Наномодифіковане живильне середовище для культивування мікобактерій

1. Наномодифіковане живильне середовище для культивування мікобактерій, що містить як основу живильне середовище Сотона або живильне середовище Мордовського, або живильне середовище Школьникової, або інше живильне середовище, яке відрізняється тим, що додатково містить водний колоїдний розчин наночастинок металів або наночастинок оксидів металів, або наночастинок гідроксидів металів або їх суміш, при цьому метали вибрані з групи, що складається з магнію, міді, цинку, заліза. U 2 (19) 1 3 39824 Відоме живильне середовище Гельберга для вирощування мікобактерій туберкульозу при дослідженні біологічного матеріалу від тварин і посівів культур мікобактерій туберкульозу, що містить, (г/л): яєчну масу 400-500 (6 цілісних курячих яєць), жовтки яєць 90-100 (4 жовтки), молоко 140-160, картопляний відвар 140-160, малахітовий зелений 0,2-0,25 і сольовий розчин 140-160, що складається з калію фосфорнокислого двозаміщеного 0,140,16, натрію лимоннокислого 0,14-0,16, магнію сірчанокислого 0,14-0,16, пептону 0,8-1,0, гліцерину 3,2-4,0 і дистильованої води до 140-160мл [Патент России №2059728. Питательная среда для выделения из биоматериала животных и культивирования микобактерий туберкулеза. МПК C12Q1/04. Опубликовано: 10.05.1996]. Проте, при використанні цього і інших живильних середовищ, що застосовуються в бактеріологічній діагностиці туберкульозу тварин, ріст первинних культур мікобактерій туберкульозу дуже малий і повільний, і тому до появи їх колоній потрібні тривалі терміни інкубації: з посівів біоматеріалу 30-70 днів, при пересіваннях свіжовиділених культур 30-65 днів. Тому спостереження за посівами біоматеріалу проводять протягом 90 днів. Відоме живильне середовище Фіни [авт.св. 325879, кл. С12N1/20 від 1970р.] для вирощування мікобактерій туберкульозу, що прискорює ріст і підвищує висіюваність мікобактерій і містить: дієтичні яйця - 4-5 штук; магнезію сірчанокислу - 0,040,05г; натрій лимоннокислий - 0,10-0,12г; залізоаміачний галун - 0,004-0,005г; калій фосфорнокислий однозаміщений - 1,6-2,5г; амоній лимоннокислий однозаміщений 0,45-0,55г; натрій глутаминовокислий однозаміщений - 0,9-1,1г; гліцерин - 1,6-2,5мл; дистильовану воду - 100мл; 2%ный водний розчин малахітової зелені - 3,33-4мл. Проте, при використанні цього живильного середовища ріст первинних культур мікобактерій дуже повільний і з'являється при посіві біоматеріалу через 30-70 днів, а при посіві чистих культур через 21-50 днів. Відоме живильне середовище Фаст-3Л [патент РФ 2059728, кл. С12Q1/04 від 1993р.] для виділення з біоматеріалу тварин і культивування мікобактерій туберкульозу. Склад середовища, г/л: яйця курячі - 400,0-500,0; жовтки курячих яєць - 90,0100,0: молоко - 140-160,0; картопляний відвар 140,0-160,0; малахітовий зелений - 0,2-0,25; сольовий розчин: Калій фосфорнокислий двозаміщений 0,14-0,16 Натрій лимоннокислий 0,14-0,16 Магній сірчанокислий 0,14-0,16 Пептон 0,8-1,0 Гліцерин 3,2-4,0 Дистильована вода, мл до 140-160 Алкан 15,3-30,6. При посіві біоматеріалу від лабораторних тварин і великої рогатої худоби на це середовище первинний ріст з'являється на 17-19 діб, проте, це середовище вимагає великої кількості компонентів і швидко підсихає в термостаті. Найбільш близьким до пропонованого є живильне середовище Школьникової Р.А., що містить в 4 якості джерела азотистого живлення рідкий гідролізат казеїну або аспарагин, калій фосфорнокислий одно заміщений, натрій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, натрій лимоннокислий, лимонно-аміачне залізо (зелене), гліцерин [див. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М., "Медицина", 1973. стр.80]. Недоліком цього середовища є низька чутливість. В основу корисної моделі поставлена задача підвищення чутливості середовища, виходу життєздатних мікобактерій, прискорення їх росту і підвищення інтенсивності накопичення бактерійної маси. Запропоноване, як і відоме живильне середовище для культивування мікобактерій містить в якості основи живильне середовище Сотона, або живильне середовище Мордовського, або живильне середовище Школьникової або інше живильне середовище і. відповідно до цієї пропозиції, додатково містить водний колоїдний розчин наночастинок металів. або наночастинок оксидів металів або наночастинок гідроксидів металів або їх суміш, при цьому метали вибрані з групи, що складається з магнію, міді, цинку, заліза. При цьому компоненти узяті в наступному співвідношенні, г: живильне середовище Мордовського, або живильне середовище Сотона, або живильне середовище Школьникової або інше живильне середовище 1000; водний колоїдний розчин наночастинок металів, або наночастинок оксидів металів або наночастинок гідроксидів металів або їх суміш 50-150, а колоїдний розчин має концентрацію наночастинок, мг/л: наночастинки