Спосіб прогнозування рівня регенерації рослин в культурі пиляків озимої м`якої пшениці

Спосіб прогнозування рівня регенерації рослин в культурі пиляків озимої м'я кої пшениці, що включає отримання гомозиготних ліній методом культури пиляків пшениці in vitro, який відрізняється тим, що проводиться прогнозування рівня регенерацій рослин за допомогою оцінки показників тривалості періоду "сходи - вакуолізована мікроспора" для сортів та гібридних форм озимої м'я кої пшениці. (19) (21) u200803034 (22) 11.03.2008 (24) 27.10.2008 (46) 27.10.2008, Бюл.№ 20, 2008 р. (72) ІГНАТОВА СВІТЛАНА ОЛЕКС АНДРІВН А, U A, ШЕСТОПАЛ ОКС АНА ЛЕОНІДІВНА, UA, ЛОБАНОВА КАТЕРИНА ІВАНІВНА, U A (73) ПІВДЕННИЙ БІОТЕХНОЛОГІЧНИЙ ЦЕНТР В РОСЛИННИЦТВІ УААН, U A 3 36253 рацією рослин в культурі пиляків in vitro та тривалістю періодів розвитку "сходи - колосіння" та "сходи - вакуолізована мікроспора" у різних генотипів озимої м'якої пшениці. Поставлена задача вирішується наступним чином: для прогнозування рівня регенерації рослин та добору найбільш «чутливих» до андрогенезу генотипів м'якої пшениці в культурі пиляків пропонується використовувати показники тривалості періодів "сходи - колосіння" та "сходи - вакуолізована мікроспора". Спосіб забезпечує виявлення серед сортів та гібридів озимої м'якої пшениці генотипів з високим рівнем регенерації рослин в культурі пиляків. Причинно-наслідковий зв'язок між регенерацією зелених рослин в культурі пиляків озимої м'якої пшениці in vitro та тривалістю періодів розвитку "сходи - колосіння" та "сходи - вакуолізована мікроспора" можна пояснити наступним чином. За даними авторів [2, 3] важливими факторами при культивуванні пиляків є умови вирощування рослин та фізіологічний стан донорного матеріалу. Тоді як вирішальне значення у реалізації адаптивного потенціалу рослин пшениці відіграє тривалість вегетаційного періоду та окремих фаз онтогенезу, які контролюються генотипом [4, 5]. Беручи до уваги той факт, що саме тривалість періоду вегетації впливає на фізіологічний стан та адаптаційну здатність донорного матеріалу ми припустили, що існ ує зв'язок між регенерацією рослин і тривалістю періодів "сходи - вакуолізована мікроспора" та "сходи - колосіння" Період "сходи - колосіння" включає етап розвитку пиляка - фазу вакуолізованої мікроспори. При введені в культуру пиляків, розвиток мікроспор за гаметофітним шляхом, який звичайно відбувається в умовах in vivo, припиняється на фазі вакуолізованої мікроспори, і далі розвиток мікроспор в умовах in vitro, проходить за спорофітною програмою. Зв'язок періодів розвитку "сходи - колосіння" та "сходи - вакуолізована мікроспора", очевидний. Генотипи, які характеризуються більш раннім періодом колосіння, раніше проходять фазу вакуолізованої мікроспори. Оскільки період розвитку рослин "сходи - вакуолізована мікроспора" є частиною періоду "сходи колосіння", а з боку біотехнології, період "сходи вакуолізована мікроспора" є більш інформативним, тому використання даного показника для оцінки регенераційної здатності різних генотипів пшениці, як ми вважаємо, є більш коректним. Цей показник може бути використаний в якості маркера для прогнозування рівня регенерації рослин в культурі пиляків озимої пшениці. Таким чином, у дослідах для визначення рівня регенерації in vitro у генотипів м'якої пшениці в культурі пиляків, в якості критерію, був використаний показник тривалості періоду "сходи - вакуолізована мікроспора". Спосіб здійснюється таким чином. У якості донорного матеріалу для культури пи 4 ляків використовували генотипи озимої м'якої пшениці, які характеризувалися різною тривалістю періоду "сходи - колосіння", діб (табл. 1, 2): сорти - Фантазія одеська (186), Одеська червоноколоса (187), Чайка (192), Меrсіа (193), лінія Лютесценс 155 (182), гібридні форми F1 – [Зірка х Зразкова] х Леля (211), [Зірка х Зразкова] х Ніконія (213), [Зірка х Зразкова] х Куяльнік (215), [Зірка х Зразкова] х Кірія (216), Багіра х Леля (207), Багіра х Бунчук (216). Донорні рослини вирощували в польових умовах. В ході досліду відмічали календарну дату сходів та дату взяття рослинного матеріалу в культур у пиляків in vitro. Для введення в культуру пиляків з донорних рослин зрізали перші пагони з колоссям, коли мікроспори в них знаходились на фазі вакуолізованої мікроспори (від слабовакуолізованої до сильновакуолізованої), (далі - ВМк). Фазу розвитку мікроспор визначали цитологічним методом [6]. Як вважають автори [7-8], саме фаза вакуолізованої мікроспори, є оптимальною для розвитку мікроспор за спорофітним шляхом в умовах in vitro. Нами була розрахована тривалість періодів „сходи - вакуолізована мікроспора" та „сходи - колосіння" для сортів та гібридних форм, що досліджувалися. Проводили холодову попередню обробку зрізаних пагонів з колоссям у воді при температурі +2°С у темряві на протязі 3 діб. Колосся стерилізували насиченим розчином гіпохлориту кальцію. Стерильно виділені пиляки культивували за методикою, яка була описана раніше [9]. Сформовані in vitro зелені рослини-регенеранти пересаджували на середовище Мурасіге і Скуга (MS) [10] без фі тогормонів для проходження яровизації у камері штучного клімату. Ста тистичну обробку даних проводили за методикою Рокицького [11], із використанням стандартних комп'ютерних програм. Приклад 1 Проводили оцінку ефективності запропонованого способу прогнозування рівня регенерації в культурі пиляків на сортах озимої м'якої пшениці. Дослідження показали, що найбільш високі показники гаплопродукції, як на етапі формування новоутворень, так и на етапі регенерації рослин, були у генотипів, що різнилися більш короткими періодами "сходи - вакуолізована мікроспора", та відповідно, коротким періодом "сходи - колосіння". Так максимальний рівень сформованих новоутворень - 10,12%, 6,56% і регенерації рослин - 3,47%, 2,25% було зафіксовано у лінії Лютесценс 155 та сорту Фантазія одеська, відповідно. Дані сорти характеризувались найменшим періодом "сходи вакуолізована мікроспора" - 177 і 180 діб, відповідно (табл. 1). 5 36253 6 Таблиця 1 Регенерація рослин в культурі пиляків озимої м'якої пшениці у генотипів з різною тривалістю періодів "сходи - вакуолізована мікроспора" (С - ВМК) та "сходи - колосіння" (С - К) Генотип Лютесценс 155/89 Фантазія одеська Од. червоно-колоса Чайка Мегсіа Тривалість періоду С-ВМК, діб С-К, діб Кіл-ть пиляків, шт. 177 180 181 186 188 182 186 187 192 193 346 488 397 350 505 Кіл-ть новоутворень, % 10,12±1,62 6,56±1,12 5,04±1,21* 4,86±1,15* 0,79±0,39* Загальна частота регенерації, % від висаджених пиляків 3,47±0,98 2,25±0,67 1,01±0,5 0,57±0,4* Примітка: * - різниця достовірна при Р