Спосіб виділення мікобактерій туберкульозу з патологічного матеріалу хворих

Спосіб виділення мікобактерій туберкульозу з патологічного матеріалу хворих, що включає підго товку патологічного матеріалу, його обробку активатором росту мікобактерій з наступною інкубацією у термостаті протягом 24-48 годин, приготування поживного середовища, висів патологічного матеріалу на поживне середовище та облік результатів, який відрізняється тим, що перед висівом патологічного матеріалу до свіжо приготовленого поживного середовища, охолодженого до 40°С після стерилізації в автоклаві, додають стерильні розчини кетоконазолу, інтраконазолу та гентаміцину при співвідношенні концентрацій 1 0,5 1 на 1,0мл середовища ВІДПОВІДНО Винахід відноситься до галузі медицини, а саме до медичної мікробіологи і може бути використаний для виділення збудників туберкульозу М tuberculosis, M bovis з патологічного матеріалу хворих До цього часу ні в Україні, ні в інших державах немає єдиних уніфікованих способів виділення збудника туберкульозу з патологічного матеріалу хворих Відомий спосіб виділення мікобактерій туберкульозу з патологічного матеріалу хворих, що включає підготовку патологічного матеріалу, його обробку активатором росту мікобактерій з наступним термостатуванням, приготування поживного середовища, висів патологічного матеріалу на поживне середовище та облік результатів (див Журило О А і співавт Мікробіологічні методи обстеження хворих на туберкульоз на підставі нових даних про особливості біологічного розвитку М tuberculosis Метод, рекомендації - Київ 2001 С16-19) До середовищ, які дають можливість прискореної мікробіологічної діагностики туберкульозу належить відоме агаризоване поживне середовище ВКГ зі стимулятором росту, виробництва ДЕЗМП ІБОНХ НАНУ спільно з ЗАТ Танза" На середовищі ВКГ можна виявити ріст комплексу М tuberculosis/bovis у вигляді жовтуватих непрозорих колоній або газонного росту, як правило, на другутретю, інколи на четверту добу - на агаризованому середовищі ВКГ також дають ріст ІНШІ, близькі роди сімейства Actmomycetaceae (22-29 класи "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9 th Edition") до якого також відноситься збудник туберкульозу (21 клас "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9 th Edition"), які можуть бути помилково прийняті за представників комплексу М tuberculosis/bovis, оскільки морфологічно з ними схожі В основу винаходу поставлене завдання удосконалити спосіб виділення мікобактерій туберкульозу з патологічного матеріалу хворих, в якому шляхом введення в середовище ВКГ кетаконазолу, штраконазолу та гентаміцину досягається шпбіція інших, близьких до комплексу М tuberculosis/bovis, видів сімейства Actmomycetaceae і тим самим підвищується точність виділення мікроорганізмів саме комплексу М tuberculosis/bovis, що в свою чергу підвищує точність мікробіологічної діагностики туберкульозу Поставлене завдання вирішується тим, що у способі виділення мікобактерій туберкульозу з патологічного матеріалу хворих, що включає підготовку патологічного матеріалу, його обробку активатором росту мікобактерій з наступним термостатуванням, приготування поживного середовища, висів патологічного матеріалу на поживне середовище та облік результатів, згідно з винаходом, перед висівом патологічного матеріалу до свіжо приготованого поживного середовища, охолодженого до 40°С після автоклавування, додають сте Однак даний спосіб має такий суттєвий недолік (О (О 61674 рильні розчини кетоконазолу, штраконазолу та гентаміцину при співвідношенні концентрацій 1 0,5 1 на 1,0мл середовища ВІДПОВІДНО Кетоконазол являє собою синтетичне похідне імідазолдюксолана Спричиняє фунгіцидну і фунпстатичну дію у відношенні дерматофітів, дріжджів (роду Candida, Pittyrosporum, Torulopsis, Cryptococcus), диморфних і вищих грибів (еуміцетів) Не ефективний при інфікуванні видами Aspergillus Фармакологічні властивості обумовлені здатністю впливати на клітинну мембрану грибів За рахунок взаємодії з ферментом 14-адеметилазою кетоконазол інгібує біосинтез ергостеролу, есенціального компонента мембрани, з ланостеролу Подібно іншим азольним сполукам механізми протигрибкової дії кетоконазолу включають пригнічення процесів клітинного дихання, взаємодію з фосфоліпідами мембрани, порушення трансформації дріжджових грибів у міцеліальні форми, пригнічення захоплення пурину, порушення синтезу тригліцеридів і/або фосфоліпідів У високих концентраціях кетоконазол спричиняє пряму фізико-хімічну дію на мембрани грибів, виявляючи фунгіцидний ефект Інтраконазол