Спосіб діагностики хронічного перегрівання у гірників

Способ диагностики хронического перегрева у горнорабочих, включающий исследование крови, отличающийся тем, что в периферической крови определяют содержание субпопуляции лимфоцитов Т-супрессоров, а в сыворотке крови титр нормальных антител к эритроцитам барана и при снижении содержания субпопуляции лимфоцитов Тсупрессоров ниже 0,33 г/л и повышении титра нормальных антител к эритроцитам барана в пределах 1:10 - 1:64 диагностируют хронический перегрев. (19) (21) 96083364 (22) 27.08.1996 (24) 15.11.2000 (33) UA (46) 15.11.2000, Бюл. № 6, 2000 р. (72) Ракша-Слюсарева Олена Анатоліївна (73) ДОНЕЦЬКИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР ГІГІЄНИ ПРАЦІ ТА ПРОФІЛАКТИКИ ТРАВМАТИЗМУ, ДОНЕЦЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ 29675 отражающим состояние наиболее важных функциональных систем организма: нервной, сердечно-сосудистой, симпато-адреналовой, пищеварительной системы, а также состояние тепловой устойчивости, иммунной реактивности по данным НСТ-теста), электролитного обмена. При этом, диагноз хронического перегрева устанавливают при сумарном пороге диагностических критериев (ДК), равном - 9,8 ед., а отсутствие хронического перегрева - при +12,5 ед. При выявлении промежуточных показателей суммарного порога обследуемых показано дальнейшее динамическое наблюдение. Недостатком известного способа является сравнительно низкая надежность диагностики, высокая трудоемкость, большие затраты времени, необходимость специальных исследований, при этом выявляется хронический перегрев только у лиц, проработавших в нагревающем микроклимате свыше 10 лет. В основу изобретения поставлена задача диагностики хронического перегрева у горнорабочих, работающих в нагревающем микроклимате путем исследования периферической крови, в которой определяют содержание субпопуляции лимфоцитов Т-супрессоров и титр нормальных антител к эритроцитам барана и при снижении содержания субпопуляции лимфоцитов Т-супрессоров до 0,33 Г/л и повышении титра нормальных антител к эритроцитам барана в пределах 1:16 - 1:64 определяют хронический перегрев, что дает возможность обеспечить повышение точности способа диагностики и расширить возможности его применения. Сущность предлагаемого технического решения заключается в том, что диагностика хронического перегрева у горнорабочих осуществляется путем исследования крови и определения в периферической крови содержания субпопуляции лимфоцитов Т-супрессоров и в сыворотке крови – титра нормальных антител к эритроцитам барана и при снижении содержания субпопуляции Т-лимфоцитов супрессоров ниже 0,33 Г/л и повышении титра нормальных антител к эритроцитам барана в пределах 1:16 - 1:64 диагностируют хронический перегрев. Новым в предлагаемом способе является то, что в перифесрической крови определяют абсолютное содержание Т-супрессоров, а в сыворотке крови - титр нормальных антител к эритроцитам барана и при содержании Т-супрессоров ниже 0,33 Г/л и титре антител к эритроцитам барана в пределах 1:16-1:64 ставят диагноз хронический перегрев. У больных хроническим перегревом происходит срыв адаптации организма на уровне различных систем, в частности нейро-эндокринной, регулирующей состояние иммунитета. В связи с этим, наблюдаются изменения в иммунной системе, регистрируемые сперва как дисбаланс и дизрегуляция системы иммунокомпетентных клеток, а затем, как истощение напряженно работающих систем кроветворения и иммунитета. При хроническом перегреве это в первую очередь проявляется снижением содержания популяций Т клеток, в особенности субпопуляции Т-супрессоров. Последние регулируют через Т-хелперы выработку иммуноглобулинов. Следует отметить, что при почти нор мальной выработке или сниженной выработке иммуноглобулинов различных классов, за счет ослабления иммунных функций и снижения лимфоцитов Т-супрессоров, в организме начинают накапливаться продукты патологического метаболизма и, в частности, атипичные иммуноглобулины. Как результат