Спосіб визначення коагуляційної активності гемолізаткальцієвої суміші

Спосіб визначення коагуляційної активності гемолізат-кальцієвої суміші шляхом з'єднання розчину хлориду кальцію з венозною кров'ю, який відрізняється тим, що у отриманій гемолізаткальцієвій суміші послідовно через 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50 та 60 хвилин від моменту її приготування визначають вільні небілкові SН-групи та по динаміці змінення їх вмісту судять про коагуляційну активність гемолізат-кальцієвої суміші. (19) (21) 97126165 (22) 19.12.1997 (24) 16.10.2000 (33) UA (46) 16.10.2000, Бюл. № 5, 2000 р. (72) Костюшов Володимир Васильович, Костюшова Лілія Антонівна, Костюшова Наталія Володимирівна, Тимчишин Олег Львович, Морозкін Володимир Васильович, Кутковєць Снежана Леонідівна, Бойкова Светлана Володимирівна 29043 - неможливість об'єктивної оцінки характеру конформаційних змін білків, приймаючих участь у реакції; - залежність результату від ряду змінюючихся та іноді неконтролюємих факторів, наприклад, різке змінення гематокритного показника, залежність показника від вмісту у крові еритроцитів та фізико-хімічного стану білків плазми крові. В основу винаходу поставлена задача удосконалення способу визначення коагуляційної активності ГКС, за рахунок послідовного визначення вмісту вільних небілкових SH-груп у ГКС через 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50 та 60 хвилин від моменту її приготування, тим самим забезпечується прямий метод визначення коагуляційної активності ГКС за допомогою молекулярного маркеру, підвищення чутливості, об'єктивності, точності дослідження та значне спрощення способу: виключаються непрямий спосіб визначення коагуляційної активності ГКС, складні математичні розрахунки, необхідність використання довідкових таблиць, калібровочні контрольні дослідження та інш. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення коагуляційної активності ГКС шляхом з'єднання розчину хлориду кальцію з венозною кров'ю, згідно винаходу, у о триманій ГКС послідовно через 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50 та 60 хвилин від моменту її приготування визначають вільні небілкові SH-групи та по динаміці змінення їх вмісту судять про коагуляційну активність ГКС. Аналіз технічного рішення, що пропонується, дозволив виявити наступні відрізнення: - визначення коагуляційної активності ГКС по динаміці змінення вмісту у ній вільних небілкових SH-груп послідовно через 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50 та 60 хвилин від моменту її приготування; - визначення у отриманій біологічній суміші вільних небілкових SH-груп, які свідчать про коагуляційну активність ГКС. Запропонована сукупність ознак дозволяє визначити коагуляційну активність ГКС за рахунок визначення вільних небілкових SH-груп. Відомо визначення коагуляційної активності ГКС по появі згустку фібрину у АКТ, але не відомо визначення коагуляційної активності ГКС по динаміці змінення вмісту вільних небілкових SH-груп у ГКС від моменту її приготування. Відомо визначення вмісту вільних небілкових SH-груп у еритроцитах, лейкоцитах, сироватці крові, наприклад, для діагностики захворювань крові, інфарктів внутрішніх органів та інш. Невідомо визначення вільних небілкових SH-груп у ГКС для визначення її коагуляційної активності. Сутнисть способу пояснюється малюнками. На фіг. 1 та 2 зображені графіки визначення коагуляційної активності ГКС запропонованим способом (крива - 1), та способом-прототипом (крива - 2). По лівій вісі ординат відображен показник коагуляційної активності ГКС запропонованим способом (мкМ/л), по правій вісі ординат відображен показник коагуляційної активності ГКС способом-прототипом (%); а на вісі абсцис - час інкубації ГКС. Сутність