похідне триазолу, синтетичний протигрибковий засіб, активний у відношенні широкого спектру збудників Механізм дії штраконазолу обумовлений інгібуванням синтезу ергостеролу - важливого компоненту клітинної мембрани грибів До препарату чутливі аспергіли та ІНШІ гриби Гентаміцина сульфат - антибіотик, який продукує Micromonospora purpurca Відноситься до групи антабютиків - аміноглікозидів Спричиняє бактеріостатичну дію по відношенню до багатьох грампозитивних і грамнегативних мікроорганізмів Аміноглікозиди реагують з 30S субодиницею рибосоми, утворюючи незворотній комплекс з одним з рибосомальних білків Тим самим блокуються функції рибосоми в цілому У відношенні туберкульозної палички гентаміцин неактивний До родини Actmomycetaceae відносять групу мікроорганізмів, що позначаються як нокардюформні її представники утворюють нитки, що галузяться, ІНОДІ розділяються на паличковидні та коковидні структури За рядом властивостей дуже схожі на мікобактерії туберкульозу БІЛЬШОСТІ фахівців важко розпізнавати нокардюзні ураження, приймаючи їх за туберкульоз різних органів Дослідним ШЛЯХОМ встановлено, що при додаванні до поживного середовища ВКГ кетоконазолу, штраконазолу та гентаміцину при співвідношенні концентрацій 1 0,5 1 на 1,0мл середовища ВІДПОВІДНО інгібується ріст нетуберкульозних видів мікроорганізмів сімейства Actmomycetaceae, в результаті чого вони не ростуть на такому середовищі Це дозволяє підвищити точність виділення мікроорганізмів саме комплексу М tuberculosis/bovis, що в свою чергу підвищує точність мікробіологічної діагностики туберкульозу Спосіб здійснюють таким чином Після отримання патологічного матеріалу з метою деконтамшацм та гомогенізації проводять його передпосівну обробку згідно загальноприйнятих методик - кислотами, лугами або різними детергентами, центрифугують, отриманий осад для посіву на середовище ВКГ обробляють активатором росту в співвідношенні 1 1 Суспензію шкубують при температурі 37,0±1,0°С протягом 24-48 годин Поживне середовище ВКГ готують безпосередньо перед застосуванням Для цього беруть 9,0г сухого середовища ВКГ, розмішують його в 100,0мл дистильованої води, кип'ятять 2-3 хвилини до повного розплавлення агару, фільтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають у ВІДПОВІДНИЙ посуд, стерилізують при 120,0±1,0°С протягом 15 хвилин у автоклаві Перед висівом патологічного матеріалу до свіжо приготованого середовища, охолодженого до 40°С додають стерильні робочі розчини кетоконазолу, штраконазолу та гентаміцину при співвідношенні концентрацій 1 0,5 1 на 1,0мл середовища ВІДПОВІДНО, ПІСЛЯ ЧОГО ретельно струшують суміш Далі в асептичних умовах середовище розливають в стерильні чашки Петрі шаром 6,0-8,0мм Готове поживне середовище жовтого кольору і повинно відповідати рН 7,2±0,2 Тому воду для його приготування треба брати з таким же рН Після застигання середовища негайно здійснюють посів за допомогою шприца одноразового використання у дозі 1,5мл суспензії заздалегідь підготовленого патологічного матеріалу, обробленого активатором росту Засіяні чашки герметизують скотчем з метою уникнення висихання середовища і, не перевертаючи, поміщають у термостат при температурі 37,0±1,0°С для виявлення росту мікобактерій Робочий розчин кетоконазолу готують наступним чином Таблетку, що містить 200,0мг кетоконазолу, розтирають в стерильній ступці, додають 1,0мл спирту (для дезинфекції) і 19,0мл стерильної дистильованої води Отримана суспензія містить 10,0мг/мл кетоконазолу Дану суспензію слід добавляти в середовище ВКГ із розрахунку 1,0мл на 100,0мл середовища, щоб створити там концентрацію препарату 100,0мкг/мл Робочий розчин штраконазолу готують так вміст капсули, що містить 200,0мг препарату, висипають в ступку, добавляють 1,0мл спирту і 39,0мл стерильної дистильованої води Отримана суспензія містить 5,0мг/мл, її потрібно додати із розрахунку 1,0мл на 100,0мл середовища, щоб створити там концентрацію препарату 50,0мкг/мл Робочий розчин гентаміцину готують так ампулу з 1,0мл 4,0% водного розчину препарату, тобто 40,0мг чистої речовини, розводять в 4 рази (добавляють 3,0мл стерильної дистильованої води) Отриманий розчин містить 10,0мг/мл гентаміцину, його добавляють із розрахунку 1,0мл на 100,0мл середовища, щоб створити в ньому концентрацію препарату 100,0мкг/мл Таким чином, кожен 1,0мл середовища міститиме ЮО.Омкг кетоконазолу, 50,0мкг штраконазолу і ЮО.