вышеописанных изменений и организме повышается титр нормальных антител к эритроцитам барана, что в свою очередь отражает нарушение контроля генетического гомеостаза организма, осуществляемого иммунной системой. У горнорабочих, работающих в нагревающем микроклимате содержание Т-супрессоров превышает норму и составляет 1,1±0,02 Г/л, титр нормальных антител к эритроцитам барана log25±0,18, а при развитии хронического перегрева содержание субпопуляции Т-супрессоров снижается до 0,19± ±0,04 Г/л, а титр нормальных антител к эритроцитам барана повышается до log29,5±0,5 (в пределах 1:16 - 1:64), что легко определить с помощью иммунологических методов. Способ диагностики может быть осуществлен следующим образом. У горнорабочих, с подозрением на хронический перегрев, работающих в нагревающем микроклимате осуществляют забор венозной и/или пальцевой крови и делят на 2 порции. Определяют содержание лейкоцитов и затем определяют абсолютное содержание лимфоцитов. Параллельно выделяют популяцию лимфоцитов крови. Для этого кровь разводят 0,15 молярным раствором NaCl в соотношении 1:3, наслаивают разведенную кровь на фиколл-верографиновый градиент, центрифугируют 25 мин при 1500 об. мин., снимают лимфоцитарное кольцо. После двукратной отмывки суспензий лимфоцитов, их разводят до 1´106 и используют для определения субпопуляции лимфоцитов Т-супрессоров. Определение субпопуляции лимфоцитов Тсупрессоров можно проводить как методом ЕРОК, так и методом непрямой иммунофлуоресценции или проточной цитометрии с использованием соответствующих моноклональных антител. Если способ выполняют методом розеткообразования с эритроцитами барана, то к 0,1 мл выделенных лимфоцитов прибавляют 0,1 мл 0,01 молярного раствора теофиллина в среде 199 и инкубируют в течение 1-го часа при 37°С. Параллельно с этим ставят контроль, где к 0,1 мл выделенных лимфоцитов прибавляют 0,1 мл 0,15 М NaCl. Через час инкубации в обе пробирки прибавляют 0,1 мл 0,5% взвеси свежих отмытых эритроцитов барана, перемешивают встряхиванием, центрифугируют при 1500 об. мин в течение 5 минут, инкубируют при +4°С в течение 30 мин, фиксируют 3% раствором глютарового альдегида в количестве 0,05 мл, инкубируют при комнатной температуре 5 минут, затем отмывают дистиллированной водой 5 минут при 1500 об. мин, ресуспендируют и переносят полученный осадок отмытых розеток лимфоцитов с эритроцитами барана на обезжиренное предметное стекло. Окрашивают препарат по Романовскому-Гимза и подсчитывают с помощью светооптической техники количество полных розеток с эритроцитами барана. Считают 200 клеток. В случае определения субпопуляции лимфоцитов Т-супрессоров методом с использованием моноклональных антител, к выделенным 2 29675 по вышеуказанному способу лимфоцитам добавляют 20 мкл антител МКА ИКО 31 или ОКТ-8, ЛТ-8 или других аналогичных моноклональных антител, выявляющих антиген СД8+, соответствующий субпопуляции Т-лимфоцитов супрессоров/киллеров на поверхности клетки. Параллельно определяют популяцию СДЗ+ зрелых лимфоцитов. Смесь лимфоцитов и моноклональных антител инкубируют 30 минут при 20°С. Клетки отмывают два раза средой 199 или 0,15 М раствором NaCl. Затем добавляют 20 мкл Г/ав/ / 2 фрагментов люминисцирующей сыворотки против имуноглобулинов мыши к осадку клеток. Ресуспендируют, иинкубируют 30 минут при 0°С. Отмывают клетки 3 раза средой 199 или 0,15 М раствором NаСl. Затем помещают на 20 минут на предметное стекло на 20 минут. Отсасывают избыток неадсорбированной среды. Клетки консервируют 50% глицериновым буфером. Клетки, адсорбированные на стекле и покрытые глицериновым буфером накрывают покровным стеклом. Учитывают процент светящихся клеток с помощью иммунофлюоресцентного микороскопа при увеличении объекта ´90 ´100, окуляре 2,5. В препарате подсчитывают 200-300 клеток, определяя процент светящихся лимфоцитов или лимфоцитов с "шапочкой". При любом варианте определения Т-лимфоцитов супрессоров их вычисляют как часть от Тлимфоцитов и переводят в абсолютное значение. Параллельно