Спосіб визначення стійкості мембрани поодинокої клітини у розчині кріопротектора

Спосіб визначення стійкості мембрани поодинокої клітини у розчині кріопротектора, що включає 3 34333 трат праці та принципово не може використовуватися для поодиноких клітин. Відомим є спосіб виявлення пошкодження мембран еритроцитів [3], який був обраний за прототип. Згідно зі способом пробу суспензії клітин, яка аналізується, піддають дії каліброваного імпульсного електричного поля з напруженістю 1800В/см та тривалістю імпульсу 5-6мс. Як експериментальний параметр використовують оптичну щільність проби. За збільшенням швидкості гемолізу у порівнянні з нормою виявляють пошкодження мембран еритроцитів під впливом різних хімічних агентів, наприклад, ефіру. Однак цей спосіб має ряд недоліків. Перш за все він не може бути використаний для визначення стійкості мембрани поодинокої клітини до дії кріопротектора. Причина полягає в тому, що, згідно способу, суспензію клітин піддають дії каліброваного електричного імпульсу, який є фіксованим за амплітудою та тривалістю. Даний спосіб є придатним лише для суспензії клітин, тоді як для поодинокої клітини вживатися не може. Параметр, що реєструється, є інтегральним для всієї популяції клітин в суспензії. Реальна величина напруженості поля у розчині безпосередньо біля кожної клітини буде не постійною в силу його ослаблення власним полем клітини та сусідніх з нею клітин. Оскільки дослідження проводяться у сольовому розчині із застосуванням імпульсу великої тривалості, ослаблення поля може бути викликано також і поляризацією електродів. Для поодиноких клітин такий спосіб не є придатним через великий розкид значень електричних характеристик окремих клітин. Тривалість імпульсу тому й обрана такою великою у цьому способі, щоб забезпечити достатню енергію дії на суспензію клітин у провідному сольовому розчині. По-друге, розчини, що містять кріопротектори, є слабко провідними середовищами. Тому імпульс такої тривалості (енергії), що забезпечує задану напруженість поля, викличе локальне виділення великої кількості тепла, що, в свою чергу, призведе до швидкої та необоротної денатурації білків поодинокої клітини під дією високої температури. Більш того, деякі кріопротектори можуть проявляти такий мембранотропний ефект, який можна помітити вже при дії полів із значно меншою, ніж у прототипі, напруженістю. Крім того, вимірювання експериментального параметра оптичної щільності суспензії після дії електричного імпульсу потребує тривалого часу. Враховуючи все це, буде набагато простіше та коректніше поступово збільшувати напруженість поля шляхом дії зростаючим за амплітудою коротким імпульсом на поодиноку клітину у досліджуваному розчині кріопротектора. При цьому під час цієї дії можна безпосередньо слідити за зміною інтегральної електричної провідності поодинокої клітини. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити відомий спосіб таким чином, щоб він, шляхом застосування короткого електричного імпульсу із зростаючою амплітудою, забезпечував можливість виявлення пошкодження мембрани 4 поодинокої клітини у розчині кріопротектора, а також зменшити витрати часу та праці. Ця задача вирішується тим, що у відомому способі, який включає вплив імпульсного електричного поля на клітину, згідно з корисною моделлю, напруженість поля збільшують рівномірно від нуля до 3,5кB/см із тривалістю імпульсу 50мкс, обчислюють електричну провідність клітини при кожному значенні напруженості та будують графік залежності провідності від напруженості, за характером якої визначають стійкість клітинної мембрани до дії кріопротектора. Перевага способу, що заявляється, полягає в тому, що, на відміну від прототипу, він дозволяє визначити стійкість мембрани поодинокої клітини у розчині кріопротектора за характером росту її провідності при рівномірній зміні напруженості поля. При цьому енергія діючого електричного поля знижена на два порядки, а час вимірювання та загальні витрати праці є нижчими у 2-3 рази. Сутність корисної моделі пояснюється кресленнями. На Фіг.1 представлені залежності провідності ооцитів миші від напруженості імпульсного електричного поля у розчинах різних кріопротекторів гліцерину, етиленгліколю (ЕГ), 2,3-бутандіолу (2,3БД), ацетаміду (АЦ), фо-рмаміду (ФА), діметилсульфоксіду (ДМСО) та са харози. На Фіг.2 представлені залежності провідності від напруженості поля розчинів цих кріопротекторів, але без клітин. Спосіб здійснюють таким чином. Між мікроелектродами, що занурені у розчин кріопротектора, поміщають клітину, яка була експонована у цьому розчині заздалегідь, подають електричний імпульс із заданою амплітудою, яка рівномірно збільшується, та тривалістю не більш, ніж 50мкс. Параметри імпульсу, що діє, обирають такими, щоб енергія поля була значно меншою ніж та, що викликає необоротний електричний пробій мембрани. За струмом крізь клітину, що вимірюється, та падінням напруги на ній розраховують провідність, яка містить інформацію про стан мембрани під час взаємодії її з кріопротектором у розчині. Розраховані значення провідності наносять на графік залежно від напруженості поля. За характером отриманої залежності визначають стійкість мембрани клітини до дії кріопротектора. При незначному підвищенні провідності з різким зростом наприкінці (пробоєм) стійкість мембрани вважають низькою. Навпаки, рівномірно зростаюча провідність без ознак різкого зросту наприкінці свідчить про суттєву стійкість мембрани та стабілізуючу дію на неї кріопротектора. Присутність у розчині кріопротекторів, що належать до різних класів хімічних сполук, неоднаково впливає на провідність клітини. За