Спосіб нейрохімічної оцінки стану післяопераційної гіпералгезії

1. Спосіб нейрохімічної оцінки стану післяопераційної гіпералгезії, що включає відбір гомогенатів таламуса, гіпоталамуса у щурів, виготовлення з них проб водорозчинних білкових фракцій, дослідження лізосомних глікозидаз і реєстрацію процесу гіпералгезії, який U 1 3 28390 аналізу, що інформує про його економічність та спрощення процесу. Але одержуваний позитив є специфічним, оскільки формування больових відчуттів вимагає активації рецепторів за певною участю протеїнази, що стримує інформативність й межі використання способу. Найбільш близьким серед об'єктів аналогічного призначення за сукупністю істотних ознак до дійсної корисної моделі є спосіб нейрохімічної оцінки стану післяопераційної гіпералгезії, що включає відбір гомогенатів таламуса, гіпоталамуса у щурів, виготовлення з них водорозчинних білкових фракцій, дослідження лізосомних глікозидаз і реєстрацію процесу гіпералгезії, у відповідності з яким, як лізосомні глікозидази досліджують a -глюкозидизу, b глюкозидазу та N-ацетилглюкозамінідазу [3]. Спосіб допускає реєстрацію факту гіпералгезії прямим шляхом, насамперед по зміні проникності мембран лізосом одного з гомогенатів, тобто по неймовірно уразливому морфозу однієї з лізосомних глікозидаз, що причетна до відщеплення вуглеводних компонентів глікопротеїнів, гліколіпідів і мукополісахаридів. Однак, через 1 добу після операції лізосомні глікозидази та серинова протеїназа водорозчинних білкових фракцій гомогенатів під час протеолізу та модифікації білків втрачають інформативність, з-поза недостатньої проникності мембран лізосом мозку. Вірогідніше за все, це стає наслідком замалої чутливості залучених гомогенатів мозку до ноцицептивних стимулів, слабістю останніх і не досить високої компетентності лізосомних глікозидаз відносно морфозу проникності мембран. В основу дійсної корисної моделі поставлена задача вдосконалити спосіб нейрохімічної оцінки стану післяопераційної гіпералгезії, застосування якого дозволило б шляхом залучення більш чутливи х компонентів гомогенатів головного мозку до ноцицептивних стимулів, а також застосування цистеїнового катепсину В, як маркера стабільності мембран лізосом, збільшити тривалість відбиття слідів гіпералгезії. Поставлена задача вирішується тим, що при здійсненні у способі нейрохімічної оцінки стану післяопераційної гіпералгезії, що включає відбір гомогенатів таламуса, гіпоталамуса у щурів, виготовлення з них проб водорозчинних білкових фракцій, дослідження лізосомних глікозидаз і реєстрацію процесу гіпералгезії, відповідно до корисної моделі, додатково відбирають гомогенати неокортексу, гіпокампу, довгастого мозку, виготовляють з них проби водорозчинних білкових фракцій шляхом змішування гомогенатів з трисНСl-буфером, при дослідженні лізосомних пептидгідролаз вишукують в них зміну кількісної активності лізосомного цистеїнового катепсину В шляхом спектрофотометрії, супроводжуваної гідролізом проб з синтетичним хромогенним субстратом, а процес гіпералгезії реєструють по зростанню кількісної активності лізосомного цистеїнового катепсину В; за умов, що як синтетичний хромогенний субстрат використовують N-6eнзоїл-D,L-аргінін пара 4 нітроанілід; що рН трис-НСl-буферу доводять до 7,4. Причинно-наслідковий зв'язок сукупності істотних ознак дійсної корисної моделі з вищезазначеним технічним результатом полягає в наступному. Додаткове залучення гомогенатів неокортексу, гіпокампу, довгастого мозку, з наступним виготовленням водорозчинних білкових фракцій на їхній основі покращує компетентність лізосомних глікозидаз, щодо морфозу проникності мембран, адже аферентні тракти, котрі впливають на лімбічну систему, гіпокамп, неокортекс головного мозку, довгастий мозок відповідають за провідні шляхи ноцицепції під час протеолізу та модифікації білків, достовірно корелюють з морфозом активності цистеїнового катепсину В і відповідно відбивають фізіологічні особливості шляхів проведення болю, ніж решта структур головного мозку, а мембрани їхніх лізосом піддаються більшій проникності, що сприяє збільшенню тривалості відбиття слідів гіпералгезії. Залучення лізосомного цистеїнового катепсину В обґрунтоване баченням в ньому властивостей маркера стабільності мембран лізосом, оскільки кількісне визначення його вільної активності в умовах гіпералгезії стає засобом оцінки ступені й тривалості участі залучених структур головного мозку в процесі проведення та аналізу ноцицептивного сигналу, що сприяє збільшенню тривалості відбиття слідів гіпералгезії, з урахуванням активності протеолізу та модифікації білків. Змішування кожної з проб водорозчинних білкових фракцій з