Поживне середовище “аквамедіа” для культивування мікроорганізмів

1. Поживне середовище для культивування мікроорганізмів, що містить поживну основу, вуглеводи і воду дистильовану, яке відрізняється тим, що рідке, тверде та напіврідке середовища як поживну основу містять суміш лужного гідролізату з молюсків з кислотним гідролізатом з рибної сировини у співвідношенні 3:1-1:3 з кінцевою концентрацією необхідного вмісту амінного азоту 60120мг %, як вуглеводи містять глюкозу або мальтозу, а також пептон, агар, при наступному співвідношенні компонентів, г/л: U 2 34711 1 3 34711 гідролізат внутрішніх органів промислових риб з кінцевою концентрацією амінного азоту 10020,0-25,0 140мг% лактоза 9,5-10,0 натрій хлористий 4,5-5,0 агар 0,65-0,70 вода дистильована інше Недоліком відомого середовища є те, що при його виготовленні використовують тільки нехарчові відходи рибальських промислів, що обмежує сировинну базу. Крім того відомо, що рибні гідролізати недостатньо збалансовані по ряду поживних елементів, наприклад, амінокислотам. В основу корисної моделі “Поживне середовище “Аквамедіа” для культивування мікроорганізмів” поставлено задачу шляхом розширення сировинної бази забезпечити користувачів економічним та ефективним середовищем для культивування мікроорганізмів. Поставлена задача вирішується тим, що “Поживне середовище “Аквамедіа” для культивування мікроорганізмів” містить поживну основу, вуглеводи і воду. Як поживну основу використовують суміш лужного гідролізату з молюсків з кислотним гідролізатом з рибної сировини у співвідношенні 3:1-1:3. Така поживна основа містить амінний азот не менш 600мг %, і може бути розведена водою до вмісту амінного азоту в поживному середовищі, необхідного для культивування тих або інших гр уп мікроорганізмів наприклад, до 60-120мг %. Поживне середовище “Аквамедіа” для культивування мікроорганізмів готують при наступному співвідношенні компонентів, г/л: Поживна основа з кінцевою концентрацією необхідного вмісту амінного азоту, наприклад, 600,6-1,2 120мг % Глюкоза або мальтоза 30-50 Вода інше Поживне середовище “Аквамедіа” для культивування мікроорганізмів характеризується тім, що: додатково містить пептон у кількості 8-12г/л; додатково містить агар у кількості 13-20г/л. Поживна основа для середовища “Аквамедіа” готується із сировини морського ґенеза. Спосіб отримання поживної основи для мікробіологічних середовищ [див. матеріали заявки на корисна модель №а200713086 від 26.11.2007р. «Спосіб отримання поживної основи мікробіологічних середовищ»] включає здрібнювання рибної сировини, готування гомогенату рибної сировини для гідролізу шляхом розведення здрібненої рибної сировини водою, гідроліз гомогенату рибної сировини при нагріванні, прогрівання гідролізату з рибної сировини і відділення неразгідролізованих білків. При цьому гідроліз гомогенату рибної сировини здійснюють у кислотному середовищі й отриманий кислотний гідролізат змішують з виго товленим луж ним гідролізатом з молюсків у співвідношенні 3:11:3 об'єму лужного гідролізату з молюсків до кислотного гідролізату з рибної сировини. При готуванні кислотного гідролізату з рибної сировини до 4 гомогенату рибної сировини додають 18-20% розчин соляної кислоти до рН 4,5-5,0, після чого гомогенат рибної сировини нагрівають до 45-50°С протягом 22-26 годин. Потім додають концентровану ортофосфорну кислоту до залишкової концентрації кислоти на рівні 2% і здійснюють прогрівання гомогенату рибної сировини при 100°С протягом 22-26 годин. Гідролізат з рибної сировини нейтралізують додаванням 40% розчину їдкого натру до рН 6,8-7,4. При готуванні лужного гідролізату з молюсків до здрібненої сировини з молюсків додають 1,0% розчин їдкого натру в співвідношенні 1:1, після чого здійснюють гідроліз при 80°С протягом 20-24 годин. Потім гідролізат з молюсків нейтралізують додаванням концентрованої соляної кислоти до рН 6,8-7,4. Основа поживних середовищ містить амінний азот у готовому продукті не менш 600мг %, і може бути розведена водою, наприклад, до