Штам патогенних leptospirae batavia для одержання діагностичної сироватки

Штам Leptospirae Batavia - Біляївка № 1960, задепонований у Депозитарії Державної установи "Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського" АМН України, м. Київ, за номером МПМ № 25-Д, для виробництва діагностичної сироватки. (19) (21) u200811718 (22) 01.10.2008 (24) 25.06.2009 (46) 25.06.2009, Бюл.№ 12, 2009 р. (72) САВЧЕНКО БОРИС ІВАНОВИЧ, МАЛИНІВСЬКА БРОНІСЛАВА ПЕТРІВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "УКРАЇНСЬКИЙ НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ПРОТИЧУМНИЙ ІНСТИТУТ ІМ. І.І.МЕЧНИКОВА" 3 41981 існує з моменту одержання незалежності України, тому що низка прийнятих законів Росії та в Україні зробила неможливим отримувати культури мікроорганізмів через кордон. Задача вирішується тим, що ізольовано штам Leptospirae bataviae, який має високу антигенну та імуногенну активність. Штам зберігається в колекції мікроорганізмів Українського науководослідного протичумного інституту ім.. I.I. Мечникова (УНДПЧІ), як штам Leptospirae Batavia - Біляївка №1960. Колекція мікроорганізмів (УНДПЧІ) ім. І.І. Мечникова м. Одеса згідно з наказом N403 України від 30 грудня 1992 року №183 являється філією музею патогенних мікроорганізмів (МПМ) Академії медичних наук України науководослідного інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України м. Київ. Свідоцтво про первинне депонування штаму мікроорганізму в Українському науково-дослідному протичумному інституті ім. I.I. Мечнікова МОЗ України. Реєстраційний номер наданий штаму Leptospirae Batavia - Біляївка №1960 МПМ №25-Д. Дата первинного депонування 12.06.2008р. Штам Leptospirae Batavia - Біляївка №1960 ізольовано із нирок миші малютки 12.11.1983 року, відловленої в плавнях дельти річок Дністер та Турунчук. Штам типовано діагностичною сироваткою Ставропільского інституту вакцин і сироваток, належить до серовару bataviae та характеризується наступними ознаками. Морфологічні ознаки При мікроскопії у темному полі при збільшені х300 разів являють собою сріблясто - білі палички - спіралі із крючками на кінцях, загнутими в протилежні сторони. Довжина лептоспір, що були виявлені в нирках гризуна 3-5мкм, діаметром 0,10,15мкм. Після вирощування в рідкому живильному середовищі довжина їх збільшилася до 5-10 мкм., діаметр залишився постійним 0,1-0,15мкм. Фізіологічні властивості Лептоспіри ростуть в рідких живильних середовищах типу Терських та водно-сироваточному середовищі з рН 7,2-7,4 з 3,0-3,5% кролячої сироватки, при температурі +28- +30°С добре рухомі з характерним обертанням навколо своєї осі. Максимальне накопичення 6x107 - 8x107 лептоспір в 1,0мл живильного середовища досягали на 8-10 день зрощування при +28-30°С. Лептоспіри добре 4 ростуть у напівтвердому живильному середовищі у 0,1% колоїдному агарі Діфко і доданням 3,0-3,5% кролячої сироватки. При проходженні лептоспірами колоїдних грудочок агару вони форму залежно від форми мікрощілин через котрі вони проходять. Після виходу із агару лептоспіри знову приймають свою характерну S-подібну форму з крючками на кінцях. Накопичення лептоспір у напівтвердому середовищі відбувається значно швидше на 4-5 день в надосадковій рідині напівтвердого середовища виявляли 5x108 -7x108 лептоспір. В колоїдних грудочках агару їх було значно більшим[3]. Антигенні властивості. Штам Leptospirae Batavia - Біляївка №1960 було ідентифіковано типовою імунною сироваткою виробництва Ставропільского науково-дослідного інституту вакцин та сироваток в реакції мікроаглютинації (РМА) в титрі 1:5120. Титри сироватки до діагностичного штаму були 1:50 тис. Антигенність штаму Leptospirae Batavia - Біляївка №1960, визначали в дослідженнях на білих щурах. Антигенність штаму Leptospirae Batavia Біляївка №1960, вищою в порівнянні з типовим штамом L.Bataviae, штам HS-26 < IМЕГ 1987 < Пуерто-Ріко, що включений до складу діагностичного набору лептоспір. Приклад 1 Семидобову культуру кожного штаму лептоспір (свіжоізольованного та прототипного) з максимальною кількістю лептоспір (5x107 -5x108 в 1,0мл) по 2,0мл вводили внутрішньочеревно