Спосіб детекції лістерій listeria monocytogenes, l. innocua, l. grayi, l. ivanovii, l. seeligeri, l.welshimeri

Спосіб детекції лістерій Listeria monocytogenes, L. innocua, L. grayi, L. i vanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, що передбачає детекцію ампліконів, попередньо одержаних за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, який відрізняється тим, що для полімеразної ланцюгової реакції використовують праймери, що складаються з таких послідовностей: List 1 5'-ТАС ТТА АТG ААА ААА GC A AGA TAG-3'. List 2 5'-ТТА ТАС GCG АСС GAA GCC АА-3'. (19) (21) 2000126876 (22) 01.12.2000 (24) 16.07.2001 (33) UA (46) 16.07.2001, Бюл. № 6, 2001 р. (72) Лиманський Олександр Петрович, Волянський Андрій Юрійович, Лиманська Ольга Юріївна (73) Харківський науково-дослідний інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечнікова, UA 40310 Ponelies N., Stein N. and Weber G. Microamplification of specific chromosome sequences; an improved method for genome analysis // Nucleic Acids Research. - 1997. - V. 25, № 17. - P. 35553557). Ступінь гомології праймерів є ключовим параметром, який визначає специфічність, ефективність та чутливість ПЛР-аналізу. Аналіз температур плавлення праймерів показує, що наявність одного неспареного нуклеотида у комплексі праймер-однонитковий продукт ПЛР веде до зниження температури відпалу Tan приблизно на 5˚С, двох неспарених нуклеотидів - приблизно на 10˚С і т. ін. З експериментальних досліджень плавлення нуклеїнових кислот відомо (Нарицин Д.Б., Любчинко Ю.Л. Плавление коротких фрагментов ДНК. Определение зависимости константы нуклеации спирального участка от ионной силы // Молекулярная биология. - 1988. - Т. 22, вып. 1. - С. 242-248), що ширина плавлення ΔТ коротких олігонуклеотидів довжиною двадцять-сорок нуклеотидів (якими є праймери для ПЛР-детекції) складає ~10°С. Це означає, що праймер буде відпалюватися на ампліконі, і продукт реакції буде синтезуватися за умови правильного вибору Tan за наявності не більше двох неспарених нуклеотидів у комплексі праймер-однонитковий амплікон. Існує метод детекції L. monocytogenes на основі ПЛР-аналізу гена амінопептидази (Winters D.K., Maloney Т.P., Johnson M.G. Rapid detection of Listeria monocytogenes by a PCR assay specific for an aminopeptidase // Mol. Cell. Probes. 1999. - V. 13, № 2. - P. 127-131). Створена тестсистема дозволяє детектувати у харчови х продуктах тільки Listeria monocytogenes. Існує також метод детекції Listeria та ідентифікації Listeria monocytogenes, який базується на ПЛР-аналізі снейсерної ділянки між генами 16S тa 23SpPHK (Rapid polymerase chain reaction/DNA probe membrane-based assay for the detection of Listeria and Listeria monocytogenes in food / L. O'Connor, J. Joy, M. Kane et al. // J. Food Prot. - 2000. V. 63, № 3. – P. 337-342). Метод дозволяє проводити детекцію лістерій та ідентифікацію L. monocytogenes. Чутливість аналізу - 10 клітин/25 ml зразків сирого та пастеризованого молока. Однак існує можливість помилково негативних результатів аналізу через наявність помилок у праймерів, тобто некомплементарних до ДНК-матриці нуклеотидів. Найбільш близьким є метод специфічної детекції Listeria ivanovii, який базується на виявленні фрагмента гена 16S РНК лістерій (A 16S rRNA-based DNA probe and PCR method specific for Listeria ivanovii / R.F. Wang, W.W. Cao, H.Wang, M.G. Johnson // FEMS Microbiol. I.ett. - 1993. - V. 80, № 1. P. 85-92). Метод дозволяє виявляти з культури L. ivanovii наявність як мінімум чотирьох клітин. Проте недоліком методу є недостатньо висока специфічність та ефективність через використання недосконалих праймерів, які мають неспівпадаючі нуклеотиди для деяких ізолятів гена 16S РНК лістерій, а також відсутність можливості детекції усіх видів Listeria. В основу винаходу, що пропонується, поставлено за мету створити спосіб детекції шести видів лістерій шляхом конструювання наборів праймерів для полімеразної ланцюгової реакції для забезпечення 100% специфічності при проведенні ПЛРаналізу. Створення тест-системи для ПЛР-детекції та генотипування лістерій передбачає пошук гіперваріабельних та високо консервативних фрагментів у геномі ізолятів лістерій. Для комп'ютерного аналізу з наявних у базах даних GenBank, EMBL, DDBJ секвенованих ізолятів фрагментів генів та повних генів лістерій була створена підбаза секвенсів гена іар. іар ген кодує протеїн р60, який є спільним для усі х видів лістерій, за винятком L. murrayi (секвенс іар гена цього штаму лістерій відсутній у базах даних). Повна довжина іар60 складає 1437-1575 пар нуклеотидів (п.