Спосіб кількісного визначення офлоксацину та ломефлоксацину при їх взаємній присутності

Спосіб кількісного визначення офлоксацину та 3 на спеціальних картриджах із спеціальним сорбентом Ultropac Lichrosorb RP-18, елюірування їх із сорбенту сумішшю розчинника, який містить токсичний ацетонітріл. Все це ускладнює підготовку проби до аналізу. Крім цього, крім високоефективного рідинного хроматографу, який дозволяє виділити індивідуальні антибіотики з розчину, для реєстрації аналітичного сигналу застосовується спектрофотометричний детектор, яким забезпечено не всі моделі високоефективного рідинного хроматографу. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб кількісного визначення ОФ і ЛФ при їх взаємній присутності, в якому шляхом зміни методу відокремлення їх від проби, а також заміни хімічних реагентів та умов взаємодії забезпечити спрощення проведення аналізу та зниження межі їх визначення. Поставлена задача вирішена в способі кількісного визначення офлоксацину і ломефлоксацину при їх взаємній присутності, що включає відбір проби, відокремлення офлоксацину і ломефлоксацину, взаємодію їх з хімічними реагентами та вимірювання аналітичного сигналу тим, що офлоксацин і ломефлоксацин відокремлюють методом тонкошарової хроматографії, виділений офлоксацин піддають взаємодії з хлоридом тербію, а ломефлоксацин - з хлоридом європію в присутності тридецилсульфату натрію та уротропіну при рН 6,5-7,5 на пластинці для тонкошарової хроматографії. Новим у корисній моделі, що заявляється, є використання методу тонкошарової хроматографії для відокремлення ОФ і ЛФ від основних компонентів стічних вод і проявлення хроматограми розчинами хлориду тербію (ОФ) і хлориду європію (ЛФ) у присутності аніонної поверхнево-активної речовини - тридецилсульфату натрію при рН 6,57,5. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак і досягненням технічного результату складається в наступному. Спрощення виконання аналізу й зменшення межі виявлення стало можливим внаслідок наступного: 1. Застосування методу тонкошарової хроматографії, що дозволяє виділити на пластинці ОФ і ЛФ зі стічної води. Застосування такого заходу дозволяє виключити стадію попереднього сорбційно-екстракційного відокремлення антибіотика. 2. Використання як проявляючого реагенту хлориду тербію (ІІІ) для виявлення офлоксацину й хлориду европію (ІІІ) для виявлення ломефлоксацину. В обох випадках для посилення аналітичного сигналу застосовують тридецилсульфат натрію. При цьому на хроматографічній пластинці виявляється сенсибілізована люмінесценція іонів Тb(III) і Еu(III), що є наслідком внутрішньо молекулярної передачі енергії збудження від органічних лігандів (у цьому випадку - антибіотиків) на іони лантанидів. Органічні ліганди, поглинаючи енергію збудження, можуть передавати її на іони лантанидів, підсилюючи її на 3-4 порядки величини. Офлоксацин і ломефлоксацин мають в УФ-області спектра 40121 4 смуги поглинання з максимумами (210, 301нм) і (285, 325нм) відповідно, що обумовлює ефективне поглинання енергії збудження. У випадку офлоксацину, що має смугу поглинання при l = 210 нм , здійснюється ефективна передача енергії збудження на іон Тb(III), що має в цій же області спектра смугу з максимумом при 219нм, що відповідає 4f-5d переходу з високим молярним коефіцієнтом поглинання e = 374 нм . Люмінесценція іона Еu(III) у комплексі з офлоксацином практично відсутня. Ломефлоксацин не має короткохвильової смути поглинання. У цьому випадку очевидно відбувається передача енергії порушення від ліганду E T = 21050 см-1 на енергетичний рівень Eu(III) 5D1 (19000см-1) з наступної безвипромінювальної дезактивацією до першого збудженого стану 5D0 (17300см-1), з якого й відбувається випромінювання. Для цього реагенту характерна люмінесценція іона Еu(III). Передача енергії здійснюється й у твердій фазі, тому на хроматографічній пластинці виявляється інтенсивна люмінесценція іонів Тb(III) і Еu(III). Введення аніонного поверхнево-активної речовини (АПАВ) тридецилсульфата натрію сприяє дегідратації комплексів, що утворилися, і тим самим зниженню безвипромінюваних втрат енергії збудження. Крім того, введення АПАР знижує триплетний рівень лігандів до E T = 20500 см-1 , і в цьому випадку здійснюється більш ефективний перенос енергії збудження на іони лантанідів [див. Теслюк О.И., Бельтюкова С.В., Егорова А.