способу, що пропонується нами, полягає у тому, що з'єднують розчин хлориду кальцію з венозною кров'ю та у отриманій ГКС послідовно через 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50 та 60 хвилин від моменту її приготування визначають вільні не білкові SH-групи та по динаміці змінення їх вмісту судять про коагуляційну активність ГКС. Ми ви ходили з отриманих нами даних, згідно яких встановлена непрямопропорціональна залежність між показниками коагуляційної активності та вмістом вільних небілкових SH-груп у ГКС відповідно на 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50 та 60 хвилині від моменту її приготування (таблиця, фіг. 1). Як видно з таблиці та фіг. 1 наростаюча частина кривої АКТ, що відображає наростання та максимальну активність тромбопластину та тромбину у крові, що досліджується (крива 2), супроводжується зниженням вмісту вільних небілкових SHгруп (крива 1). Спадаюча частина кривої АКТ, що відображає швидкість та інтенсивність інактивації тромбину (крива 2), навпаки, супроводжується підвищенням вмісту вільних небілкових SH-груп (крива 1). Таким чином, ми встановили, що по динаміці вмісту вільних небілкових SH-груп у ГКС відповідно на 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50 та 60 хвилині від моменту її приготування можна оцінити стан як прокоагулянтної, так і антикоагулянтної активності ГКС та кінетику цих процесів. Як слідує з отриманих нами даних, у прокоагулянтній та антикоагулянтній активності ГКС грають важливу роль тіолопривні механізми. При цьому необхідно мати на увазі, що споживання вільних небілкових SH-груп у ГКС є характерною ознакою прокоагулянтної активності, причому мінімальний їх вміст відображає максимальну її активність. Подальше наростання вмісту вільних небілкових SHгруп у ГКС, навпаки, є характерною ознакою антикоагулянтної активності, причому максимальний їх вміст відображає максимальну її активність. З цього слідує, що прокоагулянтна та антикоагулянтна активність зумовлена конформаційними переходами білків ГКС, із зміною їх фізико-хімічних властивостей, особливим структурно-функціональним станом, що супроводжується супутними фазовими, різнонаправленими тіолопривними реакціями: - при активації прокоагулянтної системи виявляється феномен споживання вільних небілкових SH-груп ГКС, як результат дестабілізації міцності зв'язку низькомолекулярних тіолів з білком та лабіализації при цьому небілкових SH-гр уп; - при інактивації прокоагулянтної та активації антикоагулянтної систем виявляється феномен наростання вмісту вільних небілкових SH-груп. Тому феномен споживання та наростання вільних небілкових SH- груп у ГКС свідчить про характер та спрямованість її активності. Вказане вище з'явилось передумовою для розробки способу, що пропонується нами. Спосіб, що пропонується нами здійснюється таким чином. У обстежуваного, з дотримуванням правил асептики, здійснють забір венозної крові. Венозна кров змішується з 3,8% розчином цитрату натрію у співвідношенні 10:1. В окрему пробірку набирають 6 мл розчину хлориду кальцію. Потім у неї додають 0,6 мл цітратної крові для приготування ГКС та негайно вмикають секундомір. Пробірку з цією сумішшю стр ушують та поміщають у термостат при температурі 37°С. Послідовно на 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50 та 60 хвилинах від моменту приготування ГКС, визначають вміст вільних 2 29043 небілкових SH-груп методом амперометричного титрування (АМТ), на розробленому нами пристрої для АМТ (патент № 20935 A UA, MKB A61В10/00, G01N27/26, публ. 07.10.1997). Отримані результати виражають графічно, відкладаючи на вісі ординат показники вмісту вільних небілкових SH-груп, а на вісі абсцис - час інкубації ГКС (фіг. 1, крива 1). За допомогою