Спосіб одержання гаплоїдів ячменю у культурі пиляків in vitro

Спосіб одержання гаплоїдів ячменю в культурі пиляків in vitro, який включає культивування пиляків на штучному живильному середовищі і отримання з них калусів, ембріоїдів та рослинрегенерантів, який відрізняється тим, що як гелеутворюючий компонент штучного живильного середовища використовують крохмаль природного мутанту кукур удзи ае з вмістом амілози 55-60 % в концентрації 65 г/л. (19) (21) u200803639 (22) 21.03.2008 (24) 26.08.2008 (46) 26.08.2008, Бюл.№ 16, 2008 р. (72) БІЛИНСЬКА ОЛЕНА ВОЛОДИ МИРІВНА, UA, ТИМЧУК СЕРГІЙ МИХАЙЛОВИЧ, UA, ДУЛЬНЄВ ПЕТРО ГЕОРГІЄВИЧ, UA, ДЕРЕБІЗОВА ОЛЬГА ЮРІЇВНА, U A (73) ІНСТИТУТ РОСЛИННИЦТВА ІМЕНІ В.Я. ЮР'ЄВА УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК, UA 3 го високоамілозного мутанту кукур удзи ае. За рахунок цього досягається зростання частоти регенерації рослин та зменшення витрат праці, коштів і часу на хімічну модифікацію крохмалю і відкриваються можливості для отримання екологічно чистого препарату, який утворює більш стабільний гель при зменшенні вдвічі порівняно з хімічно модифікованим крохмалем кількості гелеутворюючого компоненту. Суть корисної моделі полягає в тому, що на відміну від прототипу у запропонованій корисній моделі як гелеутворюючий компонент використовується кукурудзяний крохмаль природного походження з вмістом амілози 55-60%, виділений з зерна лінії-носія мутантного гену - ае. Важливою перевагою амілозного крохмалю ае над прототипом є стимулювання регенерації рослин на тлі відсутності негативного впливу на індукцію, ріст і розвиток новоутворень. Окрім цього, для отриман 34859 4 ня придатної для культивування експлантатів щільності гелю витрачається вдвічі менше крохмалю амілозного типу ае, ніж хімічно модифікованого крохмалю [5, 6]. Гель, утворений з крохмалю високоамілозного типу ае, зберігає структур у без висихання і розтріскування впродовж 30 діб, що є достатнім терміном для індукції новоутворень. Порівняльний аналіз запропонованого способу з прототипом свідчить, що в якості гелеутворюючого компоненту штучного живильного середовища замість хімічно модифікованого крохмалю використовується крохмаль природного мутанту кукурудзи ае з вмістом амілози 55-60% в концентрації 65г/л, який не зазнає хімічної модифікації. Порівняльні характеристики гелеутворюючи х властивостей живильних середовищ на основі агар-агару, хімічно модифікованого крохмалю та крохмалю високоамілозного мутанту к укур удзи ае наведено в Таблиці 1. Таблиця 1 Гелеутворюючі властивості штучних живильних середовищ на основі різних полісахаридів Характеристики гелю 1 Колір Прозорість Структура Стабільність Водоутримуюча здатність Варіанти живильних середовищ на основі крохмана основі хімічно Термін використання на основі агарлю природного модифікованого агару мутанту кукур удзи крохмалю ае 2 3 4 5 на момент утворення безбарвний молочно-білий молочно-білий гелю 15 діб безбарвний молочно-білий молочно-білий 30 діб безбарвний молочно-білий молочно-білий на момент утворення прозорий непрозорий непрозорий гелю 15 діб прозорий непрозорий непрозорий 30 діб прозорий непрозорий непрозорий на момент утворення еластична, пруж- еластична, пружна, еластична, пружгелю на, без шпарин без шпарин на, без шпарин 15 діб еластична, пруж- мало еластична, еластична, пружна, без шпарин непружна, з шпари- на, без шпарин нами на поверхні 30 діб еластична, пруж- мало еластична, еластична, пружна, без шпарин непружна, з шпари- на, без шпарин нами на поверхні та в товщі гелю на момент утворення висока висока висока гелю 15 діб висока висока висока 30 діб висока висока висока на момент утворення висока висока висока гелю 15 діб висока середня висока 30 діб висока середня висока За структурою, стабільністю та водоутримуючою