Т а б л и ц а 2 Ohpeделение оптимальной продолжительности инкубации клеток с суспензией инактивированного стафилококка (количество вносимых стафилококков - 200 млн микробных тел на 1,0 і 10 клеток) Время инкубации, мин Результаты Фагоцитарный показатель,% Фагоцитарное число ' 30 33,2+4,1 1,8+2,1 3,6+0,5 35 35,0+3,9 24,1+2,7 4,4±0,5 40 33,9±3,7 28,2+2,6 6,2+0,7 45 34,7+4,0 30,5±3,2 6,8+0,7 50 35,2+3,6 27,3+3,0 5,1+0.,6 Т а б л и ц а Определение оптимального количества клеток (продолжительность инкубации 45 мин) Количество клеток Результаты ПМТМ,% 0,8-10 Фагоцитарный показатель,% Фагоцитарное число Реакция не идет (нет трасформации) 1,0-106 34,7±4,0 30,5+3,2 6,8+0,7 1,2 10* 36,0+3,8 31,4±3,0 6,4+0,8 1,4-10* 35,2+4,1 28,0+2,5 4,9+0,6 1,6 • 1 0 6 36,1±3,9 24,9+2,8 4,7+0,7 3 9 Т а б л и ц а Группа живот пмтм,% ных I 37,7±3,9 10 1378578 4 Фагоцитар- Фагоциный пока- тарное затель, % число 23,5+2,9 Т а б л и ц а Группа живот ПМТМ,% ных Фагоцитарный показатель,!? 5,7+0,6 33,2 +4,1 22,4+2,6 р>0,1 Фагоцитарное число 5,1+0,7 рс0,05 Р?0,1 ,05 Т а б л и ц а б Группа живот ПМТМ,% Фагоцитарный показатель,% 36,0+4,6 30,7+3,9 §§A2£1L1 ІІХІ^.ІЛ.1 ных I 1 1 р>0,1 Редактор З.Ходакова Заказ 8/ДСП Фагоцитарное число 5,4+0,6 1з.ї~9.& р