Спосіб лабораторної діагностики холерних вібріонів ельтор

Спосіб лабораторної діагностики холери від людей та із об'єктів навколишнього середовища, що включає ізоляцію колоній на лужному агарі, 3 43157 4 повідності з методикою дослідження на холеру дей та із об'єктів навколишнього середовища, що поверхневої води водоймищ, водогінної води та включає ізоляцію колоній на лужному агарі та погосподарсько-побутової стічної води. На кожному становку реакції аглютинації та ідентифікацію хоетапі пророщену воду висівають на пластинку лулерних вібріонів, як за прототипом, але реакцію жного агару та інкубують 18-20 годин. Переглядааглютинації та ідентифікацію бактерій виконують ють вирослі колонії, відбирають підозрілі колонії та мікрооб'ємним методом, для чого частину ізольопроводять їх ідентифікацію біохімічними та серованої колонії вносять на предметне скло з нанеселогічними методами. ними заздалегідь краплинами фізіологічного розНедоліком методу, наведеного у настанові з чину та холерними діагностичними сироватками, лабораторної діагностики холери є значні витрати які розводять до робочого титру 1:800¸1:1600. Обчасу на етапі ідентифікації ізольованих вібріонів та лік результатів здійснюють методом фазовозначні грошові витрати, що призводять до втрати контрастної мікроскопії. Порівняльний аналіз ознак часу з прийняття рішень щодо проведення протипрототипу та способу, що заявляється наведено у епідемічних та профілактичних заходів, направлеТабл.1. них на локалізацію вогнища холери, ізоляцію та Спосіб реалізували наступним чином. Перелікування хворих. Це в свою чергу веде до зараглядали зрослі на пластинці лужного агару колонії ження великої кількості людей з погляду на висоза допомогою бінокулярної лупи та стереоскопічкий епідемічний потенціал холери. ного мікроскопу МБС-1. Зазначали та нумерували Тому задачею корисної моделі, що заявляєтьна склі чашки Петрі підозрілі за морфологією кося, є удосконалення способу, шляхом адаптування лонії, схожі на колонії холерних вібріонів, круглі з необхідних та достатніх для ідентифікації холеррівними краями з бузковим відтінком прозорі колоних вібріонів мікрооб'ємних діагностичних методів, нії діаметром 3-5 мм. На предметне скло наносили що забезпечать скорочення терміну ідентифікації одну краплю фізіологічного розчину та по одній холерних вібріонів ельтор, ізольованих в осередку краплі попередньо розведених до діагностичного холери від людей та із води. титру холерних сироваток (1:800-1:1600). Поставлена задача вирішується тим, що у способі лабораторної діагностики холери від люТаблиця 1 Відмінні ознаки способу, що заявляється, від прототипу Ознаки способу Посів на поліуглеводні середовища Забарвлення мікроорганізмів по Граму Постановка орієнтовної реакції аглютинації (РА) з холерними діагностичними сироватками Постановка розгорнутої РА Визначення морфології, рухливості та мікрооб'ємна РА з урахуванням у фазово-контрастній мікроскопії. Класичний метод Висівається кожна підозріла колонія на пробірку з полівуглеводним середовищем Проводиться Запропонований метод Не проводиться Проводиться з сироватками розведеними 1:50-1:100 Не проводиться Ставиться Не проводиться Не ставиться Проводиться з сироватками, розведеними до діагностичного титру 1:800-1:1600 . Краплі наносили на відстані 20 мм одна від одної, що дозволяє накривати краплі накривними скельцями без змішування сироваток. Частини підозрілої колонії послідовно вносили у краплю фізіологічного розчину та у краплі діагностичних сироваток, емульгуючи в них мікроорганізми. Переглядали препарат в такій послідовності: спочатку переглядали препарат з культурою у фізіологічному розчині, визначали морфологію мікроорганізмів, рухливість, потім переглядали краплю з холерною "О" сироваткою та послідовно з сироватками "Огава'", "Інаба". В препараті з "О" сироваткою спостерігали зменшення інтенсивності рухливості та утворення аглютинатів, вібріони склеювалися між собою, рухливість зникала, утворювалися острівки аглютинатів. Спостерігали повну аглютинацію вібріонів, рухливість повністю зникала. Таким чином, ізольовану культуру відно Не проводиться сили до холерного вібріону, що аглютинується холерною діагностичною "О" сироваткою в робочому титрі 1:800 - 1:1600. Наступним етапом переглядали препарати з діагностичними сироватками "Огава" та "Інаба", зазначали наявність аглютинації та іммобілізацію рухливості вібріонів однією із сироваток, ізольований вібріон відносили до відповідного серовару. Таку ідентифікацію проводили з кожною відібраною колонією. Зважаючи на той факт, що в аглютинації використовували діагностичні сироватки розведені до робочого титру від 1:800 