вмісту амінного азоту в живильному до середовищі 60-120мг %. Це забезпечить утримування хлориду натрію в готовому середовищі на рівні, що не буде перевищувати 0,5%, що відповідає складові м’ясопептонів, рекомендованих для культивування великої кількості видів бактерій. Нашими дослідженнями встановлено, що для досягнення оптимальної якості середовища необхідно: - введення в поживне середовище культивування мікроорганізмів як поживної основи суміші лужного гідролізату з молюсків з кислотним гідролізатом з рибної сировини в співвідношенні 3:1-1:3 доцільно в кількості 0,6-1,2г/л; - введення в поживне середовище культивування мікроорганізмів таких вуглеводів, як глюкози або мальтоза доцільно в кількості 30-50г/л; - додаткове введення в поживне середовище культивування мікроорганізмів пептону в кількості в межах 8-12г/л доцільно при виготовленні рідкого поживного середовища бактерій; - додаткове введення в поживне середовище культивування мікроорганізмів агару в кількості в межах 13-20г/л. доцільно при виготовленні твердого поживного для середовища бактерій і грибів. Випробування ростових властивостей зразків рідких, твердих і напіврідких поживних середовищ “Аквамедіа” проводили згідно з ДСТУ 4483-2005. Спочатку готовили зразки середовищ (рідкого, твердого, напіврідкого для бактерій і грибів) за рецептами 1-4, потім на них висівали тесткультури згідно з Таблицею 1. Рецепт 1. Рідке поживне середовище для бактерій. Готували з поживної основи (суміш лужного гідролізату з молюсків з кислотним гідролізатом з рибної сировини у співвідношенні 3:1-1:3) без розведення або після розведення водопровідною водою до вмісту амінного азоту 100-120мг %. До 1дм 3 рідини додавали 10г пептону ферментативного, якщо необхідно доводили рН середовища до 7,2-7,4 1%-им розчином гідроксиду натрію і стерилізували 20 хвилин при температурі 120°С, після чого в асептичних умовах додавали готовий стерильний (або стерилізований 20 хвилин при температурі 112°С) розчин глюкози медичної до вмісту її в середовищі 0,5% за сухою речовиною. 5 34711 Рецепт 2. Рідке поживне середовище для грибів. До 1дм 3 поживної основи (суміш лужного гідролізату з молюсків з кислотним гідролізатом з рибної сировини у співвідношенні 3:1-1:3), амінний азот якої доводили розведенням дистильованою водою до 60-80мг %, додавали 40г глюкози медичної або мальтози, встановлювали рН 5,8±0,2 додаванням 1-2%-го розчину соляної кислоти, розливали у стерильні пробірки і стерилізували 30 хвилин при температурі 110°С Рецепт 3. Тверде поживне середовище. 6 Для бактерій і грибів готували так саме, як відповідні рідкі поживні середовища, але з додаванням на кожний їх літр 13-20г агару мікробіологічного (у залежності від марки агару). Рецепт 4 Середовище напіврідке. Для бактерій готували так саме, як за рецептом 1; для грибів відповідно, як за рецептом 3, але перед додаванням глюкози або мальтози на кожний літр рідини додавали від 3г до 7г агару, розливали по 10см 3 у пробірки, після чого стерилізували 20 хвилин при температурі 120°С. Таблиця 1 Штами тест-культур для визначання ростових власти востей поживного середовища “Аквамедіа” для культивування мікроорганізмів Види мікроорганізмів Штами Розведення, висівання з яких повинно дати ріст Середовища, що Температура їх тестують інкубації, °С не менше, як у дво х з трьох засіяних пробірок Бактерії: Alcaligenes faecalis ДНКІБШМ №415 10-7 Напіврідке (ТГС) 30-35 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, ДНКІБШМ 27/29 10-5 Тверде (МП А) 30-35 Corynebacterium xerosis ДНКІБШМ №1911 10-6 Рідке (МПБ) 30-35 Гриб: Candida albicans ATCC 10231, ATCC 2091 ATCC 885-653 10-5 Напіврідке (ТГС), тверде і рідке для грибів 20-25 Культури бактерій і гриба, що виросли на скошеному твердому середовищі (рецепт 3) протягом 18-20 годин, а гриб Candida albicans - 24-48 годин за температурних умов, що зазначені в Таблиці 1, змивали стерильним ізотонічним розчином (0,85% розчином хлористого натрію) і їм же доводили мутність суспензії мікробних клітин до 10 одиниць