пятиразово з інтервалом 3- 4 дні. На кожний антиген брали по 3 білих щура. На 3, 7 та 10 день після імунізації кров відбирали із хвоста на фільтрувальний папір розмірами 1см х 1см На 25 день після останнього введення лептоспір у щурів заморених ефіром (етером) відбирали кров із серця та в сироватках визначали в РМА рівень специфічних антитіл до гомологічних антигенів. Морфологічних змін паренхіматозних органів після введення лептоспір не було виявлено. Лептоспіри в корковому шарі нирок, в печінці та у крові не знаходили. Білі щурі були стійкими по відношенню до типового та свіжоізольованного штамів Leptospirae Batavia. Було встановлено, що антигенність штаму була вищою порівняно із прототипним штамом. Результати дослідження сироваток вакцинованих щурів наведені в Таблиця 1. Таблиця 1 Титри антитіл в сироватках щурів імунізованих ізольованим та прототипним антигенами. Найменування штамів L.Batavia - Біляївка 1960 L. Bataviae, HS26< ІМЕГ (М), 1987 < ПуертоРіко 3 Титри антитіл в сироватках щурів на день після вакцинації 7 10 25 1:40 1:80 1:320 1:10240 1:25 1:40 1:80 1:640 Таким чином, титри специфічних антитіл до свіжоізольованного штаму лептоспір Batavia були у 16,6 разів вищими в зіставленні до титрів антитіл прототипного штаму. Приклад 2 5 Досліджено в РМА 125 сироваток крові людей, що були професійно пов'язані з територією де було ізольовано штам Leptospirae Batavia- Біляївка №1960 (рибалки, мисливці). В реакції використо 41981 6 вували 2 штами: діагностичний прототипний штам L. Bataviae, HS-26 < ІМЕГ (М), 1987 < Пуерто-Ріко та ізольований штам Leptospirae Batavia- Біляївка1960. Результати наведено в Таблиці 2. Таблиця 2 Результати дослідження сироваток людей прототипним та ізольованим штамами Leptospirae Batavia. Найменування штамів Кількість досліджених сироваток L.Batavia - Біляївка1960 125 L.Bataviae, HS-26< ІМЕГ (М), 1987 < Пуе125 рто-Ріко Таким чином, паралельне дослідження сироваток людей, дозволило при проведенні РМА з прототипним штамом виявити наявність антитіл в діагностичних титрах тільки у 3 сироватках, а до штаму Leptospirae Batavia - Біляївка1960 виявлено 12 позитивних сироваток тобто у 4 рази більше. В анамнезі людей з позитивними результатами було встановлено, що за 7-14 днів до обстеження вони хворіли на "грип?", жовтівниці не було. Наявність антитіл до штаму Leptospirae Batavia, що були встановлені в РМА свідчить, що вони були хворі на лептоспіроз в легкій формі. Таким чином штам Leptospirae Batavia – Білявка 1960 має значні переваги при використанні його в якості діагностичного. Імуногенні властивості. Імуногенність штамів лептоспір вивчали методом пасивного захисту на золотавих хом'яках масою 25-30гр. Імунні сироватки одержані від білих щурів до кожного штаму в титрі 1:640 вводили внутрішньочеревно золотавим хом'якам в дозах 0,05; 0,1; 0,5; 1,0мл. На кожну дозу брали по 3 хом'яка. Через 3 години після введення імунних сироваток хом'яків також заражали внутрішньочеревно культурою штаму Leptospirae Batavia - Біляївка №1960 в дозі 250LD50. Вірулентність контролювали та визначали LD50 внутрішньочеревним зараженням штаму Leptospirae Batavia - Біляївка №1960. У прототипного штаму Leptospirae Batavia вірулентність не визначали тому, що цей штам внаслідок довгострокового вирощування на живильних середовищах втратив цю властивість. Було перевірено нами при зараженні морських свинок та хом'яків. В порівняльному аналізі протективної активності імунних сироваток було встановлено, що доза 0,1мл сироватки до штаму Leptospirae Batavia Біляївка №1960 захищала всіх інфікованих хом'яків гомологічним штамом лептоспір на відміну від імунної сироватки до прототипного музейного штаму Batavia, котра тільки в дозі 0,5-1,0мл проявляла свою захисну дію. Таким чином, імуногенність штаму Leptospirae Batavia - Біляївка №1960 була в 5-10 разів вища в зіставленні з музейним, протогипним штамом Batavia , HS-26 < ІМЕГ (М), 1987 < Пуерто-Ріко. Вірулентність Вірулентність Leptospirae Batavia - Біляївка №1960 вивчали на морських свинках. Внутрішньочеревно трьом морським свинкам вводили по 5,0мл лептоспір, вирощених