до 1:1600, це повністю виключало неспецифічну аглютинацію. Таким чином, на основі наявності типової морфології колоній з характерними ознаками вібріонів, рухливості, морфології вібріонів, іммобілізації рухливості вібріонів холерною О сироваткою та однією із типових сироваток Огава або Інаба та при наявності позитивної реакції мік 5 43157 6 роаглютинації видавали остаточну позитивну відконтрастної мікроскопії мазків, приготовлених із повідь через 18 годин після початку дослідження колоній, вирощених на полівуглеводному середоматеріалу. Результати з ідентифікації вібріонів вищі Реселя при дослідженні води відкритих водонаведені в прикладах 1-3. ймищ. Методом фазово-контрастної мікроаглютиДослідження матеріалу з об'єктів довкілля. нації мікроорганізмів у фізіологічному розчині, а Етапи дослідження об'єктів довкілля відрізняються також у мікроаглютинації холерними сироватками від схеми дослідження матеріалу від хворих тільки О, Огава та Інаба виявляли значний поліморфізм на І етапі. Дослідження води ускладнюється тим, мікроорганізмів, що зростали на пластинці лужного що на пластинках лужного агару виростають значагару та на середовищі Реселя, виявляли різницю но більше морфологічно схожих колоній на колонії в рухливості при однакових показниках однотипохолерних вібріонів, що потребує проведення значвих для холерних та тих вібріонів, що не аглютино більшого об'єму роботи з ідентифікації мікроорнувалися діагностичними сироватками (так звані ганізмів. В даному разі метод мікроаглютинації з НАГ-вібріони). Результати, що підтверджують цінурахуванням результатів та морфології мікроорганість методу фазово-контрастної мікроскопії та нізмів являється незамінним. Необхідність провереакції мікроаглютинації при ідентифікації вібріонів дення такої роботи перевіряли методом фазовопредставлені в таблиці 2. Таблиця 2 Результати біохімічного визначення вібріонів, відібраних фазово-контрастною мікроскопією мікроорганізмів (ФКМ), що виросли на середовищі Реселя при дослідженні води відкритих водоймищ Виявлено вібріонів Кількість переглянутих Поставлено біоФКМ препаратів із середовища хім. рядів Реселя V.ch NAG 2716 (14.06-05.07.95р.) 13 636 409 3028 (27.07.95-0.08.95р.) 12 399 228 Всього 5744 25 1035 637 % позитивн. рез-тів 0,45 18,02 61,55 Результати, що наведені в Табл.2 свідчать, що метод визначення рухливості, іммобілізації та мікрооб'ємної аглютинації холерних вібріонів діагностичними холерними сироватками з титрами 1:8001:1600 з визначенням цих ознак при фазовоконтрастній мікроскопії дає можливість виявляти та типувати холерні вібріони безпосередньо із колоній, відібраних на середовище Реселя без подальшого визначення їх на диференційнодіагностичних середовищах. Приклад 1. На чашці Петрі з лужним агаром з використанням стереоскопічного мікроскопу МБС1 у косому світлі ОІ-19 зазначали круглі з рівними краями та з бузковим відтінком прозорі колонії діаметром 3-5 мм. Колонії на склі дінця чашки Петрі окреслювали та відзначали номерами, що важливо для проведення подальшої роботи з кожною колонією мікроорганізмів. На предметне скло наносили 1 краплю фізіологічного розчину та по 1 краплі сироваток "Огава", "Інаба". Частини зазначеної підозрілої колонії послідовно вносили у краплю фізіологічного розчину та у краплі діагностичних сироваток, змішуючи в них мікроорганізми. Після кожного внесення заразного матеріалу металеву петлю пропалювали у полум'ї спиртівки. Кожну краплю накривали накривним скельцем та переглядали у фазово-контрастному мікроскопі. Перегляд починали із краплі фізіологічного розчину. Визначали морфологію вібріонів - зігнуті палички, однорідність культури (її чистоту), з інтенсивною хаотичною рухливістю, більшість із них перелітали крізь поле зору мікроскопу. Відмічали характерну скупченість та рухливість мікроорганізмів біля краю скельця та навколо невеличких повітряних бульок під накривним скельцем, що свід Ідентифіковано V.ch. NAG Aero monas 13 12 25 3,14 318 197 515 80,85 78 24 102 16,01 чило про те, що вони є аеробними бактеріями. Наявність в препараті інтенсивно рухливих з характерною морфологією вібріонів, що аглютинувалися діагностичною холерною "О" сироваткою та однією із видоспецифічних сироваток "Огава", або "Інаба", дозволяло нам видавати відповідь про ізоляцію холерного вібріону відповідного серовару. При виявленні прямих, нерухомих паличок, або довгих нерухомих мікроорганізмів, а також добре рухомих мілких,прямих паличок, тобто мікроорганізмів, що морфологічно не були схожими на вібріони та не аглютинувалися холерними сироватками, видавали негативну відповідь. Коли виявляли типові вібріони з доброю рухливістю, але вони