характером цього впливу можна оцінювати стійкість мембрани клітини до дії кріопротектора (Фіг.1). Приклад 1. Нативні ооцити миші двічі відмивали від сольового розчину Дюльбекко для видалення слідів солі. Потім ооцит занурювали у краплю досліджуваного розчину кріопротектора, що містив ізотонічну концентрацію сахарози. Ооцити тримали у роз 5 34333 чині проникаючого кріопротектора протягом 5-10 хвилин для ефективного насичення клітин кріопротектором та запобігання подальших змін клітинного об'єму під час експерименту. Потім зразки були перенесені на предметний столик світлового мікроскопа. В краплю розчину кріопротектора з клітиною занурювали мікроелектроди таким чином, щоб клітина опинилася між ними. Далі на мікроелектроди подавали імпульсну напругу із лінійно зростаючою від нуля амплітудою. Тривалість імпульсу не перевищувала 50мкс. Потім визначали струм, що протікав крізь ооцит миші під час дії імпульсу. Знаючи напругу та стр ум, розраховували електричну провідність клітини. Розраховані значення провідності клітини в середовищі з кріопротектором наносили на графік залежно від напруженості поля. Напруженість, яку розраховували наперед на підставі значень амплітуди імпульсу і відстані між електродами, змінювалася від нуля до 3,5кB/см. За характером одержаної залежності провідності клітини від напруженості поля визначали ступінь стійкості її плазматичної мембрани в розчині даного кріо-протектора. Для ооцитів миші, що були експоновані у розчинах кріопротекторів, які належать до класу спиртів, характерні відносно великі значення електричної провідності та загальне зростання її залежності в 2-3 рази із збільшенням напруженості поля від нуля до максимуму (Фіг.1). Вплив на клітинну мембрану кріопротекторів цього класу хімічних сполук виявляється також у великій швидкості росту провідності вже при невеликих значеннях напруженості поля, а по досягненні максимального значення напруженості поля провідність незначно зменшується (Фіг.1, ЕГ і 2,3-БД), без спостереження необоротного електричного пробою мембрани, що свідчить про стабілізуючий вплив кріопротекторів цього класу на плазматичні мембрани. Таким чином, стійкість мембрани у розчинах кріопротекторів класу спиртів є максимальною. У розчинах кріопротекторів, що належать до класу амідів та сахарів провідність ооцитів миші характеризуються невеликими значеннями та незначною швидкістю росту її залежності від напруженості поля (не більш, ніж у 1,5 рази), аж до електричного пробою, що спостерігався при напруженості 2,8-3,1кB/см. Слід відмітити, що в усьому діапазоні напруженості поля має місце багатократна оборотна електропорація мембрани (Фіг.1), що помітно з характерних коливань провідності клітини. Таким чином, у розчинах цих кріопротекторів клітинна мембрана поступово електропорується, після чого завжди настає електричний необоротний пробій мембрани, що означає її надто велику нестійкість. Особливе місце серед кріопротекторів займає ДМСО. Значення провідності ооцитів миші у його присутності у декілька разів нижче, ніж у спиртах, 6 але характер залежності провідності від напруженості є такий самий, як і у спиртах - загальний зріст провідності був ви ще, ніж у 2 рази. Необоротний електричний пробій мембрани і лізис клітин не спостерігався (Фіг.1). Це дозволяє зробити висновок про стійкий стан мембрани ооциту у розчині ДМСО. Приклад 2. Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, але клітини у розчинах кріопротекторів були відсутні. Залежності провідності саме розчинів цих кріопротекторів фактично є безсистемними і не мають таких особливостей, які мають залежності клітин. Також треба відмітити, що значення провідності розчинів є набагато меншими, ніж відповідні значення для клітин (Фіг.2). Це є доказом того, що особливості залежностей провідності, які були відмічені у прикладі 1, можуть бути пояснені тільки присутністю клітин у розчині кріопротектора та впливом кріопротекторів на плазматичні мембрани клітин. Відомо, що ДМСО і ЕГ є одними з найбільш ефективних кріопротекторів для кріоконсервування ооцитів миші. Кріопротектори з класу амідів, навпаки, не забезпечують надійний захист цих клітин, хоча і входять до складу багатьох кріозахисних середовищ. Порівнюючи цю інформацію із відповідними залежностями провідності на графіку (Фіг.1), можна відмітити, що ДМСО і ЕГ викликають більш суттєвий відносний зріст провідності клітини в усьому діапазоні напруженості поля, ніж ФА або АЦ. Отримані результати дозволяють зробити висновок про те, що існує зв'язок між ступенем впливу кріопротекторів на електричну провідність клітини та їх захисними властивостями - чим вище відносна електрична провідність клітини у розчині кріопротектора, тим вище його кріозахисні властивості. Спосіб, що пропонується, дозволяє досліджувати характер поведінки провідності поодинокої клітини у широкому діапазоні напруженості імпульсного поля у розчинах різних кріопротекторів, що, в свою чергу, дозволяє підвищити інформативність про стан плазматичної мембрани клітини під впливом кріозахисних агентів. Спосіб також відкриває можливість прогнозувати їх е фективність під час кріоконсервації та вести цілеспрямований пошук нових та ефективних кріозахисних середовищ на їхній основі. Джерела інформації 1. Чекурова Η.P., Кислов Α.Η., Вепринцев Б.Н. Действие криопротекторов на электрические характеристики клеточной мембраны эмбрионов мыши //Криобиология. -1990.- №1. -С.25-29. 2. Пат. РФ №2269127, G01N33/49, 2006г. 3. Пат. України №13838, G01N33/483, G01N21/64, 2006р. 7 Комп’ютерна в ерстка Л.Литв иненко 34333 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601