В. Люминесцентые свойства европия и тербия в комплексах с производными хинолонкарбоновой кислоти в присутствии поверхностно-активних веществ. Укр. хим. журнал, 2001, т.67, №5-6, с.10-14]. Вибір поверхово-активної речовини проведений експериментально. Дослідження впливу різних аніонних ПАР на І люм Тb(III) і Еu(III) на хроматографічній пластинці показало, що найбільша І люм спостерігається в присутності тридецилсульфата натрію (табл. 1). Режими проведення аналізу обрані експериментально. Найбільша І люм спостерігається при використанні розчину, що проявляє, з концентрацією Тb(III) або Еu(III) 1× 10-3 моль / л . При більших концентраціях спостерігається концентраційне гасіння І люм і зростання І люм холостої проби. В якості проявляючого обрана концентрація Тb(III) або Еu(III) 1× 10-3 моль / л . Вивчення залежності І люм сорбата від кількості тридецилсульфата натрію показало, що оптимальним є вміст 1× 10-3 моль / л . Комплексні сполуки Тb(III) і Еu(III) з офлоксацином і ломефлоксацином мають люмінесцентні властивості в інтервалі значень рН від 3,0 до 9,0 з максимумом люмінесценції при рН 6,5-7,5. Тому як буфер використовували 4%-ний розчин уротропіну. Вивчено декілька елюіруючих систем: метанол-етанол-оцетова кислота; етанолфосфорнокислий натрій однозаміщений-метанолоцетова кислота-аміак; додецилсульфат натрію ( ) 5 40121 бутанол-оксалатова кислота; метанол-хлороформтолуол-діетиламін-вода; ацетон-метанол-аміак; етанол-метанол-вода. В якості оптимальної рухливої фази обрана система: метанол - 25%-ий розчин амміаку-етилацет-ацетонітрил (1:1:2:1), в якій відсутній ефект розмивання плям. Рухливість Rf офлоксацину й ломефлоксацину в цих умовах однакова й становить 0,65 і поділу плям на пластинці не відбувається. Для диференційованого виявлення офлоксацину й ломефлоксацину нами використані різні спектроскопічні властивості комплексів цих препаратів з іонами лантанидів (див вище). Досліджені антибіотики утворюють із іонами лантанидів комплексні сполуки, в яких здійснюється ефективний перенос енергії збудження від молекули офлоксацина на іон Тb(III), а у випадку ломефлоксацина - на іон Еu (III). Тому в якості реагенту, що проявляє в першому випадку застосовують розчин хлориду Тb(III), у другому - Еu (III). При опроміненні пластинки УФ-світлом ртутної лампи зі світлофільтром УФ - 2 (l макс = 365 нм ) офлоксацин детектирується по зеленому світінню іона Тb(III), ломефлоксацин - по червоному світінню іона Еu(III). Вивчення впливу об'єму проби, наносимого на пластинку, показало, що найкращий результат досягається при нанесенні проби об'ємом 2мкл, при менших або більших кількостях проби плями на пластинці здобувають витягнуту форму. Визначення антибіотиків проводили на модельних розчинах стічних вод, шляхом введення в стічні води певних їхніх кількостей. Приклад. Аналізовану пробу стічної води в кількості 10мл вносили в мірну колбу на 100мл, вносили певні кількості антибіотиків і розбавляли дистильованою водою до мітки. Потім наносили дві паралельні проби в кількості 2мкл кожна шприцом на лінію старту хроматографічної пластинки розміром 100x100мм на відстані ~1,5см одна від одної. Паралельно на пластинку наносили стандартні розчини офлоксацину й ломефлоксацину. В 6 якості стандартних використовували водноетанольні (2:1) розчини ОФ і ЛФ із концентрацією 1× 10-6 - 1× 10-3 моль / л (залежно від передбачуваного змісту антибіотика в пробі). Пластинку підсушували й поміщали в хроматографічну камеру в рухливу фазу (суміш метанол: розчин аміаку 25 %ого: етилацетат: ацетонітрил (1:1:2:1)). Коли фронт розчинника досягав висоти 70мм, пластинку витягали з камери й відзначали положення фронту розчинника. Отриману хроматограмму висушували й рівномірно обробляли проявником - розчином хлориду тербію 1× 10-3 моль / л для виявлення офлоксацину, і розчином хлориду европия ( 1× 10-3 моль / л ) для виявлення ломефлоксацину. Після цього плями на пластинці обробляли розчином ТДС ( 1× 10-3 моль / л ) і уротропіном 4%-ого. Ідентифікацію антибіотиків на пластинці проводили по появі зеленої люмінесценції Тb(III) у випадку офлоксацину й червоної люмінесценції Еu(III) у випадку ломефлоксацину під люмінесцентною лампою зі світлофільтром УФС-2 (l макс = 365 нм ) , візуально порівнюючи І люм проби й стандарту. Кількісне визначення ОФ і ЛФ проводили по градирувальному графіку, побудову якого робили наступним чином. На пластинку наносили різні кількості стандартних розчинів ОФ і ЛФ і далі проводили хроматографування й прояву хроматограми, як описано вище. Потім із пластинки вирізали плями з ОФ і ЛФ і поміщали в кювету для твердих зразків, інтенсивність люмінесценції вимірювали при l = 545 нм (у випадку ОФ) і при l = 612 нм (у випадку ЛФ). За отриманими даними І люм Ln (ІІІ) концентрація ОФ (ЛФ) будували градирувальні графіки, по яких визначали вміст антибіотиків в аналізованій пробі. Межа виявлення ОФ становить 0,02мкг, а для ЛФ - 0,002мкг. Результати визначення ОФ і ЛФ перевірені методом «введенознайдене» і показана добра відтворюваність розробленого способу (табл. 2). Таблиця 1 Збільшення інтенсивності люмінесценції Тb(III) з ОФ і Еu(III) з ЛФ у присутності поверхнево-активних речовин Антибіотик Офлоксацин Ломефлоксацин Додецил-сульфат натрію 22 20 АПАР Тридецил-сульфат Тетрадецилнатрію сульфат натрію 110 115 36 30 Гексадецилсульфат натрію 72 27 7 40121 8 Таблиця 2 Результати визначення антибіотиків в стічній воді (n=5; Р=0,95) Антибіотик Введено Знайдено мг/мл 0,50 1,0 10,0 5,0 10,0 20,0 Ломефлоксацин Офлоксацин Комп’ютерна верстка А. Крулевський 0,50±0,004 1,02±0,08 10,2±0,6 5,1±0,4 9,6±0,7 20,1±1,2 Підписне Sr 0,07 0,06 0,05 0,06 0,06 0,05 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601