здатністю гелі з крохмалю природного мутанту кукур удзи ае не поступаються гелям, що отримані з агар-агару і переважають гелі, які отримані з хімічно модифікованого крохмалю. Живильні середовища, які виготовлено згідно запропонованого способу, зберігають стабільну желеподібну структуру без виси хання та розтріскування протягом 30 діб з моменту ви готовлення, що є цілком достатнім терміном для індукції новоутворень в культурі пиляків in vitro. Для кращого розуміння опису корисної моделі наводяться конкретні приклади. Приклад 1. Приготування живильного середовища на основі крохмалю мутанту кукур удзи ае. Всі компоненти живильного середовища, окрім 5 34859 крохмалю, розчиняють в потрібних концентраціях в бідистильованій воді. Половину отриманого розчину переносять до окремої скляної колби або хімічного стакану і нагрівають до 50-60°С. До іншої половини розчину компонентів живильного середовища додають крохмаль з розрахунку 65г/л і ретельно перемішують до стану гомогенної суспензії. Суспензію тонкою цівкою переносять до нагрітого розчину компонентів живильного середовища і нагрівають суміш до температури кипіння при постійному перемішуванні. Отриманий клейстер негайно розливають по пробірках або колбах об'ємом 50-100см 3 і піддають стерилізації в автоклаві при температурі 120±2°С і тиску 78кПа протягом 20 хвилин. Стерилізований клейстер охолоджують до кімнатної температури і залишають для гелеутворення протягом 12 годин і далі використовують для отримання гаплоїдів ячменю. Приклад 2. Порівняльна оцінка морфогенетичного ефекту живильних середовищ з використанням різних гелеутворювачів у к ультурі пиляків in vitro ячменю. Для дослідження морфогенетичного ефекту гелеутворюючих речовин було використано лінію ДГ00-126, яка характеризується високою здатністю до андрогенезу in vitro. Рослини для отримання культури пиляків in vitro вирощували у польових умовах. Добирали колосся, яке містило пиляки з мікроспорами у середній та пізній фазі розвитку. Попередню обробку колосся проводили, вміщуючи пагони у воду і витримуючи їх впродовж 5-6 діб при температурі +4°С у холодильнику. Асептичн у культуру пиляків отримували за власною методикою [7]. Як контроль було використане розроблене нами для культивування пиляків ярого ячменю середовище NMSмод.2, яке містило макроелементи середовища N6 [8], мікроелементи середовища MS [9] і такі компоненти в мг/л: 2,4-Д - 2 (2,4-дихлорфеноксіоцтова кис 6 лота); БАЛ (бензиламінопурін) - 0,5; В1 - 1; В6 і РР по 0,5; гліцин - 2; аланін і пролін - 100; глутамін 200; лактальбумін - 300; міо-інозитол - 100; а також мальтозу - 90г/л; картопляний екстракт - 20%; крохмаль - 10г/л; агар-агар - 0,76%. В відповідних дослідних варіантах агар-агар було замінено на хімічно модифікований крохмаль Д-2 [5] у концентрації 120г/л і кукурудзяний крохмаль, отриманий з зерна природного мутанта ае у концентрації 65г/л. Чашки Петрі і пробірки з висадженими на штучне живильне середовище пиляками вміщували у термостат і інкубували при температурі 24°С впродовж 30-35 діб. Новоутворення - калюс і ембріоїди - пересаджували на регенераційне живильне середовище Р: мінеральна основа MS, вітаміни В1, В6 і РР - по 0,5мг/л; глутамін, міо-інозітол по - 100мг/л; сахароза - 30г/л; агар-агар - 0,8%. Регенерацію проводили при освітленні 4-5клк, фотоперіоді 16 годин, температурі 22-24°С. Спостереження проводили, починаючи з 20-ї доби культивування пиляків in vitro. При цьому підраховували пиляки, на поверхні яких утворилася принаймні одна макроструктура (калюс, ембріоїд), ембріоїди і рослини-регенеранти як на індукційному, так і на регенераційному середовищі. Ефективність експериментального андрогенезу in vitro оцінювали за такими показниками (у відсотках від загальної кількості культивованих