трис-НСl-буферним розчином перед дослідженням кількісної активності лізосомного цистеїнового катепсину В сприяє прояву вільної активності ферменту, що стає необхідним для подолання труднощів, зв'язаних зі слабкістю ноцицептивних стимулів, а від того збільшує тривалість відбиття слідів гіпералгезії. Дослідження кількісної активності лізосомного цистеїнового катепсину В шляхом спектрофотометрії, а саме, в умовах гідролізу синтетичного хромогенного субстрату підвищує чутливість до морфозу проникності мембран, а відтак допускає аналіз ноцицептивного сигналу та оцінку функцій досліджуваних структур головного у віддаленому термінові. Застосування як синтетичного хромогенного субстрату N-6eнзоїл-D,L-apгінін пара-нітроаніліду й доведення рН трис-НСl-буферу до 7,4 позбавлено самостійної правової охорони та є уточненнями до відтворення способу з максимальним технічним результатом, у контексті з кількісною оцінкою лізосомного цистеїнового катепсину В, як маркера стабільності мембран лізосом, у більш тривалому постопераційному періоді. Тож, сукупність ознак способу нейрохімічної оцінки стану післяопераційної гіпералгезії є суттєвою та відповідає критерію «новизна», оскільки має причинно-наслідковий зв'язок з отриманням вищезазначеного технічного результату і не випливає з досліджуваного рівня 5 28390 техніки явним чином, відповідно. На Фіг. надана діаграма активності цистеїнового катепсину В у стр уктурах головного мозку щурів (неокортекс 1, гіпокамп 2, довгуватий мозок 3, таламус/гіпоталамус 4) у часі. Відомості, які підтверджують можливість відтворення дійсного способу нейрохімічної оцінки стану післяопераційної гіпералгезії, з досягненням заявленого технічного результату, полягають в наступному. Для відтворення способу залучають трис-НСlбуферний розчин (фірми «Sigma», США), N6eнзоїл-D,L-apгiнін пара-нітроанілід («Fluka», Швейцарія), білих статевозрілих щурів, спектрофотометр типу («СФ-26», Росія). Сутність. Імітують операцію під ефірною анестезією: на плантарній частині підошви задньої кінцівки щура здійснюють розріз шкіри, фасції і м'язів довжиною до 10мм, рану обробляють, ушивають. Після операції відбирають структури таламуса, гіпоталамуса, неокортексу, гіпокампу, довгастого мозку та виготовляють з них 10% білкові фракції на трис-НСl-буферному розчині (рН 7,4) і досліджують на спектрофотометрі кількісну активність лізосомного цистеїнового катепсину В, в умовах гідролізу з N-бензоїл-D,L-аргінін паранітроанілідом. Як маркер стабільності мембран лізосом залучають лізосомний цистеїновий катепсин В. Процес гіпералгезії реєструють щораз, якщо спостерігають зростання кількісної активності останнього в гомогенатах таламуса, гіпоталамуса, неокортексу, гіпокампу й довгастого мозку. Оцінюють зміни стабільності мембран лізосом, рівні активності лізосомного цистеїнового катепсину В, ступінь та тривалість участі досліджуваних стр уктур в процесі проведення й аналізу ноцицептивного сигналу, а також констатують активність протеолізу та модифікації білків, на протязі 7 постоперційних діб, щонайменше. Для перевірки тривалості відбиття слідів гіпералгезії та інформативності за умов пропонованого способу проводили серію експериментів. Вихідні результати, котрі демонструють розподіл значень вільної активності лізосомного цистеїнового катепсину В у структурах головного мозку щурів через 24 години й 1 тиждень після операції, за даними нейрохімічної оцінки стану післяопераційної гіпералгезії, відбиті у табл. 1 (фронтальна кора 1, гіпокамп 2, довгуватий мозок 3, таламус/гіпоталамус 4). Залучали 25 білих ста тевозрілих щурів, які були поділені на 2 групи (оперовану й контрольну). Через 1 добу (період найбільш вираженої гіпералгезії) й на 7 добу після операції проводили декапітацію, при цьому вилучали головний мозок, виділяли фронтальну зону неокортексу, гіпокамп, таламус, гіпоталамус і довгастий мозок. Вільну активність лізосомного цистеїнового катепсину В визначали у пробах 10% гомогенатів, на основі трис-НСl-буферу (рН 7,4). Рівні активності досліджували спектрофотометричним шляхом, в умовах гідролізу з N-бензоїл-D,L-apгінін паранітроаніліда. За даними експериментів було встановлено, 6 що в різних стр уктура х мозку досліджуваних тварин відбуваються статистично вірогідні зміни вільної активності лізосомного цистеїнового катепсину В. В неокортексі, довгастому мозку, таламусі, гіпоталамусі через 1 добу після операції встановлено підвищення його активності в 2,8, 6,0 і 11,0 разів відповідно до контролю. Через 7 постоперативних діб спостерігали зниження активності катепсину В у неокортексі, довгастому мозку, таламусі, гіпоталамусі в 5,0, 5,6 та 12,5 разів у порівнянні з прототипом (р