Спосіб диференційної діагностики новоутворень щитовидної залози

Спосіб диференційної діагностики новоутворень щитовидної залози, що включає біопсію тканин, формування цитологічних препаратів, їх імуноцитохімічне дослідження, визначення рівнів 3 йодопероксидази в клітинах фолікулярного епітелію щитовидної залози шляхом цитохімічного аналізу, розрахункові, оцінці індексу резистентності та класифікації патологічного процесу [3]. Як свідчить аналіз властивостей цієї методики, використання цитохімічної аналітичної основи дозволяє констатувати наявність й форму одного з двох можливих патологічних процесів на доопераційному етапі. Але, дослідження йодопероксидази в клітинах фолікулярного епітелію щитовидної залози, недостатня кількість решти аргументів, як і відсутність засобів диференціювання індексу резистентності стримують пошук злоякісних клітинних потенціалів фолікулярних новоутворень щитовидної залози. Найбільш близьким серед об'єктів аналогічного призначення за сукупністю істотних ознак до дійсної корисної моделі є спосіб диференційної діагностики новоутворень щитовидної залозки, що включає біопсію тканин, формування цитологічних препаратів, їх імуноцитохімічне дослідження, визначення рівнів експресії молекул клітинної адгезії галектину-3 і CD44v6, як маркерів фолікулярного раку, за допомогою моноклональних антитіл, оцінку й класифікацію клітинних новоутворень з можливістю діагностування раку по збільшенню експресії, принаймні, одного з досліджуваних маркерів [4]. Експресія галектину-3 та CD44v6 добре відбиває інвазивні властивості клітин фолікулярних неоплазій щитовидної залози та ідентифікацію злоякісних потенціалів клітин на доопераційному етапі, які не піддаються диференціюванню під час цитологічних або гістологічних досліджень, й допускає відрізнення злоякісних новоутворень від доброякісних. Цей позитив CD44v6 був доведений також під час імуногістохімічного аналізу біологічних препаратів з приводу дослідження прогресії ракових клітин шлунку [5], але вже після діагностування злоякісної пухлини. Однак, на думку заявника прототипу ще бракує інформативності відносно фолікулярної аденоми та фолікулярного раку щитовидної залози, а також більш високої точності, що стримує збільшення органозберігаючих операцій, оскільки позитивна реакція галектину-3 або CD44v6 з антитілами охоплює лише біля 5% пухлинних клітин за наявністю злоякісного потенціалу [4].Точність діагностування за умов прототипу сягає близько 88-98%. В основу дійсної корисної моделі поставлена задача створити такий спосіб диференційної діагностики новоутворень щитовидної залози, застосування якого дозволило б шляхом використання показових резервів передпухлинних та пухлинних процесів посилити інформативність і збільшити точність дослідження за рахунок додаткової регуляторної субстанції, а відтак збільшити кількість органозберігаючих oпeрацій. Поставлена задача вирішується тим, що при здійсненні у способі диференційної діагностики новоутворень щитовидної залози, що включає біопсію тканин, формування цитологічних препаратів, їх імуноцитохімічне дослідження, визначення рівнів експресії молекул клітинної адгезії галектину-3 і CD44v6, як маркерів онкологічного процесу, за допомогою моноклональних антитіл, 29613 4 оцінку й класифікацію клітинних новоутворень, з можливістю діагностування раку по збільшенню експресії, принаймні, одного з досліджуваних маркерів, відповідно до корисної моделі, додатково визначають рівень експресії гену НВМЕ-1, як маркера злоякісних фолікулярних пухлин, а при класифікації новоутворень діагностують наявність фолікулярного раку або, за відсутності експресії маркерів, доброякісного фолікулярного новоутворення. Причинно-наслідковий зв'язок сукупності істотних ознак дійсної корисної моделі з вищезазначеним технічним результатом полягає в наступному. Практична цінність корисної моделі процесу зв'язується з можливістю діагностування фолікулярного раку та фолікулярної аденоми щитовидної залози, які в умовах доопераційного цитологічного дослідження раніш не ідентифікувалися. Перевершення технічного результату ґрунтується на тому, що в клітинах фолікулярного епітелію нормальної, зобнозміненої залози або в клітинах доброякісної пухлини (фолікулярної аденоми) щитовидної залози, зазвичай експресія маркерів онкологічного процесу галектину-3 і CD44v6 відбувається у малопомітних межах, адже позитивна реакція галектину-3 або CD44v6 з антитілами охоплює лише біля 5% пухлинних клітин за наявністю злоякісного потенціалу [4]. Ген НВМЕ-1, що залучений як маркер злоякісних фолікулярних пухлин щитовидної залози, виконує функцію