пиляків): кількість пиляків з новоутвореннями; кількість зелених рослин-регенерантів; кількість ембріоїдів. Експериментальні дані оброблено за допомогою дисперсійного аналізу [10]. Результати дослідження впливу гелеутворюючих компонентів штучних живильних середовищ на процеси індукції новоутворень і регенерації рослин у культурі пиляків in vitro ячменю наведено у таблиці 2. Таблиця 2 Результативність культури пиляків in vitro у лінії ячменю ДГ00-126 з високою андрогенною здатністю в залежності від гелеутворюючого компоненту живильного середовища Варіанти живильних середовищ на основі агарагару на основі хімічно модифікованого крохмалю на основі крохмалю природного мутанту кукурудзи ае НІР05 Висаджено пиляків, шт. Отримано пиляків з новоутвореннями шт. % ембріоїдів зелених рослин шт. % шт. % 425 183 43,06 177 41,64 133 31,29 329 102 31,00 245 74,46 128 38,90 301 136 45,18 248 82,39 158 52,49 Ці оцінки свідчать, що за кількістю пиляків з новоутвореннями ефективність застосування живильних середовищ на основі крохмалю високоамілозного мутанту кукур удзи ае та агар-агару 7,20 6,60 7,14 дуже близька і перевищує е фективність використання середовищ на основі хімічно модифікованих крохмалів. Разом з тим, середовище, яке містило крохмаль високоамілозного мутанту кук урудзи ае, 7 34859 подібно до середовища з хімічно модифікованим крохмалем, сприяло індукції ембріоїдогенезу. Основною перевагою живильних середовищ на основі крохмалів мутанту кукур удзи ае є значне зростання частоти регенерації зелених рослин порівняно із середовищами на основі агар-агару та хімічно модифікованого крохмалю. Запропонований спосіб одержання гаплоїдів ячменю в культурі пиляків in vitro дозволяє підвищити частоту морфогенних новоутворень - ембріоїдів і ембріогенного калюсу, збільшити частоту регенерації рослин, подовжити термін використання штучного живильного середовища, поліпшити його структурно-механічні властивості, спростити процедуру виготовлення, знизити вартість та підвищити екологічну безпечність виробництва гелеутворювачів для культури тканин. Джерела інформації 1. Clapham P. Haploid Hordeum plants from anthers in vitro //Z. Pflanzenzücht. - 1973. - 69. - P.142155. 2. Hunter C.P. Plant regeneration method //Europian patent application. - 1987. №0245892. A2. - P.8. 3. Kohlenbach H.W., Wernike W. Investigation on the inhibitory effect of agar and the function of active carbon in anther culture //Ztsch. Pflanzenphysiol. 1978. - v. 86, N 5. - P.463-472. Комп’ютерна в ерстка Д. Шев ерун 8 4. Sorvari S. The effect of starch gelatinized nutrient media in barley anther culture //Annales Agr. Finnic - 1986. - v. 25. - P.127-133. 5. Деклараційний патент на винахід 52031, Україна, МПК 7, С08В31/02, A01N57/00, A01N59/00, А01С1/06. Спосіб отримання полімерних матеріалів /П.Г. Дульнєв, С.І. Кондратенко, Т.В. Чернишенко, В.П. Мірошниченко, Т.В. Івченко, С.А. Гончарова. - Опубл. 16.12.02, Бюл. №12. 6. Белинская Е.В., Дульнєв П.Г. Модифицированный крахмал ДКК мод. как компонент питательной среды для получения гаплоидов ячменя в культуре пыльников //Физиология и биохимия культурных растений. - 2007. - т. 39, №2. - С. С.136-143. 7. Білинська О.В. Генотипові особливості індукції гаплоїдів ячменю (Я. vulgare L.) методом культури пиляків in vitro: Автореф. дис. ... канд. біол. наук. - Харків: 1997. - 19с. 8. Chu C.-C. The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops //Plant Tissue Culture: Proc. Symp. - Peking: Science Press, 1978. P.43-45. 9. Murashige Т., Skoog F. A ri vised medium for growth and bioassays with tobacco tissue cultures //Physiol. Plant. - 1962. - v. 15. - P.473-497. 10. Плохинский H.A. Биометрия. - M.: Изд. Московского университета, 1964. - 367c. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601