Спосіб прогнозування виживаності хворих на м’якотканинні саркоми молочної залози

Спосіб прогнозування виживаності хворих на м'якотканинні саркоми молочної залози, що включає імуногістохімічний аналіз клітинного складу пухлини, який відрізняється тим, що в полі зору визначають процентне співвідношення клітин, які експресують білок, що кодується геном множинної лікарської стійкості, і загального об'єму пухлинних клітин, і при його величині, рівній або меншій 5 % цитоплазми пухлинних клітин, визначають високі показники виживаності, а при наявності більше 5 % пухлинних клітин - низькі показники виживаності. (19) (21) u200711827 (22) 26.10.2007 (24) 25.01.2008 (72) ЧЕХУН ВАСИЛЬ ФЕДОРОВИЧ, UA, ЗАХАРЦЕВА ЛЮБОВ МИ ХАЙЛІВНА, U A, Г АЛАХІН КОСТЯНТИН ОЛЕКСАНДРОВИЧ, UA, СМОЛАНКА ІВАН ІВАНОВИЧ, U A, ЛУК'ЯНОВА Н АТАЛІЯ ЮРІЇВНА, UA, ШУЛІГА-НЕДАЙ ХЛЄБОВА ОКСАН А ВАСИЛІВНА, U A (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ОНКОЛОГІЇ" АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ, UA, ДЕРЖАВН А УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ П АТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ ТА РАДІО 3 29861 хлинної тканини. Парафінові зрізи товщиною 46мкм, монтуються на скельця, покриті полі-Lлізіном або на скельця з адгезивними властивостями Super Frost Plus (Німеччина) і залишаються на добу в термостаті при 37°С, або ж на 30 хвилин в термостаті при 56°С у разі застосування скелець (Super Frost Plus). У день проведення імуногістохімічної реакції проводиться депарафінування та обезводнювання зрізів. Для оптимального імуногістохімічного визначення експресії антигенів проводять демаскування антигенів, шляхом обробки зрізів 0,06%-вим розчином трипсину протягом 10 хвилин при 37°С або здійснюють обробку зрізів в мікрохвильовий печі в розчині цитратного буферу (рН - 6,0). Всі інкубаційні цикли, що передбачені при імуногістохімічному виявленні антигенів, проводять у вологій камері при кімнатній температурі. Для зменшення неспецифічного забарвлення на зрізи наносять 1% розчин бичачого сироваткового альбуміну (BSA), оскільки білки, що входять до його складу, займають усі високозаряджені неспецифічні ділянки, з якими може відбутися неспецифічне зв'язування моноклональних антитіл (МКАТ). Потім проводять інкубацію препаратів з первинними МКАТ в оптимальному розведенні протягом однієї години. Через годину зрізи відмивають 3 рази у забуфериному фізіологічному розчині (ЗФР). Після цього на скельця зі зрізами наносять кролячу сироватку проти імуноглобулінів миші в надлишковому титрі на годину. Далі скельця зі зрізами знову відмивають в ЗФР та інкубують з пероксидаза-анти-пероксидаза (ПАП) комплексом протягом 45 хвилин. Після відмивання ПАП комплексу, що не зв'язався з кролячою антимишиною сироваткою проводять реакцію імуногістохімічного визначення активності пероксидази. Якщо для візуалізації застосовують систему «EnVision», яку наносять після МКАТ, то гістохімічне визначення активності пероксидази проводять безпосередньо через 30 хвилин інкубації з вищевказаною системою. Після виявлення активності пероксидази або лужної фосфатази зрізи тканини пухлин дофарбовують гематоксиліном протягом 23хв. і укладають в бальзам або Faramount Aqueous Mounting Medium (DacoCytomation, Данія). Оцінку результатів фарбування проводять за допомогою світлового мікроскопу (збільшення х 200, 400). Пухлину вважають негативною за P-gp, якщо в тканині пухлини відсутня реакція з антитілами, або кількість пофарбованих клітин менша за 5%, і позитивною за маркером, якщо пофарбовано більш 4 5% цитоплазми пухлинних клітин з інтенсивністю 2+/3+ (Фіг.1, Фіг.2). Встановлено, що коли рівень експресії становить більше 5% цитоплазми пухлинних клітин визначають низькі показники виживаності, а при наявності менш ніж 5% - високі показники виживаності. Прикладами конкретного виконання заявленого способу можуть бути виписки з історій хвороб двох пацієнтів. 