додаткового контролера з боку регуляторних субстанцій, що зумовлює збільшення інформативності й точності дослідження, оскільки за новою сукупністю маркерів підвищуються цитологічні реакції моноклональних антитіл на галектин-3 і CD44v6, котрі разом з НВМЕ-1 утягують в реакцію до 10-20% клітин біологічного матеріалу з профарбованою цитоплазмою. Це зумовлене тим, що в нормі галектин-3 і CD44v6 експресуються фолікулярними клітинами в міжклітинний матрикс, забезпечуючи їх адгезію, а при появі злоякісного потенціалу у фолікулярних клітинах, ці глікопротеїни депонуються в цитоплазмі, зникаючи при цьому з міжклітинної речовини. Точність відрізнення злоякісних новоутворень від доброякісних за цих умов становить близько 99,9%. Збільшення інформативності досягається встановленням ознак фолікулярного раку, доброякісного фолікулярного новоутворення або констатацією малігнізованих клітин фолікулярних неоплазій за рахунок збільшення кількості регуляторних субстанцій, що допускає відчутне збільшення органозберігаючих втручань за рахунок доопераційного розмежування доброякісних і злоякісних фолікулярних новоутворень щитовидної залози. При цьому на доопераційному етапі вірогідність збільшення діагностичної інформативності фолікулярних неоплазій сягає 0,96-0,98. Цитологічний діагноз фолікулярної пухлини у подальшому визначає тактику лікування, що має залежить від наявності або відсутності реакції генів галектин-3, CD44v6 і НВМЕ-1 на антитіла, тобто здійснення радикального оперативного втручання, за наявністю хоча б єдиної реакції, або органозберігаючого лікування за стандартними 5 протоколами, за відсутністю реакції з жодним з представлених маркерів. За цих умов надається можливість висвітлення зв'язків неопластичних процесів зі змінами інвазивних властивостей неопластичних клітин, викликаних порушеннями адгезивних властивостей клітин, різними варіантами канцерогенезу, стадійністю цих змін, гетерогенністю доброякісних і злоякісних процесів щитовидної залози, а також різним характером їхнього плину в межах будь-якої локалізації, гістологічних форм і ступенів зрілості. Відомості, які підтверджують можливість відтворення способу, з досягненням заявленого технічного результату, полягають в наступному. Для здійснення способу залучають ротаційний мікротом «Microm» (виробництва «MicromInternational DmbH», Німеччина), мікроскоп DLME («Leica», Німеччина), моноклональні антитіла до галектину-3, CD44v6, HBME-1 («Novocastra», США). Сутність корисної моделі збігається до вивчення біологічних властивостей клітин фолікулярних новоутворень щитовидної залози за даними експресії маркерів, які характеризують інвазивні властивості пухлини. Для цього пацієнту з діагностованим вузловим утворенням щитовидної залози на етапі передопераційної підготовки проводять тонкоголкову аспіраційну біопсію під УЗконтролем. З узятого аспірату отримують 2 нативних мазка на предметному склі та фіксують їх у нейтральному забуференому 10% формаліні. Після певної підготовки, виготовлення та рутинного забарвлення першого цитологічного препарату одного за методикою Май-Ґрюнвальд-Ґімзи, другий з них піддають послідовному імуноцитохімічному дослідженню, з використанням моноклональних антитіл до галектину-3, CD44v6 і НВМЕ-1, за допомогою моноклональних антитіл визначають рівні експресії кожного з них. При класифікації новоутворень виявляють наявність доброякісного фолікулярного новоутворення, якщо спостерігають відсутність експресії у жодного з маркерів, або наявність фолікулярного раку, якщо встановлюють збільшення експресії, щонайменше, у одного з них, тобто встановлюють доброякісний чи злоякісний статус пухлини, її інвазивну здатність. При цьому статус клітин біологічного матеріалу кваліфікують позитивним, якщо виявляють реакцію з будь яким iз вищезазначених маркерів за наявністю фарбування понад 5% ядер. За цих умов точність відрізнення злоякісних новоутворень від доброякісних сягає 99,9%, а вірогідність диференційної діагностики фолікулярних пухлин щитовидної залози в межах 0,96-0,98. Використовуючи значення маркерів CD44v6, галектину-3 і НВМЕ-1, у подальшому оцінюють ймовірність подальшої прогресії пухлинного процесу та розроблююсь відповідні показання до належного обсягу оперативного лікування: констатують можливість здійснення радикального оперативного втручання, за наявністю хоча б єдиної реакції, або органозберігаючого за стандартними протоколами, за відсутністю реакції, чим збільшують кількість органозберігаючих операцій. 29613 6 Заявлений спосіб диференційної діагностики новоутворень щитовидної залози був апробований в умовах ОКЛ ім. І.