Пристрій для кріоконсервації об’єктів тваринного і рослинного походження

Пристрій для кріоконсервації об'єктів тваринного і рослинного походження, що включає посудину Дьюара і термоблок, що встановлено у горловині посудини з можливістю зміни параметрів і глибини занурення відносно верхнього краю горловини, термоблок виготовлено у формі циліндра з нержавіючої сталі, який відрізняється тим, що він має порожні стінки і дно, у яких є можливість 3 38781 стаканом [Горбунов Л.В., Салина А.С. Способы криоконсервации половых клеток и эмбрионов животных в широком диапазоне скоростей теплообмена// Животноводческие науки. - София. 2005. - №5. - С.140-143.]. Зміна характерного часу охолодження термоблока досягається за допомогою різного розташування циліндра щодо стакана (0-100мм), завдяки чому реалізується діапазон швидкостей заморожування від 0,5 до 52°С/хв. Основним недоліком усіх представлених пристроїв є неможливість реалізації надповільних швидкостей охолодження (0,01¸0,2°С/мин), необхідних для заморожування меристемальних клітин. Таким чином, запропонований винахід перекриває по своїм характеристикам усі існуючі пристрої для заморожування біологічного матеріалу. Завданням корисної моделі є забезпечення оптимального режиму заморожування біооб'єкту за рахунок варіації характеру швидкості охолодження за допомогою зміни часу остигання термоблока у горловині судин Дьюара: Х-5, Х-34Б чи Х35. Поставлене завдання досягається тим, що пристрій включає судину Дьюара і термоблок, що встановлено у горловині судини з можливістю зміни параметрів і глибини занурення щодо верхнього краю горловини, термоблок виготовлено у формі циліндра з нержавіючої сталі, відрізняється тим, що він має порожні стінки і дно, у яких мається можливість установлення різного ступеня розрідженості повітря, аж до вакууму, а також відкритості зовнішньої і внутрішньої стінок, завдяки цьому реалізується широкий діапазон швидкостей (0,01¸100°С/хв) і прискорень (-2000¸+2000°С/хв2) заморожування з мінімальним градієнтом температури (1°С/см) по осі внутрішньої частини термоблока, маса термоблоку відносно мала (»0,2кг), що дозволяє ощадливо витрачати холодоагент при заморожуванні у горловині судини Дьюара (»0,07кг), застосування даного пристрою на основі транспортної судини Дьюара Х-5 створює можливість його ручного транспортування і здійснення заморожування, як у лабораторних, так і у польових умовах. Пристрій для заморожування клітин тваринного і рослинного походження складається із судини Дьюара (Х-34Б, Х-34Б чи Х-5) (10) (Фіг.1), у якому встановлено термоблок висотою 12см з подвійними стінками (12, 14). За допомогою держака (4) з фіксатором (3) і ручки (1) задається визначена глибина занурення термоблока у горловину судини Дьюара, аж до поверхні рідкого азоту. Сам термоблок складається з зовнішньої (14) і внутрішньої (12) стінок, виготовлених з нержавіючої сталі, і кришки (9). В основі запропонованого пристрою лежить повітря (13), що дозволяє задавати різну швидкість заморожування за допомогою зміни тиску між стінками блоку за допомогою шприца (11) через фіксатор (6). Варіація тиску повітря між стінками термоблоку (12, 14) від 0,01 до 3atm приводить до зміни швидкості охолодження біологічного матеріалу від 0,01 до 4°С/хв, відповідно. Необхідний тиск (розрідженість) повітря задається і фіксується робочим об'ємом шприца (11) з вакуумною трубкою 4 (2) і фіксатором (6). За рахунок зміни тиску повітря, за допомогою його відкачки чи накачування, змінюється щільність і температуропровідність основи термоблока, що впливає на режим охолодження (Фіг.2). При цьому отвори (7, 16, 18, 19, 20 і 21) повинні бути закриті. Варіювання тиску повітря у процесі заморожування від 0,01 до 3atm приводить до зміни середньої швидкості остигання термоблока від 0,01 до 4°С/хв., відповідно (Фіг.3). Пристрій також можливо застосовувати для заморожування клітин тваринного походження. Завдяки можливості зміни ступеня відкритості зовнішньої і внутрішньої стінок і глибини занурення термоблока реалізуються швидкості і прискорення процесу заморожування до 100°С/хв. і 2000¸+2000°С/хв.2, відповідно. При цьому зовнішній чохол (15) служить для того, щоб пари азоту проходили тільки між стінками блоку (12) і (14) з метою підвищення швидкості заморожування і зменшення градієнта температури. Для цього застосовуються додаткові отвори (7, 8, 16, 17, 18, 19, 20 і 21), а також спеціально розроблені контейнери для утримування біологічного матеріла об'ємом 0,5мл (Фіг.4), де: 1 - пробка, 2 - середовище, що містить біооб'єкт, 3 - стержень, що ініціює кристали. Для мінімізації пагубної дії схованої теплоти кристалізації запропоновано спосіб ініціації росту кристалів у пендорфовській пробірці з біооб'єктом, що полягає у включенні у нижню частину контейнера елемента неоднорідності у вигляді сталевого стержня діаметру 1мм голкоподібної форми (Фіг.4а). Інший вид контейнеру для утримування біоматеріалу складається з насадки від мікропіпетки конусоподібної форми і термопластикової пробки (Фіг.4б). Така форма контейнеру застосовується для підсилення ступеня ініціації кристалоутворення, тому що зменшення об'єму у нижній частині веде до збільшення імовірності росту кристалів у даному місці. Ініціація кристалів значно збільшується у нижній частині контейнера через наявність градієнта температури у термоблоку по вертикалі 1°С/см. Загострена форма ініціюючого стержня необхідна тому, що імовірність ініціації зростає, коли величина розміру неоднорідності порівнянна з розмірами зростаючих зародків кристалів. Таким чином, схоронність деконсервированних сперміїв зростає на 10% внаслідок зменшення ступеня викиду схованої теплоти кристалізації і як наслідок перепаду температури у 7 разів при ініціації кристалів сталевим голкоподібним стержнем діаметру 1мм у дні контейнера, що містить біооб'єкт. Корисна модель ілюструється прикладами: Приклад 1. При заморожуванні меристемальних клітин зі швидкістю 0,01°С/хв. і отвори 5, 16-17 закриваються, а отвір 6 з'єднується зі шприцом 11 з метою встановлення необхідного тиску повітря (0,01atm.) між стінками 12 і 14. При встановленні тиску повітря 0,1atm. на глибині занурення термоблока 15см установлюється швидкість теплообміну 0,2°С/хв., необхідна для заморожування меристем, що оброблені розчином криопротектора [Y. Zhao, Y. Wu, 5 38781 F. Engelmann, M. Zhou. Cryopreservation of axillary buds of grape (Vitis vinifera) in vitro plantlets. Cryoletters 22, p.321-328, 2001]. Схоронність деконсервированних меристем складає 25-40%. Приклад 2. При заморожуванні сперміїв риби як контейнери для утримування біо-матеріалу застосовуються пендорфовські пробірки та насадки від мікропіпетки з ініціюючим стержнем у нижній частині контейнера. Для охолодження до кінцевої температури -15°С/хв сперми коропа і сазана зі швидкістю В=1-2°С/хв. глибина занурення термоблока в горловину судини Дьюара X-34Б повинна складати L=15см при відкритості отворів 5, 6, 17, 20 і 21. Для охолодження сперми коропа і сазана зі швидкістю В=15-20°С/хв. до температури -70±2,5°С глибина занурення термоблока у горловину судини Дьюара повинна складати L=30см при тім же ступені відкритості термоблоку. Після заморожування сперміїв коропа за допомогою запропонованого пристрою схоронність складає 45-55%. Приклад 3. Здійснення процесу заморожування сперміїв бугая, як у лабораторних, так і у польових умовах 6 можливо за допомогою запропонованого пристрою. Як контейнери для біоматеріалу застосовуються пендорфовські пробірки та насадки від мікропіпетки з ініціюючим стержнем у нижній частині контейнера. Стабільність режиму заморожування і точність визначення кінцевої температури охолодження біооб'єктів визначаються розкидом температури у горловині судини Дьюара Х-34Б, що складає ±2,5°С, тобто, суттєво не залежить від ступеня заповнення судини азотом, зміни навколишньої температури й атмосферного тиску, за умови дотримання належних вимог до лабораторних приміщень і паспортних даних судини Дьюара. Розкид температури у судині Х-5 (при імітації умов ручного транспортування) складає ±5°С. Для заморожування сперміїв бугая зі швидкістю о холодження 50°С/хв. і характером її зміни 2000¸+2000°С/хв. 2 термоблок необхідно розміщувати на глибині 34см у горловині судини Дьюара, при відкритості отворів 5, 6, 17, 18, 19 і 20. С хоронність деконсервированного матеріла складає 50%. 7 Комп’ютерна в ерстка Н. Лисенко 38781 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601