Омкг гентаміцину Ріст КОЛОНІЙ комплексу М tuberculosis/bovis на середовищі ВКГ з кетоконазолом, інтраконазолом та гентаміцином з'являється на другу-третю, ІНОДІ четверту, добу у вигляді жовтуватих непрозорих колоній - так само, як і на середовищі ВКГ без указаних препаратів Ріст нетуберкульозних видів мікроорганізмів сімейства Actmomycetaceae інгібується, в результаті чого вони не ростуть на такому середовищі Облік результатів проводять шляхом 61674 мікроскопи, яку здійснюють ПІД імерсійною системою світлового мікроскопу У першу добу М tuberculosis мають вигляд кулеподібних і овоідних клітин, що переходять з часом у диплококові і паличкоподібні форми, котрі в свою чергу поступово переходять у колбоподібні клітини За ЦілемНільсеном бактерії в цей час не забарвлюються Однак, добре забарвлюються простими методами - розведеним фуксином або водно-спиртовим розчином метиленового синього Подальшу ідентифікацію культур комплексу М tuberculosis/bovis здійснюють за загальноприйнятими методами згідно Наказу МОЗ України №45 від 06 02 2002 року Наводимо конкретний приклад здійснення способу Після отримання патологічного матеріалу з метою деконтамінацм та гомогенізації проводимо його передпосівну обробку 10,0% розчином сірчаної кислоти Для цього в дослідний матеріал додаємо також КІЛЬКІСТЬ 10,0% розчину сірчаної кислоти і ретельно струшуємо з бусами протягом 10 хвилин Потім матеріал центрифугуємо Термін контакту харкотиння з кислотою не повинен перевищувати 20 хвилин від початку обробки Після центрифугування кислоту зливаємо, до осаду додаємо ІЗОТОНІЧНИЙ розчин хлориду натрію, центрифугуємо і надосад зливаємо, відмиваючи кислоту До осаду додаємо активатор росту мікобактерій в співвідношенні 1 1 Суспензію інкубуємо при температурі 37,0±1,0°С протягом 24-48 годин Середовище ВКГ готуємо безпосередньо перед застосуванням Для цього беремо 9,0г сухого середовища ВКГ, розмішуємо його в 100,0мл дистильованої води, кип'ятимо 2-3 хвилини до повного розплавлення агару, фільтруємо через ватно-марлевий фільтр, розливаємо у ВІДПОВІДНИЙ посуд, стерилізуємо при 120,0±1,0°С протягом 15 хвилин у автоклаві Перед висівом патологічного матеріалу до свіжо приготованого середовища, охолодженого до 40°С додаємо стерильні робочі розчини кетоконазолу, штраконазолу та гентаміцину при співвідношенні концентрацій 1 0,5 1 на 1,0мл середовища ВІДПОВІДНО, ПІСЛЯ ЧОГО ретельно струшуємо суміш Далі в асептичних умовах середовище розливаємо в стерильні чашки Петрі шаром 6,0-8,0мм Готове середовище жовтого кольо Комп'ютерна верстка А Ярославцева ру і повинно відповідати рН 7,2±0,2 Після застигання середовища негайно здійснюємо посів за допомогою шприца одноразового використання у дозі 1,5мл суспензії заздалегідь підготовленого патологічного матеріалу, обробленого стимулятором росту Засіяні чашки герметизуємо скотчем з метою уникнення висихання середовища і, не перевертаючи, поміщаємо у термостат при температурі 37,0±1,0°С для виявлення росту мікобактерій Облік результатів проводимо шляхом мікроскопи, яку здійснюємо під імерсійною системою світлового мікроскопу У першу добу М tubeiculosis мають вигляд кулеподібних і овоідних клітин, що переходять з часом у диплококові і паличкоподібні форми, котрі в свою чергу поступово переходять у колбоподібні клітини За Цілем-Нільсеном бактерії в цей час не забарвлюються Однак, добре забарвлюються простими методами - розведеним фуксином або водно-спиртовим розчином метиленового синього Подальшу ідентифікацію культур мікобактерій здійснюємо загальноприйнятими методами згідно Наказу МОЗ України №45 від 06 02 2002 року Запропонованим способом виділення мікобактерій туберкульозу з патологічного матеріалу хворих проведено 214 досліджень, які показали, що ріст сторонньої мікрофлори на середовищі з додаванням стерильних розчинів кетоконазолу, штраконазолу і гентаміцину при співвідношенні концентрацій 1 0,5 1 не спостерігається Спостерігається тільки ріст М tuberculosis і М bovis Таким чином, перевагою способу, що пропонується, є - підвищення точності виділення збудника туберкульозу з патологічного матеріалу хворих за рахунок інпбіцп інших, близьких до комплексу М tuberculosis/bovis, видів сімейства Actmomycetaceae що, в свою чергу, сприяє більш точній прискореній мікробіологічній діагностиці туберкульозу Це має велике практичне значення в зв'язку з ростом захворюваності на туберкульоз та погіршенням епідеміологічної ситуації з туберкульозу в нашій державі Спосіб виділення мікобактерій туберкульозу з патологічного матеріалу хворих, що пропонується, може знайти широке застосування в бактеріологічних лабораторіях протитуберкульозних закладів Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119