н.) для різних штамів лістерій. Порівняння послідовностей ДНК іар гена показало наявність консервативних та варіабельних, тобто видоспецифічних фрагментів гена. На основі раніше розроблених авторами принципів створення тест-систем для ПЛР-детекції інфекційних агентів (Бусол В.А.- Лиманская О.Ю., Лиманский A.П., Цымбал В.И. Тест-система для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота полимеразной цепной реакцией // Ветеринария. - 1999. - № 6. С. 27-32; Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Безуглый Н.Д. Определение пола преимплантационных эмбрионов сельскохозяйственных животных с помощью полимеразной цепной реакции // Биотехнология. - 2000. - № 2. - С. 66-72) було створено набори праймерів для виявлення лістерій. Проведений комп'ютерний аналіз дозволив виявити ділянки зі 100% рівнем гомології, з яких були обрані праймери для ПЛР-детекції усіх видів лістерій. Сконструйований набір праймерів List1-List2 дозволяє виявляти 6 видів лістерій - L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. gra yi, L. seeligeri, L. welshimeri. Праймери List1 та List2 характеризуються 96 та 100% рівнем гомології, відповідно. Приклад 1. Варіабельний фрагмент гена іар ізолятів лістерій з баз даних EMBL і GenBank. 2 40310 1 2 3 4 5 6 7 8 LIIAPREL LGIAPA LIIAPB LMIAP.DNE LIIAPRB LSIAPREL LWIAPC LMIAPREL CACGGCGCTGGCTGGGGTAAATTCCTAGTTGGCTTCGGTCGCGTATAA------------TATGGAACTGGCTGGGGAAAATATCTAGTTGGCTTCGGTCGCGTATAA------------CACGGCTCTGGCTGGGGTAAATATCTAGTTGGCTTCGGTCGCGTATAA------------CACGGCTCTGGCTGGGGTAAATATCTAGTTGGCTTCGGTCGCGTATAATTAATAACTTAAA CFCGGTTCAGGATGGGGTCAATTCCTTGTTGGCTTCGGTCGCGTATAA------------CACGGCTCTGGATGGGGTCAATATCTAGTTGGCTTCGGTCGCGTATAA CACGGTTCAGGCTGGGGTAAATATCTAGTTGGCTTCGGTCGCGTATAA------------CATGGAAATGGTTGGGGACAATATCTAGTTGGCTTCGGTCGCGTATAA------------List2 3'-AACCGAAGCCAGCGCATATT-5' позиція 1390 гена іар ізоляту L.monocytogenes Lmiap Провали на чорних смугах демонструють, що для одного або декількох ізолятів у даній позиції є нуклеотиди, які не співпадають з нуклеотидами інших ізолятів. Liiaprel - Listeria (L.) innocua; Lgiapa - L. grayi; I.iiapb. L..miap - L. monocytogenes; 1 2 3 4 5 6 7 LMLISAPR.DNE LMLISA.DNE LMHLYA.DNE LM25443.DNE LM25446.DNE LM25449.DNE LM25452.DNE Liiaprb - L. ivanovii; Lsiaprel - L. seeligeri; Lwiapc, L. wiaprel - L. welshimeri. Приклад 2. Консервативний фрагмент гена іар ізолятів лістерій з баз даних ЕМВL і GenBank. CTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCAT---------CTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAG CTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAG CTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAG CNAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAG CTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAG CTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAG позиція 1390 ізоляту L.monocytogenes Термін "100% рівень гомології" означає, що для всіх відомих ізолятів (тобто для тих, які присутні у базах даних EMBL, GenBank, DDBJ) на момент проведення комп'ютерного аналізу ступінь гомології дорівнює 100%. В той же час є вірогідність, що існують варіанти Listeria, секвенс яких невідомий, або з часом буде секвеновано ізоляти гена іар Listeria, для яких ступінь гомології визначених нами фрагментів гена іар буде меншим, ніж 100%. Чорні смуги під послідовнос тями наочно вказують на ділянки іар гена лістерій зі 100% рівнем гомології. Ступінь гомології антисенсового (комплементарного "+"-ланцюгу ДНК) праймера List2 для виявлення усіх видів лістерій дорівнює 100%. Розроблений варіант ПЛР може бути використаний як стандартний метод для швидкого підтвердження 6 видів лістерій, виділених з різних джерел. 3 40310 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4