Живильне середовище для культивування збудника бешихи свиней

1. Живильне середовище для культивування збудника бешихи свиней, що містить як основу стандартне живильне середовище, таке як живильне середовище Фейса, бульйон Хоттінгера або бульйон Мартена, або інше живильне середовище, яке відрізняється тим, що в нього додатково введений водний колоїдний розчин наночастинок металів або наночастинок оксидів металів, або наночастинок гідроксидів металів, або їх суміш, U 2 (19) 1 3 Однозаміщений фосфатно-кислий калій КН2РО4) 0,3 Двозаміщений фосфатно-кислий натрій (Na2 HPO4) 1,8 Глюкоза 0,2 L-аргінін 0,05 Твін-80 0,05 Дистильована вода решта [Заявка Росссии №96116721. СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЖИВОЙ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РОЖИ СВИНЕЙ ИЗ ШТАММА ВР-2. МПК А61К 39/02, C12N 1/20. C12N1/04. Опубл. 1998.09.20.]. Недоліком цього середовища є низька мікробіологічна продуктивність. Відоме живильне середовище [Патент України №6054. СИНТЕТИЧНЕ ЖИВИЛЬНЕ СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ ЗБУДНИКА БЕШИХИ СВИНКИ. МПК А61К 39/00, C12N 1/20, C12N 1/04. Опубл. 15.04.2005.], яке використовують для культивування збудника бешихи. До його складу входять калій фосфорнокислий двозамінений, магній сірчанокислий семиводний, лимонна кислота, залізо лимоннокисле аміачне, гліцерин, вода дистильована, аспарагін, глюкоза, середовища Ігла MEM при слідуючому співвідношенні компонентів, мас. %: L - аспарагін - 0,4-0,5, калій фосфорнокислий двозамінений - 0,035-0,05, лимонна кислота 0,18-0,2, залізо лимонно-аміачне - 0,004-0,005, гліцерин - 2,5-3,0, глюкоза - 1,2-1,5, магній сірчанокислий семиводний - 0,04-0,05, Ігла - MEM - 20-50, вода дистильована - до 100. Недоліком цього середовища є низька чутливість і низька мікробіологічна продуктивність. Прототипом рішення, що заявляється, є живильне середовище Фейста та модифіковане середовище Фейса для культивування збудника бешихи свиней у складі: дріжджового екстракту (Difco) 5г, аргініну (Sigma) - 0,5г. олеїнової кислоти (Merck) - 0,5см3, заліза сульфату (Merck) - 0,2г. цинку сульфату (Merck) - 0,02г [див. Тарасов О.А. Культуральні, молекулярно-біологічні та антигенні властивості вакцинних штамів Erysipelothrix rhusiopathiae: Автореф. дис. канд. вет. наук. - К., 2008. 32 с.]. Недоліком цього середовища є низька чутливість і низька мікробіологічна продуктивність. В основу корисної моделі поставлена задача підвищення чутливості середовища, виходу життєздатних бактерій, прискорення їх росту і підвищення інтенсивності накопичення бактерійної маси. Запропоноване, як і відоме живильне середовище для культивування збудника бешихи свиней містить в якості основи стандартне живильне середовище, таке як живильне середовище Фейса, бульйон Хоттінгера, або бульйон Мартена, або інше живильне середовище і, відповідно до цієї пропозиції, в нього додатково введений водний колоїдний розчин наночастинок металів, або наночастинок оксидів металів або наночастинок гідроксидів металів або їх суміш, при цьому метали вибрані з групи, що включає мідь, магній, цинк, кобальт. При цьому середовище містить наступні компоненти, г: стандартне живильне середовище 1000; водний колоїдний розчин наночастинок металів, або наночастинок оксидів металів або нано 40201 4 частинок гідроксидів металів або їх суміш 30-200, а колоїдний розчин має концентрацію наночастинок. мг/л: наночастинки міді, її оксиду, гідроксиду 0,03-3 наночастинки магнію, його оксиду, гідроксиду 0,5-20 наночастинки цинку, його оксиду, гідроксиду 0,005-0,5 наночастинки кобальту, його оксиду, 0,00005гідроксиду 0,5 вода решта Запропоноване живильне середовище додатково містить водний колоїдний розчин наночастинок металів, або наночастинок оксидів металів або наночастинок гідроксидів металів або їх суміш, при цьому метали вибрані з групи, що включає мідь, магній, цинк, кобальт. Це збільшує чутливість середовища, вихід життєздатних бактерій, прискорює їх ріст і підвищує інтенсивність накопичення бактерійної маси. Встановлено, що наночастинки сприяють регенерації клітин, стимулюючи метаболічні процеси в біологічних об'єктах. Виявлена інтенсифікація регенераційної активності при загоєнні ран у тварин при застосуванні наночастинок металів [Застосування наночасток Ag, Cu, Zn у лікуванні ран/ В.Б. Борисевич, Б.В. Борисевич. О.