определяют содержание нормальных антител к эритроцитам барана в сыворотке крови обследуемых, для чего из 2-й порции крови отделяют сыворотку, путем выдерживания цельной крови в течение 30 минут при 37°С. Отделенную сыворотку раститровывают в объеме 0,05 мл в 0,15 М растворе NaCI. К каждому двукратному разведению сыворотки крови прибавляют 1% взвесь эритроцитов барана в объеме 0,05 мл. Через 12 часов учитывают результаты реакции и по конечному разведению сыворотки, в котором регистрируют "зонтик". При регистрации титра 1:16 1:64 и содержании популяции лимфоцитов Тсупрессоров ниже 0,33 Г/п регистрируют состояние хронического перегрева. Пример. Больной П., 45 лет, с подозрением на хронический перегрев. Стаж работы в нагревающем микроклимате 10 лет. Тепловая устойчивость эритроцитов 200 сек. У больного забирают из локтевой вены кровь. Делают мазок крови, определяют содержание лейкоцитов. Затем из одной порции крови вышеуказанными методами определяют содержание субпопуляции лимфоцитов Тсупрессоров и получают значение 0,35 Г/л. Из вто рой порции крови отделяют сыворотку. 0,05 мл сыворотки раститровывают в соотношении 1:1 в 0,05 М растворе NaCl до разведения 1:256. К каждому разведению прибавляют 0,05 мл 1% взвеси эритроцитов барана. Инкубируют при комнатной температуре в течение ночи. Последнее разведение давшее "зонтик" соответсвует 1:4, что ниже диагностического титра. Следовательно, у больного нет хронического перегрева. Пример 2. Больной Н., 35 лет, с подозрением на хронический перегрев. Стаж работы в нагревающем микроклимате 6 лет. Тепловая устойчивость эритроцитов - 200 сек. Делают клинический анализ крови, выделяют лимфоциты и определяют содержание популяции лимфоцитов Т-супрессоров, что составляет 0,20 Г/л. Определяют титр нормальных антител к эритроцитам баран, что составляет 1:16. Таким образом, содержание субпопуляции Т-лимфоцитов супрессоров 0,20 Г/л, а титр нормальных антител к эритроцитам баран 1:16, что свидетельствует о наличии у него хронического перегрева. Пример 3. Больной К., 36 лет, с подозрением на хронический перегрев. Стаж работы в нагревающем микроклимате 4 года. Тепловая устойчивость эритроцитов -180 сек. Делают клинический анализ крови, выделяют и определяют содержание популяции лимфоцитов Т-супрессоров, что составляет 0,95 Г/л. Определяют титр нормальных антител к эритроцитам барана, который соответствует 1:128. Следовательно, данный больной по иммунограмме не вписывается в диагноз хронического перегрева. Следует в данном случае собрать дополнительную информацию и предположить острый перегрев. Необходимо наблюдение в динамике. Источники информации 1. Пефтиев И.Ф., Максимович В.А., Головнева О.М. Диагностика хронических перегреваний горнорабочих. Метод. рекомендации МЗ УССР, РЦНМИ. Киев, 1989. - 2 с. 2. Валуцина В.М., Семенова Т.Н., Афанасьева Р.Ф., Войнар Р.А., Пефтиев И.Ф., Головнева О.М., Лихачева Е.И., Филатова Р.И. Хронический перегрев у горнорабочих угольных шахт и металлургических цехов (критерии диагностики, клиническая характеристика, трудовые рекомендации). Информ. письмо. Проблемная комиссия "Научные основы труда профессиональной патологии. - Москва, 1990. - 9 с. 3. Пефтиев И.Ф. Критерии диагностики хронического перегрева у горнорабочих глубоких угольных шахт // Врачебн. дело, 1992. - № 8. - С. 10-15. 3 29675 Таблица Некоторые показатели иммунитета у горнорабочих угольных шахт Донбасса, работающих в условиях нагревающего микроклимата при перегреве Популяция, субпопуляция лимфоцитов Показатель Лейкоциты Лимфоциты Группа обследованных Работающие в нагревающем микроклимате Хронический перегрев Здоровое население Донецкого региона Т Т-супрессоры Т-хелперы В Титр нормальных антител к эритроцитам барана 1:1 Г/л Г/л Г/л Г/л Г/л Г/л 7,73±0,6 3,25±0,3 1,5±0,03 1,1+0,02 0,56±,02 0,77±0,07 1:1 - 1:8 log25±0,18 6,2±0,4 1,96±0,5 0,8±0,08 0,19±0,04 0,4±0,08 0,4±0,15 1:16 - 1:64* log2.5±0,4 5,47±0,2 2,22±0,06 1,1±0,6 0,35±0,03 0,58±0,04 0,84±0,06 1:1 - 1:8 log25,2±0,6 * При Р