Спосіб визначення секреції p-селектину

Спосіб визначення секреції Р-селектину, який заключається в тому, що визначають активність фактору Вілібранда в крові, проводять локальну супрасістолічну оклюзію верхньої' кінцівки протягом 5 хвилин, вдруге визначають активність фактору Вілібранда після оклюзГі, та визначають секрецію Р-селектину за ступенем збільшення активності фактора Вілібранда, приймаючи за 1 умовну одиницю 1% збільшення його активності після оклюзії. Винахід стосується медицини, а саме лабораторної діагностики, і може бути використаний для визначення секреції' Р-селектину у хворих з патологією внутрішніх органів. Р-селектин - один із компонентів системи молекул клітинної адгезії, приймає активну участь як у фізіологічних реакціях взаєглодн судинного ендотелію « клітинних елементів крові, забезпечуючи феномен крайового стояння лейкоцитів, так і у великій кількості патофізіологічних процесів, беручи участь у реакціях необоротної адгезії, трансудинноі міграції лейкоцитів, забезпечуючи тим самим рекрутування клітин крові у вогнища запалення, ділянки відкладення імунних комплексів тощо, що складає часом визначальні патофізіологічні ланки розвитку великого числа захворювань людини Існуючий на сьогоднішній день розрив щодо нашого розуміння ролі секреції Р-селектину при різноманітних патологічних станах і можливостях безпосереднього вивчення його секреції в умовах КЛІНІКИ у конкретного хворого з метою уточнення деяких патофізіологічних механізмів розвитку захворювання, визначення тактики лікування і прогнозу, лімітується відсутністю способів визначення секреції Р-селектину неінвазивним шляхом у клінічних умовах у людини, тому розробка таких способів є актуальним питанням сьогодення Відомий спосіб визначення секреції Р-селектину, що полягає у наступному: 1 Отримання первинно трипсинизованої культури ендотеліальних клітин пупочної вени людини. 2 Культивування отриманої клітинної культури стандартними способами 3. Зняття культивуємих ендотеліальних клітин з поверхні, на якій вони культивуються, стандартними способами. 4. Обробка ендотеліальних клітин специфічною антисивороткою проти Р-селектину, міченою флюорохромом. 5. Визначення експресії Р-селектину на ендотеліальних клітинах за допомогою проточного цитофлюоріметру стандартним способом. 6. Обробка ендотеліальних клітин трипсином. 7. Повторна обробка ендотеліальних клітин специфічною антисивороткою проти Р-селектину, міченою флюорохромом після обробки їх трипсином. 8. Повторне визначення експресії Р-селекти-. ну на ендотеліальних клітинах за допомогою проточного цитофлюоріметру стандартним способом. 9. Визначення секреції Р-селектину за ступенем збільшення його експресії після обробки ендотеліальних клітин трипсином з урахуванням отриманих даних (Collins P.W., Macey M.G., Cahill M.R. et all. Von Willebrand factor release and Pselectin expression is stimulated by thrombin and trypsin but not IL-1 in cultured human endothelial cells. //Thromb. Haemost-1993. -Vol. 70 (2).-P.346350). Суттєвих загальних ознак між аналогом та способом, що заявляються, немає. Однак не дивлячись на те, що існує принципова можливість визначення секреції Р-селектину ВІДПОВІДНО до зазначеного способу, він має досить вузькі, строго обкреслені області застосування - тому що дозволяє тільки вивчати секрецію Р-селектину ендотеліальними клітинами у відповідь на тестуємі біологічно активні речовини, у відповідь на зміну умов культивування тощо. Використання культури ендотеліальних клітин також звужує діапазон застосування даного способу, не дозволяючи проводи О о ю со 35190 ти визначення секреції Р-селектину в клінічних умовах у досліджуємих осіб, для яких визначення секреції Р-селектину мало б діагностичну і (або) прогностичну цінність, а у випадку одержання в них експлантантів, із котрих можливо одержати культуру ендотеліальних клітин, значно збільшується час, необхідний для одержання результатів аналізу, що зв'язано з тривалим (декілька днів) періодом культивування ендотеліальних клітин. Варто зауважити, що забір експлантантів не може бути зроблений у усіх хворих, котрим необхідно зробити визначення секреції Р-селектину, так як він зв'язаний з одержанням досить великих (до декількох сантиметрів) відрізків судин, що можливо тільки під час значних оперативних втручань - аортокоронарне шунтування, судинна