магнію, його оксиду, гідроксиду 0,5-20 наночастинки міді, її оксиду, гідроксиду 0,03-3 наночастинки заліза, його оксиду, гідроксиду 0,1-15 наночастинки цинку, його оксиду, гідроксиду 0,005-0,5 вода решта. Запропоноване живильне середовище додатково містить водний колоїдний розчин наночастинок металів, або наночастинок оксидів металів або наночастинок гідроксидів металів або їх суміш, при цьому метали вибрані з групи, що складається з магнію, міді, цинку, заліза. Це збільшує чутливість середовища, вихід життєздатних мікобактерій, прискорює їх ріст і підвищує інтенсивність накопичення бактерійної маси. Встановлено, що наночастинки сприяють регенерації тканин, стимулюючи метаболічні процеси в біологічних об'єктах. Виявлена інтенсифікація регенераційної активності при загоєнні ран у тварин при застосуванні наночастинок металів [Наночастки металів у лікуванні ран / В.Б. Борисевич, Б.В. Борисевич. О.Ф. Петренко та ін. // Збірник наукових праць міжнародної науково-практичної конференції "Сучасні проблеми ветеринарної медицини". - Кам'янець-подільський. - 2008. - С.100103]. тобто посилення здатності до розмноження клітин. Цитостимулювальна властивість є харак 5 39824 терною особливістю певних металевих наночастинок, яка може бути використана і в бактеріології, зокрема у складі живильних середовищ, особливо у тих випадках, коли мікроорганізми ростуть або погано, або повільно. Наночастинки застосовують у вигляді водного колоїдного розчину. Це дозволяє отримати екологічно чисте нетоксичне живильне середовище. Наночастинки металів набагато менш токсичні в порівнянні з іонною формою металів, отриманою з солей. Водний колоїдний розчин наночастинок отримують шляхом абляції електродів або металевих гранул у воді, наприклад, диспергуванням металевих гранул імпульсами електричного струму у воді [див. патент Україні на корисну модель №23550. Спосіб ерозійно-вибухового диспергування металів. МПК B22F9/14. Опубл.25.05.2007. Бюл. №7]. Компоненти взяті в наступному співвідношенні, г: базове живильне середовище 1000; водний колоїдний розчин наночастинок металів, або наночастинок оксидів металів або наночастинок гідроксидів металів або їх суміш 50-150. При вмісті водного колоїдного розчину наночастинок менше 50г знижується біологічна активність живильного середовища і зменшується швидкість росту мікобактерій. Вміст водного колоїдного розчину наночастинок більше 150г призводить до перевищення кількості мікроелементів, що також зменшує швидкість росту мікобактерій. Колоїдний розчин має таку концентрацію наночастинок, мг/л: наночастинки магнію, його оксиду, гідроксиду 0,5-20 6 наночастинки міді, її оксиду, гідроксиду 0,03-3 наночастинки заліза, його оксиду, гідроксиду 0,1-15 наночастинки цинку, його оксиду, гідроксиду 0,005-0,5 вода решта. Компоненти колоїдного розчину взяті в оптимальних співвідношеннях. При вмісті компонентів менше нижніх меж знижується біологічна активність живильного середовища і зменшується швидкість росту мікобактерій. Вміст компонентів вище за верхні межі призводить до перевищення кількості мікроелементів, що також зменшує швидкість росту мікобактерій. Приклад Висіви бактерій були проведені з використанням музейного штаму M.bo vis, а також збудників туберкульозу, виділених з патологічного матеріалу хворих на туберкульоз корів. Готували завісь М.bo vis штаму "Шахтар" - 1мг культури на 1мл ізотонічного розчину натрію хлориду з проведенням мікроскопії. Посіви проводили у контролі на живильне середовище Мордовського з рН 6.5 та середовище для культивування мікобактерій ДП "Ветеринарна медицина" м.Харків з рH 7.1, у досліді використовували ті ж самі середовища з уведенням до їх складу колоїдного розчину наночастинок Cu, Zn, Mg. Результати вивчення ростових властивостей мікобактерій на живильних середовищах представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Середовище Музейний штам М.bovis: а) середовище Мордовського б) середовище Мордовського з наночастинками Ag, Cu, Mg в) середовище "Ветеринарна медицина" (Харків) г) середовище "Ветеринарна медицина" (Харків) з наночастинками Ag, Cu, Zn Польовий ізолят М.bovis: а) середовище Мордовського б) середовище Мордовського з наночастинками Ag, Cu, Mg в) середовище "Ветеринарна медицина" (Харків) г) середовище "Ветеринарна медицина" (Харків) з наночастинками Ag, Cu, Zn Дні появи перших колоній Середня кількість колоній в 4-х пробірках на 10-й день від початку росту Морфологічні характеристики колоній 10 3,0±0,28 R,S-форма, опуклі, матові, вологі 7 7,25±0,42*** S-форма, опуклі, матові, вологі 10 4,0±0,29• R,S-форма, опуклі, матові, вологі 7 7,75±0,21*** S-форма, опуклі, матові, вологі 10 2,25±0,49 R,S-форма, опуклі, матові, вологі 7 6,5±0,28*** S-форма, опуклі, матові, вологі 10 2,0±0,27 R,S-форма, опуклі, матові, вологі 7 6,75±0,42 S-форма. опуклі, матові, вологі Примітка: *** Р