у рідкому живильному середовищі. Морські свинки гинули на 5-7 день з Позитивні результати 12 3 характерною клінікою лептоспірозу, зниження температури тіла, пропасниця, жовтуха слизових оболонок. При розтині виявлено серозну рідину в черевній порожнині, жовтий колір внутрішніх органів, точкові крововиливи на серозних оболонках, значно збільшені печінка та селезінка з масивним кровонаповненням. На передній поверхні серця крововилив. У легенях крововилив. Нирки зморщені, знекровлені. Методом темнопільної мікроскопії у мазках відбитках зрізів коркового шару нирок виявляли 2-3 добре рухливих лептоспіри у полі зору мікроскопу. При посіві крові та шматочків коркового шару нирок у напівтверде живильне середовище з 3,0-3,5% кролячої сироватки на 3-5 день після посіву виявляли активно рухливі лептоспіри 100-150 у полі зору темнопільного мікроскопу. Титри антитіл РМА у сироватці крові до гомологічного штаму були 1:50-1:100. При заражені морських свинок музейним прототипним штамом Batavia із діагностичного набору лептоспір клінічної картини лептоспірозу не виявлено. Лептоспіри у корковому шарі нирок не виявляли. Посіви шматочків коркового шару нирок та крові у напівтверде середовище росту лептоспір не давали. Антитіла не виявляли. Таким чином музейний штам Leptospirae batavia був авірулентним. Подібні результати до свіжоізольованного та прототипного штамів отримали при заражені золотавих хом'яків. Білі щурі були стійкі до лептоспір. Одержання діагностичної моновалентної сироватки для серотипування Leptospirae batavia в РМА. Для одержання діагностичної лептоспірозної сироватки в РМА використали Leptospirae Batavia Біляївка №1960 вирощених на середовищі Терських з 3,0-3,5% кролячої сироватки у 8-10мл середовища у пробірках, впродовж 8-10 діб. Пробірки переглядали візуально у промені освітлювача ОІ19, та у темному полі мікроскопу при збільшені у 150 разів.(об'єктив х10, окуляри х10, бінокулярна насадка x1,5). Чисті без сторонньої мікрофлори добре рухомі з характерним сріблястим відливом та S-подібною морфологією без наявності аутоаглютинації лептоспіри переносили у свіже живильне середовище Терських в ємностях 0,5 літра. Через 7-10 діб вирощування при +28- +30°С перевіряли кількість вирослих лептоспір та їх морфологію. Наявність лептоспір в концентрації 7x107 з доброю якістю переносили в стерильні центрифужні стакани з кришками, центрифугували 10-15 хвилин при 6000 об/хв. Надосадкову рідину вида 7 41981 ляли у дезинфекційний розчин. До осаду добавляли 10-15мл забуференного фізіологічного розчину з рН7,2-7,4 добре струшували та знову центрифугували при 6000об/хв. - 15 хвилин, видаляли надосадкову рідину. До осаду добавляли 3,0-5,0мл забуференного фізіологічного розчину, осад добре розміщували та переносили у пробірку. Такі маніпуляції повторювали два рази. Фізіологічним розчином концентрацію лептоспір доводили до 7x107 108 в 1мл. розливали в 5,0мл ампули, перевіряли на стерильність, запаювали та використовували для введення кролям у вену вуха. Введення антигену повторювали через 5-7 діб 3-5 разів. Кожного разу перед введенням антигену в сироватці крові перевіряли рівень антитіл. При наявності антитіл в титрах 1:50 - 1:100тис. проводили тотальне кровопускання. Кров збирали в окремі ємності 100150мл. відстоювали для одержання згустків визна Комп’ютерна верстка А. Рябко 8 чали титри антитіл та переносили в ампули по 1,0мл. Отримані результати заносили до паспорту. Препарат імунна кроляча сироватка проти лептоспір Batavia в титрі 1:50 - 1:100тис. для постановки РМА при ідентифікації ізольованих штамів. Джерела інформації: 1. Патент на корисна модель №22917 U Штам бактерій Leptospira interogans yez bratislava серогрупа australis, серовар bratislava для виготовлення інактивованої вакцини проти лептоспірозу тварин та діагностикумів. 2. Приказ №1152 МЗ СССР от 13.11.1979г. "О профилактике заболеваний людей лептоспирозом" М.1979. С.58. 3.Патент на корисну модель №32121 від 12.05.2008 Савченко Б.І., Малинівська Б.П. Живильне середовище для збереження культур лептоспір. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601