пластика, операції з приводу варикозного розширення вен та інше, при яких залишаються невикористані під час операції ділянки судин. Таким чином, використання зазначеного способу не дозволяє проводити дослідження секреції Р-селектину в клінічних умовах неінвазивним шляхом. В доступній нам літературі ми не зустріли опису способу визначення секреції Р-селектину. В основу винаходу поставлено задачу розробки способу визначення секреції Р-селектину в клінічних умовах у людини. Поставлена задача вирішується* тим, що в способі визначення секреції Р-селектину новим є те, що визначають активність фактору Вілібранда в крові, проводять локальну супрасістолічну оклюзію верхньої кінцівки протягом 5 хвилин, вдруге визначають* активність фактору Вілібранда після оклюзії, та визначають секрецію Р-селектину за ступенем збільшення активності фактора Вілібранда, приймаючі за 1 умовну одиницю 1 % збільшення його активності після оклюзії. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає в наступному: Р-селектин синтезується • переважно ендотеліальними клітинами конститутивно, однак не вся його кількість, що утворена в клітині, виділяється в кровообіг. Надлишкова кількість Р-селектина накопичується в електроннощільних гранулах ендотеліальних клітин, так званих. Weibel-Paiade тілах, відкіля він може бути мобілізований у перебігу декількох хвилин. Крім того, в організмі людини здійснюється і стимульований синтез Р-селектину у відповідь на будь який .стимул, що активує ендотеліальні клітини і викликає стимуляцію системи молекул клітинної адгезії, при цьому синтезований. Р-селектин безпосередньо викидається на поверхню ендотеліальних клітин або в кровоносне русло. Однак при відсутності місцевих запальних процесів, або активації имунокомпетентних клітин, основним шляхом секреції Рселектину є дегрануляція ендотеліальних клітин із звільненням вмісту Weibel-Paiade тіл. Тому оцінюючи вміст цих гранул у ендотеліальних клітинах у звичайних умовах і після пред'явлення стимулу, що викликає їхнє переміщення до клітинної мембрани і як слідство - вивільнення вмісту за межами клітини, можно судити про процеси секреції Р-селектину. Однак незважаючи на існування такої принципової можливості, у клінічних умовах зазначений підхід не може бути застосований, так як вимагає біопсії людських судин, причому кілька разової. Так як другим компонентом, що міститься в Weibel-Paiade тілах і котрий паралельно з Р-селектином звільняється при дегрануляції ендотеліальних клітин, є фактор Вілібранда, визначення якого, у відмінності від Р-селектину, не представляє особливих труднощів в клінічних умовах, існує можливість оцінювання процесів дегрануляції : ендотеліальних клітин, а значить і процесів секреції Р-селектину, шляхом оцінки кількості (або активності) фактора Вілібранда до і після стимуляції ендотеліальних клітин. Таким чином, використання в якості індикатора процесу секреції Р-селектину, процесу збільшення активності фактора Вілібранда після стимуляції ендотеліальних клітин, яка викликає їхню дегрануляцію, дозволяє оцінювати секрецію Р-селектину в клінічних умовах із високим ступенем точності, достовірності і відтворюванності результатів дослідження. Для визначення показника норми було обстежено 128 чоловік, з них 43 практично здорових осіб, 53 хворих на гіпертонічну хворобу, 32 хворих з постінфарктним кардіосклерозом. Серед обстежених здорових осіб були представлені різні вікові групи (згідно рекомендацій ВООЗ),'середній вік склав 41,4±12,3 року, жінок було 18 (41,86%), чоловіків • 25 (58,14%). Після обчислення результатів обстеження групи здорових осіб секреція Р-селектину склала 36,56±3,41 умовних одиниць. Спосіб здійснюється слідуючим чином: 1. Отримують бестромбоцитарну плазму стандартним способом. 2. В отриманій бестромбоцитарній плазмі визначають активність фактору Вілібранда стандартними способами. 3. На плече протилежної кінцівки накладають манжету сфігмоманометра, в якій створюють тиск на 20 мм рт.ст. перевищуючий систолічний артеріальний тиск досліджуємого. 4. Залишають манжету на плечі протягом 5 хвилин. 5. Не знімаючи манжети шляхом венепункції локтьової вени набирають у сіліконізова-ний шприц декілька мілілітрів крові. 6. Отримають бестромбоцитарну плазму як зазначено вище. 7. В отриманій бестромбоцитарній плазмі вдруге визначають активність фактору Вілібранда стандартними способами. 