І. Мечнікова м. Дніпропетровська. Його використання у більшості випадків призводило до корекції здійснюваної терапії та радикальних змін схем лікування. Переведення хворих на індивідуалізовану форму терапії покращувало ефективність лікування, знижувало інвазивність хірургічного втручання, скорочувало як терміни лікування, так і чисельність побічних ускладнень. Приклад 1. Xвopа Невровська С.Ю., 1970р.н., знаходилась під спостереженням у поліклініці медичної академії, м. Дніпропетровська. 2 місяці потому Н. скаржилася на об'ємне утворення на шиї, яке поступово збільшувалось. За даними УЗсканування у лівій долі щитовидної залози було виявлене вузлове утворення діаметром 2см. Н. було проведено цитологічне та комплексне імуноцитохімічне дослідження, з використанням маркерів галектину-3, CD44v6 та НВМЕ-1. Цитологічне дослідження: фолікулярна неоплазія щитовидної залози. Імуногістохімічне дослідження: галектин-3: негативний статус; CD44v6: негативний статус; НВМЕ-1: негативний статус. Оцінка комплексу діагностичних значень дозволила встановити наявність фолікулярної аденоми. На підставі отриманого результату Н. здійснили операцію гемітиреоїдектомії, замість запланованої субтотальної резекції. Післяопераційний період перебігав без ускладнень. Спостерігали стійку ремісію, котра триває дотепер, отриманий позитивний результат вбачається у вигляді відсутності рецидиву пухлини та маніфестації метастазів. Приклад 2. Хвора Рощектаєва А.І., 1930р.н., знаходилась в стаціонарі ОКЛ ім.. І.І. Мечнікова, м. Дніпропетровська, з приводу скарг на об'ємне утворення на шиї, яке поступово збільшувалась. За даними УЗ-сканування у правій долі щитовидної залози було виявлене вузлові утворення діаметром 3см. Пацієнтці було проведено цитологічне та комплексне імуноцитохімічне дослідження, з використанням маркерів галектину-3, CD44v6 та НВМЕ-1. Цитологічне дослідження: фолікулярна неоплазія щитовидної залози. Імуногістохімічне дослідження: галектин-3: позитивний статус; CD44v6: позитивний статус; НВМЕ-1: позитивний статус. Оцінка комплексу діагностичних значень дозволила встановити наявність фолікулярної карциноми. На підставі отриманого результату Р. здійснили операцію субтотальної резекції. Післяопераційний період перебігав без ускладнень. Спостерігали стійку ремісію, котра триває дотепер, отриманий позитивний результат вбачається у вигляді відсутності рецидиву пухлини та маніфестації метастазів. Наведені приклади клінічного використання способу диференційної діагностики новоутворень щитовидної залози інформують про розширення уявлень, щодо біологічних властивостей передпухлинних та пухлинних процесів. Повноцінність діагностування ІГХ статусу фолікулярних неоплазій щитовидної залози зв'язується з дослідженням прогностично значущих клініко-морфологічних 7 29613 критеріїв, імуногістохімічних маркерів, як ознак пухлинного процесу. Використання показових резервів передпухлинних та пухлинних процесів, додаткової регуляторної субстанції НВМЕ-1, збільшило точність діагностування та інформативність кінцевого результату на доопераційному етапі діагностування, з можливістю використання одержаних результатів в розробці більш ефективних стратегій лікування, та збільшення кількості органозберігаючих операцій. Джерела інформації: 1. Способ дифференциальной диагностики неопухолевых заболеваний и опухолей щитовидной железы: Пат. 2139678 России, МПК А61В 8/08 / Пинский С.Б., Белобородов В.А., Мясников В.Г. (Россия); Иркутский государственный медицинский университет (Россия). - №97110896/14; заявл. 26.06.97; опубл. 20.10.99. 2. Способ дифференциальной диагностики различных вариантов сосочкового рака щитовид Комп’ютерна верстка І.Скворцова 8 ной железы: Пат. 2132064 России, МПК G01N33/48, А61В10/00 / Пупышева Т.Л., Каляфва Т.Н., Шапиро Н.А., Шкурупий В.А. (Россия); Новосибирский медицинский институт (Россия). №97116984/14; заявл. 10.10.97; опубл. 20.06.99. 3. Спосіб доопераційної диференційної діагностики доброякісних та злоякісних новоутворень щитовидної залози: Пат. 70269 України, МПК G01N 33/50, А61В 10/00 / Зелінська Г.В. (Україна). -№20031212559; заявл. 26.12.2003; опубл. 15.09. 04. 4. Galectin-3 and CD44v6 isoforms in the preoperative evaluation of thyroid nodules. Gasbarri A., Martegani M.P., Del Prete F., Lucante Т., Natali P.G., Bartolazzi A. // Acta Cytol. -2002 (Jul-Aug). Vol.46. -№4. -P.679-683. 5. CD44v6 in gastric carcinoma: a marker of tumor progression. Xin Y., Grace A., Gallagher M.M., Curran B.Т., Leader M.B., Kay E.W. // J.Pathol. 2002 (Feb). - Vol.196. -№2. -P.180-185. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601