за оптичним стандартом. Отриману суспензію розводили ізотонічним розчином загальновідомим способом у співвідношенні 1:10 за виключенням наступного за першим розведенням. Це (умовно друге) розведення готували з'єднанням однакових об'ємів (наприклад, по 4,5см 3) мікробної суспензії з розведення 10-1 і ізотонічного розчину. Третє й наступні розведення роблять у співвідношенні 1:10. З кожного розведення, починаючи з кінцевого, вносили по 0,1см 3 суспензій у три пробірки з досліджуваним середовищем. Alcaligenes faecalis висівали з розведень 10-6, 10-7 та 10-8; Pseudomonas aeruginosa - із розведень 10-4, 10-5 і 10-6; Corynebacterium xerosis - із розведень 10-5, 106 і 10-7, a Candida albicans - із розведень 10-4, 10-5 і 10-6. Середовище визнають придатним за ростовими властивостями, якщо відповідна бактерійна тест-культура дала видимий ріст не менше як у двох з трьох пробірок, засіяних з розведень, що наведені в Таблиці 2, не пізніше як через 48 годин, а культура гриба - через 72 годин. Допустимим є також, якщо одержані такі результати посіву: ріст відмічено не менше як у двох з трьох пробірок, що були засіяні із попереднього розведення (наприклад: для Alcaligenes faecalis – 10-6, а для Candida albicans – 10-4, і не менше як в одній пробірці з трьох під час висівання обох наступних за цим розведень, тобто для Alcaligenes faecalis це 10-7 і 10-8, а для Candida albicans відповідно 10-5 і 10-6. Інші види тест-культур – відповідно). У разі одержання інших результатів, посіви з таких розведень повторюють на подвійній кількості пробірок із середовищем. Досліджене середовище вважають придатним для випробовувань, якщо при повторному висіванні тест-культури відмічається ріст у посівах з розведень, зазначених у Таблиці 1, не менше ніж у чотирьох із шести засіяних пробірок. Тест-культури можна одержати з будь-якої міжнародної колекції штамів або в Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів (ДНКІБШМ, м. Київ). За результатами випробувань поживні середовища з трьох зразків гідролізатів відповідали вимогам ДСТУ 4483-2005. 7 34711 8 Таблиця 2 Визначення ростових властивостей середовищ з гідролізатів (№1-з мідійного гідролізату; №2 - з автолізату шпроту; №3 – середовище “Аквамедіа”) Логарифми розве- Наявність росту тест-к ультури (+) або його відсутність (-) в зразках (по три пробірки) дення тест-культури Зразок №1 Зразок №2 Зразок №3 Еталон Рідке середовище (тест-культура: Corynebacterium xerosis, еталон - МПБ) -6 +++ +++ +++ +++ -7 +++ +++ +++ +++ -8 ------+-Тверде середовище (тест-культура: Pseudomonas aeruginosa, еталон - МПА) -5 +++ +++ +++ +++ -6 +++ +++ +++ +++ -7 ++-+----+ Напівтверде середовище (тест-культура: Alcaligenes faecalis, еталон - ТГС) -7 +++ +++ +++ +++ -8 +++-+ +++--9 +----++-Середовище для грибів рідке (тест-культура: Candida albicans, еталон - Сабуро) -5 +++ +++ +++ +++ -6 +++++-+ +++ -7 -++---+-У середовищах, виготовлених з мідійних і рибних гідролізатів, був отриманий ріст тест-культур не менше як у дво х із трьох засіяних пробірках: Alcaligenes faecalis-(тест-культура для універсального напіврідкого тіогліколевого середовища для виявлення бактерій) у розведенні 10-7 і 10-8, Pseudomonas aeruginosa - (тест-культур для виявлення бактерій на МПА) відповідно 10-5 і 10-6; Corynebacterium xerosis (те ж - для МПБ) – 10-6 і 10-7, Candida albicans – 10-5 і 10-6. Таким чином - в розведенні, що є тестовим і наступним за ним Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова одержаний ріст всіх тест-культур, що свідчить про можливість використання середовища “Аквамедіа” у мікробіологічній практиці. Запропоноване поживне середовище “Аквамедіа” збагачене трофічними цінними речовинами з гідролізатів організмів різних таксономічних гр уп, переважно риб і молюсків та містить доступні вітчизняні компоненти. Властивості середовища “Аквамедіа” відповідають властивостями еталонних поживних середовищ для культивування мікроорганізмів, переважно бактерій і грибів. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601