Спосіб диференціації мікобактерій туберкульозного комплексу

Спосіб диференціації мікобактерій туберкульозного комплексу, що включає полімеразну ланцюгову реакцію шляхом створення наборів видоспецифічних праймерів, який відрізняється тим, що використовують праймери, які складаються з таких послідовностей: Мус1 5'- tcg gac gcg tat gcg ata tct gg -3', Myc2 5'- cc gac ttc tca taa acc tga gac cac tea -3', Мус3 5'- с agc ctt gtt cac aac gac ttt cgc -3', Myc4 5'- g ggg tcg gcc cag aac cgt -3'. (19) (21) u200803341 (22) 17.03.2008 (24) 11.08.2008 (46) 11.08.2008, Бюл.№ 15, 2008 р. (72) ЛИМАНСЬКИЙ ОЛЕКСАНДР ПЕТРОВИЧ, UA, ЛИМАНСЬКА ОЛЬГА ЮРІЇВН А, UA, ЛИМАНСЬКА ЛЮДМИЛА ОЛЕКС АНДРІВН А, U A (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І.МЕЧНИКОВА АМН УКРАЇНИ", U A 3 34435 собу дозволяє диференціювати штами МТК від штамів нетуберкульозних мікобактерій, які є резистентними до дії rho-нітробензойної кислоти. Істотним недоліком цього способу є неможливість видоспецифічної диференціації МТК. Крім того, серед НТМ існують штами М. kansasii та М. marinum, які є чутливими до дії rho-нітробензойної кислоти і, таким чином, існує вірогідність отримання некоректного результату аналізу. Існує спосіб детекції та типування М. tuberculosis [Kamerbeek J., Schouls L., Kolk A. et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology //J. Clin. Microbiol. -1997. -Vol.35, №4. -P.907-914], оснований на детекції за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та наступного аналізу поліморфізму довжини рестрикцій них фрагментів (ПДРФ) відмінностей в нуклеотидних послідовностях, що не повторюються (спейсерах), локалізованих між прямими повторами, виявленими у геномній ДНК МТК. Цей спосіб дозволяє детектувати та тип увати М. tuberculosis та М. bovis у клінічних зразках та зменшити час до проведення типування і, отже, встановлення остаточного діагнозу від одного або декількох місяців до 1-3 днів. До недоліків цього способу варто віднести, поперше, його трудомісткість, а по-друге, неможливість диференціювати інші види мікобактерій туберкульозного комплексу. Існує спосіб диференціації мікобактерій туберкульозного комплексу [Gaudrat F., Sauget A.S., Cottencin I. et al. Molecular identification of species within the Mycobacterium tuberculosis complex using regions of difference //Ann. Biol. Clin. (Paris). -2006. Vol.64, №1. -P.61-66], основу якого складає наявність у геномі мікобактерій областей відмінностей (region of difference, RD), зокрема RD1, RD5, RD9, RD10, які характеризують різні види МТК. Дослідження було виконано для 64 ізолятів мікобактерій, попередньо ідентифікованих за фенотиповими ознаками. Результати генотипування співпали з результатами, отриманими класичним методом, за винятком одного випадку, коли один штам, виділений від хворого на туберкульоз, за підсумком досліджень був ідентифікований як М. africanum, а не як М. tuberculosis. Показано, що проведення ампліфікації фрагментів ДНК областей RD1 та RD9 дозволяє ідентифікувати ізоляти Mycobacterium tuberculosis та М. bovis BCG. Ізоляти М. bovis та М. africanum можливо диференціювати шляхом проведення ПЛР з праймерами, що фланкують геномну область RD5. Область RD10 виявилася неінформативною для вирішення поставленої задачі. Недоліком вище згаданого способу є неможливість диференціації усі х видів МТК. Існує спосіб диференціації МТК [Hemandez S.M., Morlock G.P., Butler W.R. et al. Identification of Mycobacterium species by PCR-restriction fragment length polymer-phism analyses using fluorescence capillary electrophoresis //J. Clin. Microbiol. -1999. Vol.37, №11. -P.3688-3692]. В основі цього способу є ампліфікація за допомогою ПЛР з використанням флуоресцентно мічених праймерів поліморфних областей генів HSP та 16S rRNA, наступна рестрикція отриманих ампліконів із застосуванням фер 4 ментів HaeIII, BstEII та HaeIII, Cfol відповідно, а також проведення аналізу результатів шляхом флуоресцентного капілярного електрофорезу. За допомогою цього способу на основі довжини отриманих паттернів рестрикції було ідентифіковано 19 видів нетуберкульозних мікобактерій та МТК. Застосування цього способу дозволяє ідентифікува ти М. microti, але диференціація інших членів МТК неможлива, оскільки М. tuberculosis, М. bovis та М. africanum мають спільні паттерни рестрикції. Найбільш близьким є спосіб диференціації мікобактерій туберкульозного комплексу [Rasai Н., Ezaki Т., Harayama S. Differentiation of phylogenetically related slowly growing Mycobacteria by their gyrB sequences //J. Clin. Microbiol. -2000. -Vol.38, №1. -P.301-308], оснований на ампліфікації фрагментів гена gyrB, що кодує гіразу, хромосомної ДНК мікобактерій, специфічних для М. tuberculosis, М. bovis, М. mісroti та М. africanum відповідно, за допомогою семи праймерів, використання яких у різних комбінаціях дозволяє здійснювати диференціацію чотирьох основних видів МТК шляхом стандартного варіанта ПЛР. При цьому для диференціації трьох видів МТК - М. tuberculosis, М. microti та М. africanum - використовується спільний прямий праймер 756G та три видоспецифічних зворотних праймери 1450С, 1450А та 1410А відповідно. Для типування М. bo vis застосовується набір праймерів 756А-1410А. Але при візуалізації результатів ПЛР-аналізу зі зразками ДНК мікобактерій туберкульозного комплексу для М. microti та М. africanum на електрофореграмі спостерігаються смуги, які відповідають ампліконам майже однакової довжини. Це викликає необхідність у проведенні додаткових ПЛР-досліджень з застосуванням інших комбінацій розроблених праймерів, що ускладнює та подовжує процедуру ди ференціації МТК. У зв'язку з вищевикладеним в основу корисної моделі покладено задачу підвищення надійності та ефективності диференціації мікобактерій туберкульозного комплексу, одночасного визначення видів МТК в одній пробі, зниження витрат реактивів та трудомісткості шляхом забезпечення видоспецифічної детекції мікобактерій туберкульозного комплексу, що циркулюють у Європі, - М. tuberculosis, М. microti та М. bovis. Задача, яку покладено в основу корисної моделі, вирішується тим, що у відомому способі диференціації мікобактерій туберкульозного комплексу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції шляхом створення наборів видоспецифічних праймерів, згідно з кориснюї моделлю , використовують праймери, що складаються з таких послідовностей: Мус1 5'- tcg gac gcg tat gcg ata tct gg -3', Myc2 5'- cc gac ttc tca taa ace tga gac cac tea 3', Мус3 5'- с agc ctt gtt cac aac gac ttt cgc -3', Myc4 5'- g ggg tcg gcc cag aac cgt -3'. При розробці набору праймерів було проаналізовано різні гени мікобактерій туберкульозного комплексу - гени, що кодують гіразу, сечовину, плазмідну та хромосомну b-лактамази, 16S РНК, фрагменти яких можуть бути маркерами для видо 5 34435 6 специфічної детекції МТК. На теперішній час встановлено повні послідовності геномної ДНК для трьох штамів М. tuberculosis - лабораторного штаму H37Rv та двох клінічних штамів CDC1551 і HN878. Для комп'ютерного аналізу гена gyr хромосомної ДНК МТК було використано 3 ізолята М. tuberculosis, 1 ізолят М. africanum, I ізолят М. microti, а також 3 ізоляти М. bovis, які мали фрагменти гена gyr, що перекривалися. Зважаючи на те, що gyrB ген має достатню дискримінуючу потужність для диференціації близькоспоріднених видів та підвидів, нами були визначені консервативні фрагменти gyrB гена, специфічні тільки для мікобактерій туберкульозного комплексу. За допомогою комп'ютерного та термодинамічного аналізу було створено три набори видоспецифічних праймерів Мус1-Мус2, Мус1-Мус3 та Мус1-Мус4, які дозволяють ампліфікувати фрагмент гена gyrB, що кодує (b-суб'одиницю гірази, хромосомної ДНК М. microti, M. tuberculosis та М. bovis довжиною 130 пар нуклеотидів (п.н.), 901п.н. та 201п.н. відповідно. Досягається цей результат тим, що полімеразну ланцюгову реакцію проводять в три етапи, при цьому перший етап в один цикл включає початкову інкубацію - 95°С, 2хв., другий етап в 45 циклів включає денатурацію 95°С, 1хв.; відпал - 58°С, 1хв.; синтез (елонгацію) 74°С, 1хв., третій етап в один цикл включає один цикл - елонгацію - 74°С, 4хв. Продукти ампліфікації візуалізують шляхом проведення електрофорезу в 2%-ому агарозному гелі. Розроблені праймери оптимізовано таким чином, що можливе проведення мультиплексної ПЛР. Корисна модель, що пропонується, ілюстрована конкретними прикладами. Приклад 1. Фрагмент множинного вирівнювання гена gyr, що кодує гіразу, для ізолятів M. tuberculosis, M. africanum, M. microti та M. bovis. Наведений зворотний праймер Мус2 має на 3’-кінці нуклеотид, що не збігається для ізолятів M. tuberculosis, M. africanum та M. bovis, що дозволяє здійснювати видоспецифічну детекцію M. microti шляхом ПЛР з набором праймерів Мус1 - Мус2. Для ізолятів наведено номери в базі даних EMBL. Чорна смуга під секвенованими послідовностями вказує на наявність висококонсервативних локусів, а провал на неспарений нуклеотид у комплексі праймероднонитковий амплікон. Крапками показано нуклеотиди, що збігаються з консенсусною послідовністю ізоляту GY00005 М. tuberulosis. Приклад 2. Фрагмент множинного вирівнювання гена gyr, що кодує гіразу, для ізолятів М. tuberculosis, М. africanum, М. microti та М. bovis. Наведений зворотний праймер Мус3 має на 3'-кінці нуклеотид, що не збігається для ізолятів М. microti, М. africanum та М. bo vis, що дозволяє здійснювати видоспецифічну детекцію М. tuberculosis шляхом ПЛР з набором праймерів Мус1 - Мус3. 7 34435 Таким чином, у даній корисній моделі представлено три набори праймерів для полімеразної ланцюгової реакції для видоспецифічної детекції мікобактерій туберкульозного комплексу, які до Комп’ютерна в ерстка Л.Литв иненко 8 зволяють за допомогою мультиплексної ПЛР диференціювати збудники туберкульозу М. tuberculosis, М. microti та М. bo vis. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП“Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601