8. Вираховують ступінь збільшення активності фактора Вілібранда до та після оклюзії. 9. Секрецію Р-селектину визначають за ступенем збільшення активності фактора Вілібранда, приймаючі за 1 умовну одиницю 1 % збільшення. Приклад. Хворий С , 43 років, надійшов в кардіологічне відділення Запорізької обласної клінічної лікарні з скаргами на запаморочення, головний біль, «мільтішиння цяток» перед очами, звій в вухах, задишку при фізичному навантаженні. Вважає себе хворим протягом 8 років, коли вперше, без видимої причини, було зареєстровано носову кровотечу, яка супроводжувалася підвищенням артеріального тиску до 190 та 120 мм рт. ст. Згодом хворий неодноразово знаходився на стаціонарному лікуванні з приводу гіпертонічної хвороби, . одержував амбулаторну терапію р-блокаторамй і діуретиками. За тиждень до надходження в клініку, після сильного психоемоційного потрясіння, з'я 35190 вилися вищезазначені скарги на тлі високих цифр артеріального тиску (до 180 і 110 мм рт.ст.), і хворий був госпіталізований для купування гіпертонічного криза та корекції проводимої терапії. Анамнез життя • без особливостей, мати хворого страждала гіпертонічною хворобою, іншої спадкової патології в родині не виявлено. Пацієнт палить протягом 13 років, інші шкідливі звички заперечує, алергологічний анамнез не обтяжений. Об'єктивно спостерігаються наступні зміни. Артеріальний тиск в момент надходження 180 і 100 мм рт.ст на лівій і 185 і 110 мм рт.ст. на правій плечових артеріях, пульс 84 ударів в хвилину задовільних властивостей. При пальпації верхівний поштовх визначається на 2-2,5 см зверху від середньоключичної лінії з лівої сторони в 6 міжребірьї, поширений, збільшений по висоті, посилений. Перкуторно - розширенню границь відносної серцевої тупості, аускультативно діяльність серця правильна, посилений І тон на верхівці серця, в легенях дихання везикулярне, жорсткувате, в нижніх відділах з обох сторін одиничні вологі дрібнобулькасті неконсонуючі хрипи. Частота дихання 20 в 1 хвилину, дихання поверхневе. На електрокардіограмі - ознаки гіпертрофії міокарда лівого шлуночка, порушення процесів реполярізації в лівих грудних відведеннях. При ехокардіографічному дослідженні спостерігається збільшення кінцеводіастопічного і кінцевосістолічного об'ємів лівого шлуночка, помірне зниження його скорочувальних властивостей, потовщення задньої стінки лівого шлуночка та міжшлуночкової перетинки, наявна гіпертрофія міокарда лівого шлуночка (індекс маси міокарда лівого шлуночка 123 г/м3). При рентгенологичному дослідженні в легенях посилений судинний малюнок, корені ст руктурні, тяжисті, більше з правої сторони. При дослідженні очного дна визначається звуження і склерозування артерій, вени повнокровні, поширені, феномен Салюса-Гуна ІІ-ІІІ ступеня. Дані інших інструментальних та лабораторних досліджень без особливостей. Враховуючи скарги хворого, клінічну картину захворювання, дані об'єктивного дослідження і зважаючи на результати додаткових способів дослідження, хворому був поставлений клінічний діагноз - гіпертонічна хвороба, II стадія. Враховуючі часту асоціацію порушення взаємодії ендотелію з клітинними елементами крові з підвищенням артеріального тиску та з метою оптимізації, застосовуємо курс протигілертензивної терапії, у хворого була визначена секреція Р-селектину згідно пропонуємого способу, яка склала 58 умовних одиниць. Через 12 тижнів комплексного лікування, яке включало додаткове застосування лікарських засобів, які мають ендотелій-протекторні властивості та запобігають активації лейкоцитів, при контрольному обстеженні поряд з поліпшенням клінічної картини захворювання та позитивною динамікою даних інструментальних досліджень, спостерігалося достовірне зменшення секреції Р-селектину, яка на кінець курсу терапії склала 42 умовні одиниці. Таким чином, використання способу, що пропонується, дозволило вчасно визначити ступінь залученості порушень ендотеліальноклітинних взаємодій в патологічне коло патофізіологічних ланок захворювання шляхом визначення секреції Р-селектину, призначити патогенетично зумовлену терапію, що в підсумку призвело до підвищення якості діагностики, дозволило оптимізувати лікування і відвернути появу ускладнень. Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 - 7 2 - 8 9 (03122) 2 - 5 7 - 0 3