Спосіб одержання штамів мікобактерій туберкульозу для приготування вакцин

Спосіб одержання штамів мікобактерій туберкульозу для приготування вакцин, що включає посів на середовище з гліцерином і ектерицидом при температурі 38°С, який відрізняється тим, що середовище додатково містить картопляний клин і перевар Хотінгера. (19) (21) 97020457 (22) 04.02.1997 (24) 15.11.2000 (33) UA (46) 15.11.2000, Бюл. № 6, 2000 р. (72) Кочмарський Віктор Андрійович (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ 29711 1. Берут колбу с 110-120 мл перевара Хоттингера и в течение 10 минут кипятят. Затем жидкость фильтруют через ватно-марлевый фильтр. К фильтру добавляют дистиллированную воду, доводя содержание амминного азота до 100 мг% и рН до 7,0-7,2 с помощью 20% раствора едкого натрия. После чего в перевар Хоттингера добавляют химически чистый глицерин из расчета 0,5%. 2. Картофельные клубни тщательно моют в теплой воде и очищают от кожуры. Затем вырезают металлическим пробойником цилиндры шириной 20 мм и длиной 50 мм, которые разрезают по диагонали так, чтобы они имели форму клиньев. После этого картофельные клинья помещают в Концентрация эктерицида в среде, % Кратность пассажа 1% раствор двууглекислой соды на 1 час. Затем берут стерильные пробирки с перетяжкой в нижней части (РУ) и заполняют жидкой средой так, чтобы опущенный конец картофельного клина касался жидкости. Пробирки с питательной средой помещают в автоклав для стерилизации при температуре 120°С в течение 20 минут. Среду проверяют на стерильность в термостате и хранят при температуре +4°С. Перед пассажем культур возбуди теля туберкулеза в пробирки вносят стерильным шприцем с иглой длиной 10 см мутаген эктерицид в концентрации 3-15% в зависимости от количества проведенного пассажа по следующей схеме: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 1 2 2 3 2 2 3 5 3 4 3 5 20 Пример В опыт взяты 5 эпизоотических культур возбудителя туберкулеза бычьего вида, выделенные от убитого крупного рогатого скота на среде Левенштейна Иенсена. Культуры пересевали в две пробирки со средой и мутагеном, описанными выше. После посева культур на питательной среде с мутагеном ватно-марлевые пробки обжигали над пламенем горелки, пропитывали парафином и закрывали. Пробки с посевами инкубировали в термостате при +38°С в течение 20-25 дней. Учет результатов посевов проводили через каждые 7 дней. Контроль снижения патогенных свойств у пассажированных культур осуществляли заражением подкожно в области паха по 5-6 морских свинок в дозе 1 мг бактериальной массы в мл стерильного физиологического раствора. Результаты аттенуации патогенных свойств микобактерий туберкулеза бычьего вида представлены в таблице. Представленные в таблице результаты исследования, полученные предлагаемым способом, свидетельствуют о том, что у 2-х культур из 5 через 9 пассажей обнаружена тенденция снижения патогенности. При этом выявили средний индекс поражения, у морских свинок. Через 22 пассажа у 3-х культур обнаружили слабый индекс поражения для морских свинок, у 1 культуры выявили отсутствие патогенных свойств и у одной - средний индекс поражения для лабораторных животных. При исследовании внутренних органов у морских свинок убитых через 40 пассажей у 3-х культур выявили очень слабый индекс поражения для морских свинок и у 2-х культур послеубойным исследованием лабораторных животных не выявили туберкулезных поражений во внутренних органах. На заключительном этапе пассирования у 5 культур была достигнута полная утрата патогенности для лабораторных животных. Сравнительный анализ полученных данных показал, что предлагаемый способ реализуется в относительно-короткий срок, особенно патогенных культур, которые на жидких питательных средах не образуют пленку, используемую для пересева. Предлагаемым способом достигается эффект аттенуации, не изменяя иммуногенных свойств присущему вирулентной эпизоотической культуре. Способ универсальный, проявляющий результативность для возбудителей туберкулеза бычьего, человеческого и птичьего видов. Предлагаемым способом получены штаммы для приготовления противотуберкулезных вакцин с высокой иммуногенной активностью. 2 29711 Таблица Данные по снижению патогенных свойств, предлагаемым способом, у к ультур микобактерий бычьего вида № п/п Культуры Патогенность исходных и пассажированных культур микобактерий для морских свинок Исходные Количество пассажей культуры 9 22 40 56 1 ДИ ++++ +++ ++ + 2 3 4 5 ППСО ЭБ-УСТЬЕ ФВ МК ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ + + Примечание: Прототип Не давали рост пленки на поверхности среды -"-"-"-" - отсутствие патогенности; + очень слабый индекс поражения; ++ слабый индекс поражения; +++ средний индекс поражения; ++++ высокий индекс поражения. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 35 прим. Зам._______ __________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 __________________________________________________________ 3