отриманої діаграми коагуляційної активності ГКС визначають наступні параметри: А - коагуляційна активність на другій хвилині інкубації ГКС - по вмісту вільних небілкових SH-гр уп (норма: М=37,4±3,9 мкМ/л); МА максимальна коагуляційна активність ГКС - по мінімальному вмісту вільних небілкових SH-груп (норма: М=10,5±3,9 мкМ/л); Т 1 - час досягнення половини МА (норма: 5,2±2,1 хвилини) ; Т2 - час досягнення максимальної коагуляційної активності (норма: 10 хвилин); ІІТ - індекс інактивації тромбопластину та тромбіну, який розраховується по співвідношенню: МА llT = вміст вільних небілкових SH - груп на 60 хвилини норма = 0,21±0,07. Спадаюча частина діаграми характеризує швидкість та величину споживання вільних небілкових SH-груп, відображаючи наростання та максимальну коагуляційну активність ГКС при стандартизованій контактовій та фосфоліпідній активації зсідання. Наростаюча частина діаграми характеризує швидкість та величину наростання вільних небілкових SH-груп, що відображають відповідно швидкість та інтенсивність інактивації коагуляційної та активації антикоагуляційної активності ГКС. Таким чином, по вмісту вільних небілкових SHгруп, які свідчать про коагуляційну активність ГКС, одержують інтегральні дані про стан як прокоагулянтної, так і антикоагулянтної ланок системи зсідання крові та кінетики обох процесів. Приклад конкретного виконання У донора Б-ва, з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір 9,0 мл венозної крові у стерильну пробірку, що містить 1,0 мл 3,8% розчину цитрату натрію. В окрему пробірку набирали 6 мл розчину хлориду кальцію та додавали 0,6 мл венозної крові, після чого вмикали секундомір. Пробірку з ГКС струшували та поміщали у термостат при температурі 37°С. Потім послідовно на 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50 та 60 хвилинах від моменту приготування цієї суміші визначали вміст вільних небілкових SH-груп, які відповідно склали: 39,3 мкМ/л, 30,4 мкМ/л, 20,5 мкМ/л, 14,4 мкМ/л, 9,2 мкМ/л, 20,8 мкМ/л, 28,0 мкМ/л, 36,9 мкМ/л, 46,1 мкМ/л, 53,3 мкМ/Л. Отримані результати виражали графічно, відкладаючи на лівої вісі ординат показники вмісту вільних небілкових SH-груп, а на вісі абсцис - час інкубації ГКС (фіг. 2, крива 1). За допомогою отриманої діаграми визначали наступні параметри коагуляційної активності ГКС: А=39,3 мкМ/л, МА=9,2 мкМ/л, Т 1=5,9 хв, Т2=10 хв, ІІТ=0,19. Результати отримані способом-прототипом відповідно склали: 27,5%, 56,0%, 85,0%, 92,0%, 100,0%, 88,%, 75,0%, 65,0%, 56,0%, 44,0%. Отримані результати виражали графічно, відкладаючи на правої вісі ординат показники коагуляційної активності ГКС, а на вісі абсцис - час інкубації ГКС (фіг. 2, крива 2). За допомогою отриманої діаграми коагуляційної активності ГКС визначени наступні параметри: А=27,5%, МА=100,0%, Т1=3,6 хв., Т 2=10 хв., ІІТ=1,7. Отримані дані свідчать про співпадіння результатів двох способів та вказують на нормальну коагуляційну активність ГКС. Таким чином, спосіб, який пропонується нами, дозволяє об'єктивно та точно визначати коагуляційну активність ГКС по молекулярному маркеру вмісту вільних небілкових SH-груп, він має гарну чутливість, а також значно скорочує час на проведення дослідження, спрощує те хніку їх проведення та доступний до широкого застосування у різних медичних установах . Таблиця Час інкубації ГКС (хвилин) 2 4 6 8 10 20 30 40 50 60 3 Коагуляційна активність ГКС Запропонований Способ-прототип спосіб (по вмісту (коагулційна актив- в ГКС вільних небілкових SH-гр уп, ність %) мкМ/л) 27,5 39,3 56,0 30,4 85,0 20,5 92,0 14,4 100,0 9,2 88,0 20,8 75,0 28,0 65,0 36,9 56,0 46,1 44,0 53,3 29043 Фіг. 1 Фіг. 2 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 34 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4