1. Хвора У., 47 років. Історія хвороби №201461. У Київському міському онкологічному диспансері діагностовано фібросаркому молочної залози, яка була хірургічно видалена 12.09.2002р. з встановленням мікроскопічного діагнозу pT2N0M0 (патогістологічне заключення №2424554/02). Після хірургічного видалення пухлини за правилами загальноприйнятої технологічної процедури обробки біологічного матеріалу вироблявся парафіновий блок. ІГХД експресії білка P-gp було проведено на парафінових зрізах пухлинної тканини за вищевказаною методикою. В результаті проведення ІГХД встановлено експресію P-gp на рівні 70%, що розглядається як присутність високого ступеню експресії та оцінюється як прогноз несприятливий. Незважаючи на радикальне лікування СМЗ, через 15 місяців від дати встановлення діагнозу розвинулись множинні метастази, а через 24 місяці хвора померла. 2. Хвора Л., 49 років. Історія хвороби №9205818. У Київському міському онкологічному диспансері діагностовано фібросаркому молочної залози, яка була хірургічно видалена 19.06.1996р. з встановленням мікроскопічного діагнозу pT2N0M0 (патогістологічне заключення №40558/05). Після хірургічного видалення пухлини за правилами загальноприйнятої технологічної процедури обробки біологічного матеріалу вироблявся парафіновий блок. ІГХД експресії P-gp було проведено на парафінових зрізах пухлинної тканини по загальновизначеній методиці. В результаті проведення ІГХД встановлено експресію на рівні 0%, що розглядається як відсутність експресії та оцінюється як сприятливий прогноз. В результаті проведеного радикального лікування СМЗ протягом 10 років метастази не розвинулись і хвора жива. Таким чином, за заявленим способом показник рівня експресії P-gp принципово корелює з розвитком метастазів, строками летальності та виживаності хворих на СМЗ, що свідчи ть про його об'єктивність. Спосіб виконано у 54 хворих на СМЗ і узагальнені результати представлені в таблиці. 5 29861 6 Таблиця Прогностична оцінка перебігу СМЗ Рівень експресії Р-gp Негативний 29 осіб Позитивний 25 осіб Статус пацієнта Живих 25 осіб Померлих 4 особи Живих 9 осіб Померлих 16 осіб Ризик метастазування Прогноз хвороби Виникнення метастазів в абс.ч. (%) Досліджений термін виживаності Низький Сприятливий 6 (21%) До 5 років Високий Несприятливий 9 (36%) Від 5 до 10 років Джерела інформації: 1. Nash A.D. Soft tissue sarcomas: histological diagnosis. - New-York: Raven Press, 1989. - P. 6376. 2. Breast sarcomas / H. Ohta, T. Komibuchi, N. Nishio et al. // Annals Nuclear Medicine. - 1997. - Vol. 11, №37. - P. 1239-1247. 3. Brennan M.F., Casper E.S., Harrison L.B. Soft tissue sarcoma // Cancer Principles & Practice Oncology. - 2001. - Vol. 6, №2. - P. 1731-1852. 4. Пат. №2282852, RU, МПК G01N33/48. Метод прогнозирования течения множественной миеломы / Бакиров А., Калимулина Д., Бакиров Б., Викторова Т. (RU). - 3. №2005106447/15; Заявл.09.03.2005; Опубл.27.08.2006 (прототип). 7 Комп’ютерна в ерстка А. Крулевський 29861 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601