Ф. Петренко та ін. // Здоров'я тварин і ліки. 2008. - №3. С. 14-15], тобто посилення здатності до розмноження клітин. Цитостимулювальна властивість є характерною особливістю певних металевих наночастинок, яка може бути використана і в бактеріології, зокрема у складі живильних середовищ, особливо у тих випадках, коли мікроорганізми ростуть або погано, або повільно. Наночастинки застосовують у вигляді водного колоїдного розчину. Це дозволяє отримати екологічно чисте нетоксичне живильне середовище. Водний колоїдний розчин наночастинок отримують диспергуванням металевих гранул імпульсами електричного струму у воді [див. патент Україні на корисну модель №23550. Спосіб ерозійновибухового диспергування металів. МПК B22F 9/14. Опубл. 25.05.2007. Бюл.№7]. Середовище містить наступні компоненти, г: стандартне живильне середовище 1000; водний колоїдний розчин наночастинок металів, або наночастинок оксидів металів або наночастинок гідроксидів металів або їх суміш 30-200. При вмісті водного колоїдного розчину наночастинок менше 30г на 1000г живильного середовища знижується біологічна активність живильного середовища і зменшується швидкість росту бактерій. Вміст водного колоїдного розчину наночастинок більше 200г на 1000г живильного середовища призводить до перевищення концентрації мікроелементів, що також зменшує швидкість росту бактерій. Колоїдний розчин має концентрацію наночастинок, мг/л: наночастинки міді, її оксиду, гідроксиду 0,03-3 наночастинки магнію, його оксиду, гідроксиду 0,5-20 5 40201 наночастинки цинку, його оксиду, гідроксиду 0,005-0,5 наночастинки кобальту, його оксиду, 0,00005гідроксиду 0,5 вода решта Компоненти колоїдного розчину взяті в оптимальних співвідношеннях. При вмісті компонентів менше нижніх меж знижується біологічна активність живильного середовища і зменшується швидкість росту бактерій. Вміст компонентів вище за верхні межі призводить до перевищення концентрації мікроелементів, що також зменшує швидкість росту бактерій. Приклад. У проведеному дослідженні були використані найбільш перспективні штами збудника бешихи свиней [див. Визначення оптимальної заражаючої дози збудника бешихи контрольного штаму, що викликає зараження свиней / В.Ф. Павлов, А.Ф. Ображей. М.Г. Остапець. О.А. Тарасов // Ветеринарна медицина України. 2000. - №8.- С. 26-27; Тарасов О.А., Ображей А.Ф., Сапейко В.П. Чутливість польових та музейних штамів збудника бешихи свиней до антибіотичних речовин // Ветеринарна біотехнологія. - 2004. - №5. - С. 26-27]. В контролі для культивування Erysipelothrix rhusiopathiae застосовували м'ясопептонний бульйон та агар Хотінгера (МПБХ та МПАХ). З метою порівняльної оцінки ефективності культивування вакцинних штамів бактерій бешихи використовували седовище Фейста (СФ) та його модифікова 6 ний варіант (СФМ) у складі: дріжджового екстракту (Difco) 5г, аргініну (Sigma) 0,5г, олеїнової кислоти (Merck) 0,5см3, заліза сульфату (Merck) 0,2г, цинку сульфату (Merck) 0,02г. До складу зазначених живильних середовищ додавали колоїдний розчин наночастинок Cu, Zn, Mg, Co, контролем слугували стандартні живильні середовища. Культивування бактерій бешихи свиней у рідких поживних середовищах проводили за температури 36,7±0,3°С протягом 18-24 години, на щільних - 48-72 години. Тинкторіальні властивості культур бактерій бешихи вивчали візуально, продивляючись пробірки у проходящому світлі. Морфологію колоній вивчали при 3-8-разовому збільшенні за допомогою лупи. Типовість бактерій на наявність дегенеративних форм визначали при мікроскопії мазків, пофарбованих за Грамом. Кількість бактерій бешихи в культуральних рідинах визначали методом послідовних розведень з подальшим висіванням на агар Хотінгера і виражали в колонієутворюючих одиницях (КУО). Основну увагу при порівняльному дослідженні продуктивності поживних середовищ приділяли накопиченню бактерійної маси (кількості біомаси на одиницю об'єму середовища), як основному виробничому біотехнологічному показнику. Результати дослідження представлені в таблиці. Таблиця Показники МПБХ (звичайний): - кількість клітин (1х109 в 1см3), - рН в культурі. МПБХ з наночастками металів: - кількість клітин (1x109 в 1см3), - рН в культурі. Сф (звичайний): - кількість клітин (1х109 в 1см3). - рН в культурі СФ з наночастками металів: - кількість клітин (1х109 в 1см3), - рН в культурі. СФМ (звичайний): - кількість клітин (1x109 в 1см3). - рН в культурі. СМФ з наночастками: - кількість клітин (1x109 в 1см3) - рН в культурі Штам М-2 Штам 145 Штам Т Штам Вр 4,73±0,03 5,51±0,04 5,05±0,05 5,17±0,03 6,78±0,03 5,37±0,05 6,63±0,07 6,43±0,08 12,65±0,06*** 6,65±0,05 13,07±0,65*** 6,67±0,08 14,12±0,09*** 6,67±0,06 14,15±0,09*** 6,65±0,03 5,75±0,04 5,80±0,05 5,95±0,08 5,85±0,09 6,09±0,12 6,07±0,09 6,63±0,15 6,11±0,09 12,27±0,45 6,71±0,06 12,75±0,07 6,73±0,06 13,33±0,14 6,65±0,06 15,05±0,14 6,71±0,09 9,57±0,09 6,57±0,06 9,77±0,12 6,59±0,11 9,88±0,11 6,65±0,13 10,17±0,17 6,71±0,15 15,05±0,75 6,74±0,07 16,73±0,13 6,75±0,09 18,97±0,17 6,78±0,12 22,05±0,17 6,79±0,12 Примітка: *** - Р