не аглютинувалися діагностичними холерними сироватками то такі вібріони вивчали щодо вуглеводів, визначали до якої групи по Хейбергу вони відносяться, вивчали їх щодо амінокислот (наявність лізину та орнітину декарбоксілази, відсутність аргіниндегідролази). Таким чином визначали НАГвібріони, що не аглютинувалися діагностичними сироватками. Для визначення типу холерних вібріонів за Хейбергом-Баруа обов'язковим є використання трьох вуглеводів: сахарози, маннози та арабінози. Для холерних вібріонів основною ознакою є ферментація сахарози та манози при відсутності ферментації арабінози (І група Хейберга). Серед холерних вібріонів, що не аглютинуються холерною ОІ сироваткою (НАГ-вібріони) також ізолюються вібріони, що відносяться до 1-ої групи Хейберга. Приклад 2. При ізоляції від хворого або від вібріононосія холерних вібріонів, що не аглютинувалися діагностичними сироватками, видавали відповідь про виділення холерних вібріонів, що не 7 43157 8 аглютинуються холерною О сироваткою ( так зваток О, Огава, Інаба та RO. У нашому випадку для них НАГ вібріонів) та проводили їх подальше біоцього необхідно було б витратити 1,0 л. діагностихімічне вивчення, визначали їх відношення до одчної сироватки для одного типу сироватки. В гронієї із груп по Хейбергу та їх відношення до шовому вимірі 10 мл такої сироватки, що виробвуглеводів, що давало можливість проводити диляють в Росії в НІІ "Мікроб" коштує 50 гривень. ференціацію з Vibrio aeromonas. Сума витрат на закупівлю лише трьох діагностичПриклад 3. При ізоляції від хворого культури них сироваток у необхідному об'ємі складає 15000 холерного вібріону, що аглютинується холерними гривень. Використовуючи метод мікроаглютинації діагностичними сироватками О, Огава, Інаба проз урахуванням результату у фазово контрастному водили допоміжне дослідження, що включало помікроскопі нами було витрачено по 10 мл кожної сів мікроорганізмів на пластинку лужного агару для сироватки, що коштувало 150 гривень, тобто виотримання окремих ізольованих колоній, а потім трати були зменшені в 100 разів. Крім того, еконовивчали кожну колонію в реакції мікроаглютинації мія витрат досягається тим, що роботу по ідентиз холерними діагностичними сироватками О, Огафікації та диференціації холерних культур у ва, Інаба та з сироваткою О139 із заліком резульбактеріологічній лабораторії виконували один літатів при фазово-контрастній мікроскопії. Завдяки кар-бактеріолог з одним лаборантом. Значна екозастосуванню заявленого методу було виявлено номія досягається також на диференційноодномоментну ізоляцію від хворої дитини двох діагностичних середовищах необхідність у викорикультур холерних вібріонів сероварів Інаба та Огастанні таких середовищ для діагностики холери ва в осередку холери, спричиненої сероваром Інаповністю відпадала. У 2,7 рази скорочується час ба, що дозволило уникнути діагностичної помилки. на ідентифікацію холерних вібріонів та видачу реЦе сприяло призначенню адекватного лікування зультатів аналізу, що є важливим в умовах епідетому, що виявлені серовари мали різну чутливість мії. до антибіотиків[4]. Джерела інформації. При виконанні досліджень на холеру матеріа1. Патент RU 2080373. Способ ускоренного лу від людей кожну ізольовану культуру необхідно определения вирулентности холерных вибрионов диференціювати як мінімум серед 5-10 колоній Эльтор, выделяемых во время вспышек холеры от холероподібних культур, що виросли на пластинлюдей. ках лужного агару. Нами в осередках холери в 2. Савченко Б.И. Использование специфичесОдеській, Миколаївській та Херсонській областях ких диагностических фагов при изучении штаммов було ізольовано більше 1000 культур холерного холерных вибрионов, выделенных на территории вібріону для цього необхідно було переглянути та Украины. Роботи співробітників Музею патогенних ідентифікувати близько 5000 колоній. Вважаючи для людини мікроорганізмів. Випуск 3. Київ - Тована те, що кожну колонію необхідно було б для ідериство -"ЗНАННЯ"-УКРАЇНИ 2000 С.96-99 нтифікації висіяти на 15 пробірок з диференціальЗ.Наказ №167 від 30.05.97 р. МОЗ України. ними середовищами та амінокислотами необхідно С.121 Про удосконалення протихолерних заходів в було б витратити 75000 пробірок. Україні. Для постановки орієнтованої та розгорнутої 4.Савченко Б.И.. Л.В.Третьякова. Случай одоб'ємноїреакції аглютинації за способомновременного выделения двух сероваров холерпрототипом необхідно було б витратити на кожну ных вибрионов эльтор у одного больного. Лаборакультуру по 1 мл діагностичних холерних сироваторная диагностика 2006 №2 (36) С.60. Комп’ютерна верстка В. Мацело Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601